COURS n 13 : Démarches diagnostiques des infections virales

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1 UE9 Agents Infectieux Dr. Charlotte CHARPENTIER Dr. Quentin LE HINGRAT Jeudi 1er Février H30-16H30 Ronéotypeur : Clélia COMTE Ronéoficheur : Hannah BURTIN COURS n 13 : Démarches diagnostiques des infections virales Ce cours est de type «inversé» c est-à-dire qu il a été présenté par des binômes d étudiants à l aide des diapositives mises à disposition sur Moodle. C est un cours interactif basé sur les échanges entre enseignants et étudiants. Le référentiel de Virologie et ce cours sont complémentaires. La ronéo sera relue par la prof, je vous ferai part des éventuels errata. Enfin, pour toutes questions, voici le mail du prof charlotte.charpentier@aphp.fr Page 1 sur 16

2 SOMMAIRE I. Prélèvement II. Les deux approches diagnostiques des infections virales A) Diagnostic DIRECT 1- Visualisation du virus par le prélèvement 2- Détection d antigènes viraux 3- Isolement du virus sur cultures cellulaires 4- Détection du génome viral B) Diagnostic INDIRECT 1- Serodiagnostic Page 2 sur 16

3 I. PRELEVEMENT Le prélèvement est une étape clé dans le processus diagnostic. La nature du prélèvement est adaptée au type de diagnostic utilisé. Il existe deux types de diagnostic (détaillés en partie II.) : -Le diagnostic direct : vise à mettre en évidence le virus directement. Cela suppose que le virus soit présent au moment du prélèvement. -Le diagnostic indirect : vise à mettre en évidence la réponse immunitaire. Le prélèvement est réalisé durant la phase post-infectieuse (voire très longtemps après l infection). /!\ Attention : la qualité des résultats dépend essentiellement de la qualité du prélèvement. Par conséquent, il faut bien veiller à respecter certaines conditions. Les échantillons cliniques doivent être : Appropriés à l examen demandé Importance de la localisation et du type de prélèvement. Prélevés à un moment adapté à la chronologie de l infection Conservés et acheminés rapidement au laboratoire Les conditions de conservation et de transport diffèrent selon le type de diagnostic direct ou indirect. Dans le cadre d une infection aiguë : Lorsqu il s agit d un diagnostic direct Les prélèvements doivent être réalisés le plus tôt possible après le début de l infection, c est-à-dire au moment de l apparition des symptômes physiques. Les prélèvements doivent être réalisés avant l initiation d un traitement antiviral Le site de prélèvement dépend des symptômes et du mode de transmission des virus suspectés (ex : écouvillon naso-pharyngé, lésion cutanée, prise de sang ) Lorsqu il s agit d un diagnostic indirect Penser à la fenêtre sérologique : délai entre le contage (contamination) et l apparition dans le plasma des premiers anticorps spécifiques. Il faut ensuite dans un second temps réaliser un second prélèvement à distance (15 jours environ) pour éliminer les faux négatifs. Pour les prélèvements sanguins il existe principalement deux types de tube: 1) Le tube sec : prélèvement de sérum 2) Le tube contenant un anticoagulant EDTA : prélèvement du plasma Le type de tube et le type de prélèvement sont adaptés à la technique utilisée. Technique Biologie moléculaire (charges virales, Sérologies virales PCR, séquençage ) Type de tube EDTA Sec Délai de transport jusqu au laboratoire < 24h < 96h /!\ Attention : ne jamais utiliser de tube hépariné pour la biologie moléculaire. En effet, l héparine est un inhibiteur de la Polymérase = enzyme d amplification de la PCR. Page 3 sur 16

