PERCIMAP. Oreochromis niloticus. Construction d une carte RH à haute densité du génome de Tilapia CNRS UMR 6061

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1 PERCIMAP Construction d une carte RH à haute densité du génome de Tilapia Oreochromis niloticus CIRAD UPR20 Aquaculture et gestion des ressources aquatiques, Montpellier H. D Cotta E. Pepey J.F. Baroiller CNRS UMR 6061 Institut de Génétique et développement, Université de Rennes M. Rokotomanga R. Guyon N. Sadequi Christophe Hitte Francis Galibert CNRS UMR 7138 Systématique, Evolution, Adaptation, MNHN C. Bonillo J.P. Coutanceau C. Ozouf-Costaz ANR 07-GANI-005

2 Le modèle Tilapia (Acanthomorphe, Cichlidé) Nom vernaculaire Tilapia: regroupe 3 genres: Oreochromis, Tilapia, Sarotherodon Exploités pour la pêche, l aquaculture et l aquariophilie Notre modèle, le tilapia du Nil, est une espèce majeure pour l aquaculture (2, t/an) Son élevage remonterait à l Egypte ancienne, dans le delta du Nil Produit massivement dans plus de 75 pays Au top 3 du poisson d élevage avec la carpe et le saumon Oreochromis niloticus Tilapias en Egypte, papyrus

3 Le modèle Tilapia Grande adaptabilité aux changements de température (12-43 C) Salinité (0-135 ppm) Oxygène (>0.3 mg/l) Régime à base de protéines végétales

4 Le modèle Tilapia Appartient à une des familles de vertébrés les plus diversifiées (grande plasticité phénotypique, écologique, comportementale; spéciaton très rapide) Hot spot de diversification dans les grands lacs Est-africains Modèle bien connu de «species flock» en milieu isolé

5 Pour toutes ces raisons Séquençage du génome complet d Oreochromis niloticus -décidé et subventionné par le NIH; actuellement en cours de réalisation par le Broad Institute à Boston, USA. - projets de construction de banques de BACs et de séquençage des extrémités de ces derniers subventionnés par l ANR.

6 Objectifs du projet PERCIMAP Construire un panel RH haute résolution du génome du Tilapia du Nil Réaliser une carte RH d au moins 800 marqueurs Densifier cette carte génétique avec plusieurs millieurs de marqueurs génétiques, en coll avec le Cichlid Genome Consortium* Faciliter l assemblage de la séquence globale (shotgun) Identifier les synténies avec d autres génomes de poissons (bar, daurade, et autres espèces phylogénétiquement proches de Tilapia) Faciliter l analyse du déterminisme du sexe et de la différenciation du sexe chez Tilapia, cruciale pour cette espèce et pour l aquaculture en général *International Cichlid Genome Consortium (

7 Préparation du panel de clones d hybrides Irradiation létale 3000 rads Fractionnement des chromosomes de O. niloticus irradiés Plusieurs centaines de clones hybrides indépendants cultivés séparément 5 FUSIONS indépendantes Cellules donneuses: rate de O. niloticus (souche séquencée par le Broad Inst.) Cellules receveuses CHO de hamster (HPRT-) Perte et rétention aléatoires de fragments de la cellule donneuse

8 Plusieurs centaines de clones indépendants cultivés séparément Constitution du panel RH pour construire la carte ADN de chaque lignée testé pour la présence de 96 marqueurs (microsatellites issus de la carte génétique). Sélection de 190 lignées présentant la meilleure rétention de marqueurs pour la constitution du panel RH. Extraction puis amplifications par PCR isotherme des lignées hybrides

9 Construction de la carte RH 5161 ESTs CIRAD (France) 3537 ESTs et m RNAs completes de GenBank ESTs from NIBB (Japon) = sequences permettant un choix d amorces pour la PCR Comparaison des banques d EST Identification des orthologues entre Tilapia et autres poissons modèles 1305 marqueurs géniques + 97 marqueurs d extrémités de clones BACs 134 microsatellites positionnés sur la carte génétique (Lee et al, 2005) 184 marqueurs SNP provenant d une étude de polymorphisme -amorces conçues pour chaque marqueur -typages dans les 190 lignées RH (Bead Array d Illumina) -construction des groupes de liaison (Logiciel Multimap v2.0) -ordonnancement des marqueurs dans les groupes ( Logiciel CarthaGène v1.0)

10 STICKLEBACK TETRAODON MEDAKA ZEBRAFISH NOM DES MARQUEURS Position RH Chr Localisation Chr Localisation Chr Localisation Chr Localisation

11 Ex: Comparaison de la carte RH Tilapia avec l épinoche Tilapia RH map(cr) Epinoche Identification de 2 segments conservés entre Tilapia et l épinoche Identification de remaniements dans ces segments

12 Validation par FISH positionnement et de l orientation des groupes de liaison dans les chromosomes 50 BACs dont les extrémités étaient positionnées sur les LGs de la carte RH ont été hybridés sur chromosomes de Tilapia, souche RH par 1, 2 ou 3 et en plusieurs combinaisons. image brute FITC image brute rhodamine

13 ancrage et orientation des BACs par rapport au centromère

14 Conclusions 50 groupes RH représentant 1162 marqueurs ont été positionnés sur les chromosomes La carte ainsi obtenue aidera à l orientation de la séquence complète Nous disposons maintenant d au moins 2 BACs chromosomespécifiques par paire, ce qui permet leur identification non équivoque Des gènes de la cascade du déterminisme du sexe déjà clonés par le CIRAD pourront être positionnés sur la carte RH Ce projet va contribuer de manière significative à l avance du projet ANR FISH SEX

15 Collaborations Dr. Thomas Kocher, Univ. of Maryland (en charge du projet de Whole genome sequencing project and leader of the CGC), partenaire associé non financé Dr. David Penman, Univ. de Stirling,, membre du CGC, qui a fourni la souche de Tilapia du Nil utilisée comme donneuse pour le panel RH (souche séquencée par le Broad Institute à Boston