4 Les autres types de prélèvements peuvent être des prélèvements de : - LCR (dans un tube sec et stérile) - Biopsies - Urines - Liquide amniotique - Salive (détection du CytoMégaloVirus CMV chez le nouveau-né) Lorsqu il d agit de prélèvements respiratoires (naso-pharyngé, lavage broncho-alvéolaire ), cutanés ou des muqueuses, on utilise un écouvillon pour prélever les cellules. Ensuite l écouvillon sera placé dans un tube contenant un milieu de transport, qui est également un milieu de culture, c est-à-dire un milieu nutritif dans lequel le virus conservera sa virulence pendant la période de transport jusqu au laboratoire. /!\ Attention : Il est important de recueillir un maximum de cellules dans le prélèvement. Pour rappel les virus sont des parasites intracellulaires stricts c est-à-dire qu ils ont besoin d infecter les cellules pour se multiplier et s activer. Ainsi, plus la densité cellulaire de notre prélèvement est forte plus on a de chance de mettre en évidence le virus => Importance dans le cadre du diagnostic direct. Dans la pratique, tous les prélèvements doivent être associés à des feuilles de demande contenant les informations suivantes : - Nom, prénom, date de naissance du patient - Date et heure du prélèvement - Nature et site du prélèvement - Nom du prescripteur - Nom du préleveur - Renseignements cliniques sur le motif de la demande et la chronologie précise des évènements c est essentiel pour le choix de la technique utilisée ainsi que pour l interprétation des résultats. (Une feuille de demande mal renseignée peut affecter le rendu des résultats). /!\ Attention : Il est important de communiquer l ensemble de ces informations pour traiter correctement l analyse. Le non-respect de ces conditions entraîne la non-conformité du prélèvement, ainsi l examen demandé ne sera pas réalisé. Page 4 sur 16

5 II. LES DEUX APPROCHES DIAGNOSTIQUES DES INFECTIONS VIRALES Diagnostic DIRECT Mise en évidence du virus ou ses composants c est-à-dire : les acides nucléiques (ADN, ARN), les antigènes, le virion (particule infectieuse du virus) Diagnostic INDIRECT - Détection des marqueurs immunologiques spécifiques produits par l organisme en réponse à l infection virale - Détection d anticorps (IgM, IgG) - Signe d un contact avec le virus A) Diagnostic DIRECT Il existe diverses méthodes de diagnostic direct. 1- Visualisation du virus par le prélèvement Cette méthode consiste à visualiser le virus contenu dans le prélèvement à l aide d un microscope électronique (la taille du virus est de l ordre du nanomètre tandis que la taille de la bactérie est de l ordre du micron). Elle n est plus réalisée en routine car : - La sensibilité est faible, en effet il faut une concentration en particules virales > 10 6 /ml, seuil que très rarement atteint dans les prélèvements standards. - Cette méthode donne beaucoup de faux négatifs du fait de sa faible sensibilité. - De plus l équipement est couteux, il doit être performant et cette technique nécessite l œil d un expert aguerri. 2- Détection d antigènes viraux /!\ Attention pour cette partie les informations des diapos ne sont pas valides il faut donc se rapporter aux informations du référentiel (p.45)!! Détection d antigènes intracellulaires - Immunofluorescence - Immunoperoxydase Détection d antigènes libres - Immuno-enzymatique (test ELISA) - Immunodiffusion (savonnette, bandelette) - Agglutination (test au latex) Détection d antigènes intracellulaires : Cette méthode consiste à rechercher du matériel viral antigénique dans le cytoplasme ou le noyau des cellules recueillies dans le prélèvement. C est ce que l on appelle l Immunocytodiagnostic. Pour se faire, il existe deux techniques : L Immunofluorescence : mise en évidence des antigènes viraux par l intermédiaire d anticorps antiviraux marqués par un fluorochrome directement ou à un second anticorps marqué par un fluorochrome (indirect). Page 5 sur 16

6 L Immunoperoxydase : c est la même méthode que pour l immunofluorescence à la seule différence que l anticorps n est pas marqué par un fluorochrome mais par une enzyme appelée peroxydase. La révélation se fait par activation enzymatique. Les applications les plus fréquentes pour ces techniques sont les recherches d antigènes des virus respiratoires dans les cellules issues des prélèvements naso-pharyngés ou les antigènes du CMV dans les polynucléaires. Détection d antigènes libres : Contrairement à la détection d antigènes intracellulaires, il s agit ici de mettre en évidence des antigènes viraux de façon indépendante de tout support cellulaire. Ces antigènes sont produits en excès et excrétés dans le sérum ou les produits pathologiques liquides. L Immunodiffusion (savonnette, bandelette) : c est une technique d immunochromatographie. La bandelette sur laquelle sont déposée des anticorps spécifiques d un virus est plongée dans le liquide prélevé qui migre par capillarité, au bout de quelques minutes si d autres bandes colorées apparaissent en plus de la bande contrôle alors le test est positif. Cette technique est principalement utilisée pour les virus Influenza (grippe) et VRS (Virus Respiratoire Syncitial) L Agglutination (test au latex) : des particules de latex sont enrobés d anticorps à leur surface, lorsque l on dépose quelques gouttes de liquide biologique, si l on observe une réaction d agglutination granuleuse alors le liquide biologique contient des antigènes et le test est donc positif. Page 6 sur 16

7 Ce test a pour seule indication en virologie clinique la recherche d antigènes des Rotavirus et Adénovirus dans un contexte clinique de diarrhée. L Immuno-enzymatique (test ELISA= Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) : une plaque est recouverte d anticorps de capture soit monclonal soit polyclonal, l échantillon prélevé contenant des antigènes est ajouté et se lie à l anticorps de capture, ensuite un second anticorps est ajouté c est un anticorps de détection qui va lui aussi se fixer à l antigène. L anticorps de détection va se lier avec un dernier anticorps couplé à une enzyme catalysant une réaction de fluorescence. Ce test est utilisé, par exemple, pour révéler la présence de l antigénémie HBs (Virus Hépatite B) ou de l antigénémie p24 (VIH). Néanmoins, toute positivité doit toujours être suivie d une neutralisation pour s assurer de la spécificité de l antigène détecté. La neutralisation consiste à rajouter des anticorps anti-p24 ou anti-hbs afin de créer des liaisons antigène/ anticorps avec les derniers antigènes libres. Il y a, ainsi, deux devenirs : - Soit il n y a plus de réaction après neutralisation on peut considérer que l identification antigénique est fiable - Soit il existe encore une réaction après neutralisation on doit pousser les investigations 3- Isolement du virus sur cultures cellulaires Il s agit de permettre la réplication virale au sein de cellules vivantes sur 3 types de modèles : 1) Animal entier (cobaye, souris, souriceau ) utilisé uniquement dans le cadre de la recherche 2) Œuf embryonné utilisé uniquement pour la fabrication de vaccin antigrippal 3) Les cultures cellulairesutilisé en clinique et en recherche, c est un support de choix dans l étude de la multiplication virale. Il existe 2 grandes limites aux cultures cellulaires : - Le temps (pose problème lorsque l on a besoin d un diagnostic rapide) - Tous les virus ne peuvent pas être cultivés comme le VHB, Papillomavirus Cette méthode est très peu utilisée en routine car elle est chronophage. Page 7 sur 16

8 La prof a demandé au binôme de passer cette diapo par manque de temps 4- Détection du génome viral Il s agit par cette méthode de détecter (présence/absence) et quantifier les acides nucléiques viraux. Le matériel génétique des virus est soit sous forme d ADN soit sous forme d ARN, dans ce cas une réaction de transcription inverse est nécessaire pour obtenir de l ADN après l extraction. Pour ce type d exploration les prélèvements sont : sang total (plasma, sérum, leucocytes ), urines, LCR, expectorations, écouvillonnages, ponctions, sperme, biopsies Cette technique se déroule en 2 étapes : 1 ère étape => EXTRACTION : Elle consiste à lyser les cellules et dénaturer les complexes nucléo-protéiques par l intermédiaire d un détergent. Ensuite, on sépare les protéines grâce à un solvant Enfin l ajout d alcool permet la précipitation des acides nucléiques Il y a deux méthodes d extraction : Page 8 sur 16

9 2 ème étape => AMPLIFICATION DE LA CIBLE : On utilise la méthode PCR = Polymerase Chain Reaction (que vous connaissez par cœur n est-ce pas? ; ) ) : Cette courbe sigmoïde se découpe en 3 phases. Au cours des cycles de réplication la fluorescence augmente. Ainsi, l intensité de la fluorescence est proportionnelle au nombre de copies d ADN amplifié. On peut utiliser une PCR quantitative ou qualitative. PCR QUALITATIVE : Elle permet de détecter la présence ou non du génome viral. On peut visualiser le produit de la PCR (phase de plateau) sur le gel d agarose. Page 9 sur 16

10 Petites précisions : la bande 7 est la bande témoin et on peut voir 2 bandes en 5 (celle du bas correspond aux amorces utilisées pour la PCR). Les différentes applications en virologie médicale de la PCR qualitative sont : - La recherche de virus dans le LCR Herpes Simplex Virus (HSV), Varicella Zoster Virus (VZV), Entérovirus - La recherche de virus dans les prélèvements respiratoires (LBA = Lavage Broncho-Alvéolaire, aspirations naso-pharyngées, ) Cytomégalovirus (CMV), Influenza virus, VRS - La recherche de virus dans les prélèvements de lésions cutanées HSV, VZV - La recherche de l ADN proviral du VIH dans les lymphocytes Diagnostic de l infection VIH chez les nouveau-nés La PCR qualitative «MULTIPLEX» : C est un type de PCR qualitative qui permet la recherche de plusieurs génomes dans la même réaction de PCR c est-à-dire qu il y a plusieurs couples d amorces dans le mélange réactionnel. Elle permet une approche syndromique par exemple la recherche des virus et bactéries fréquemment responsables. Elle est rapide mais couteuse (test unitaire 35 à 120 euros). Une de ses limites principales : elle n est pas adaptée pour suivre la décroissance de la charge virale après traitement antiviral puisque c est une PCR qualitative et non quantitative. PCR QUANTITATIVE : PCR en temps réel (phase exponentielle) On utilise 2 amorces et une sonde marquée toutes spécifiques du génome viral. Après fixation de la polymérase, débute l amplification du génome. Lorsque la polymérase arrive au niveau de la sonde fixée au génome viral elle la détache, ainsi la sonde une fois détachée émet un signal de fluorescence. A chaque cycle de réplication il y a une émission de fluorescence. Par conséquent, la fluorescence augmente proportionnellement à la charge virale (nombre de copies du virus/ml de sang). Page 10 sur 16

11 Connaître la quantité de génome viral permet de déterminer la charge virale. Les différentes applications en virologie médicale de la PCR quantitative sont : Connaître la charge virale pour - Suivi post-greffe, les patients immunodéprimés dans le cadre des infections à CMV, EBV - Poser le diagnostic dans un premier temps puis suivre l efficacité d un traitement dans le cadre des infections à VIH, VHB, VHC Autres techniques de biologie moléculaire : SEQUENCAGE du génome viral C est tout simplement un séquençage Sanger. Cette technique permet la détection des mutations conférents une résistance aux antiviraux (VIH, VHB, VHC, CMV, HSV). Les étapes sont les suivantes : 1/ Extraction des acides nucléiques comme vu plus haut 2/ Amplification des gènes viraux ciblés par les traitements (siège potentiel de mutations) par PCR 3/ Réaction de séquençage 4/ Lecture de la séquence nucléotidique 5/ Interprétation par des algorithmes Durée de l opération : 1 semaine. Page 11 sur 16

12 Voici les avantages et les inconvénients du diagnostic rapide par détection du génome viral à l aide des techniques de biologie moléculaire : Avantages : Inconvénients : Rapidité Fortes sensibilité et spécificité Applicable à l analyse de l ensemble des virus Impact de la variabilité génétique, concerne surtout les virus à ARN. L ARN étant beaucoup moins stable que l ADN le taux de mutations est plus important ainsi on peut observer une mauvaise hybridation des sondes et amorces avec le génome viral. La détection de séquences génétiques virales ne veut pas forcément dire que ces virus sont infectieux ou responsables d infection en cours. On ne peut identifier que le virus que l on recherche. B) Diagnostic INDIRECT 1- Serodiagnostic Ici on s intéresse essentiellement à la détection des anticorps spécifiques synthétisés par l hôte en réponse à une infection virale. Pour cela on prélève en général le sérum, plus rarement le LCR, humeur aqueuse, liquide articulaire Les modalités de conservation des sérums au laboratoire sont de 1 an (à -20 c) et 3 ans pour le diagnostic anténatal. Voici le profil sérologique après une infection virale aiguë : Lors de la primo-infection on observe la présence simultanée des IgG et IgM après le délai de la fenêtre sérologique. Lors d une ré-activation ou une ré-infection, on remarque la présence d IgG en Page 12 sur 16

13 grande quantité contrairement aux IgM qui sont soit absents soit présents mais en faible quantité et de façon transitoire. Le test utilisé pour détecter ces anticorps est le test ELISA, le principe est le même toutefois il y a quelques différences du fait qu il s agit d un test indirect de façon à mettre en évidence les anticorps et non plus les antigènes. Un test ELISA 4 ème génération permet un dépistage combiné avec une mise en évidence à la fois des anticorps et des antigènes. Ce test est utilisé pour le dépistage du VIH. Il s agit d un test à la frontière des approches diagnostiques directes et indirectes puisqu il permet de révéler à la fois les anticorps et les antigènes. L intérêt majeur est de réduire la durée de la fenêtre sérologique afin de déceler la primo-infection le plus tôt possible. Le p24 est un antigène marqueur de la primo-infection. Western Blot : est une autre technique de sérodiagnostic utilisée notamment dans la confirmation d une infection à VIH, c est une obligation légale pour la confirmation du diagnostic. Elle se base sur la détection des anticorps dirigés contre les différentes protéines du VIH en utilisant l immunochromatographie avec des antigènes spécifiques des protéines. Page 13 sur 16

14 TROD : Test Rapide à Orientation Diagnostique : Ce sont des tests qui ne nécessitent pas d équipement de laboratoire. Ils existent pour aider au diagnostic d urgence ou en situation de détresse matérielle (Accidents d exposition sanguine ou sexuelle). La réalisation de ces tests dure entre 10 et 20 minutes, la lecture du résultat est visuelle. Toutefois ils ne sont pas adaptés pour détecter des infections récentes (< 3 mois). De plus, une confirmation par le laboratoire via le test ELISA combiné (Ag+Ac) est obligatoire. Voici pour quelles indications faire un sérodiagnostic : Détection des anticorps Totaux = IgG et IgM sans distinction IgG ou IgM Expression des résultats Qualitatif : Absence/ Présence Quantitatif : taux d Ac Détermination du statut immunitaire d un individu vis-à-vis d un virus Dépistage avant une vaccination, bilan de greffe Examen d un seul sérum Résultat qualitatif Ex : VIH, VHC, VHB (Ag HBs), HTLV, CMV, EBV Page 14 sur 16

15 Présence d anticorps (évaluer la réponse immunitaire à une infection ou à une vaccination) Examen d un seul sérum Résultat quantitatif Ex : VHB (Ac anti-hbs), Rubéole Diagnostic d une infection récente ou en cours 2 situations : 1) Analyse de 2 sérums à jours d intervalle séroconversion (apparition des anticorps) élévation significative du titre des anticorps : x4 /!\ il faut veiller à ce que les résultats soient obtenus dans le même laboratoire avec la même technique pour pouvoir les comparer 2) Analyse d un seul échantillon En cas de présence d IgM sans IgG Si IgM et IgG sont positifs alors on mesure l index d avidité des anticorps IgG pour dater l infection L avidité : capacité d un anticorps à se fixer à un antigène, elle augmente avec l ancienneté de l infection : si infection > 3mois => avidité forte si infection < 3 mois => avidité faible connaître l avidité a un avantage pour contrôler les transmissions maternofœtales Comment interpréter les résultats d un sérodiagnostic : Absence d IgG Soit le prélèvement a été réalisé trop précocement il faut donc faire un second prélèvement Soit le patient est immunodéprimé il faut pratiquer un diagnostic direct par PCR Présence d IgM Soit il y a possibilité de faux négatifs : réponse inconstante, de courte durée ou retardée Soit il y a possibilité de faux positifs : - Par manque de spécificité des préparations antigéniques - Présence de facteur rhumatoïde dans la polyarthrite - Réactions antigéniques croisées entre virus de la même famille - Activations polyclonales non spécifiques (dues à des infections bactériennes ou palustres concomitantes) Page 15 sur 16

16 Dédicaces de la ronéoficheuse : A ma ronéotypeuse la vie à la fac ne serait pas la même sans toi (on choisit toujours bien nos cours ; P) A Ilhem et nos cco foireux ensemble depuis le début A Alice enfin ta dédicace!!!! A tous ceux qui se sont dévoués pour faire ce cours Merci vous étiez bons!! Dédicaces de la ronéotypeuse : A ma ronéoficheuse, on forme un duo de choc! Keur sur toi! A Clarisse et son «Rentre chez ta mère!!!» ça ne s oublie pas ;) A Alice love uuuuu <3 A vous!!! Page 16 sur 16