STAGE DE FIN D ETUDES ISIFC 3 éme année Année universitaire

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1 STAGE DE FIN D ETUDES ISIFC 3 éme année Année universitaire Étude de l effet d un champ magnétique sur des cellules couplées aux nanoparticules magnétiques Hakima EL GAMAH Tuteur: Pr L Hocine YAHIA Référent: Pr Thérèse LEBLOIS Laboratoire d innovation et d Analyse de Bioperformances 2500, chemin de Polytechnique Montréal (Québec) H3T 1J4 Tel: (514) Fax: (514) Institut Supérieur d Ingénieurs de Franche-Comté 23, rue Alain Savary Besançon Tél: Fax:

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3 REMERCIEMENTS Je voudrais tout d abord exprimer ma profonde reconnaissance au Professeur L Hocine YAHIA, mon tuteur de stage, pour m avoir permis d intégrer son équipe et pour avoir dirigé et suivi mes travaux tout au long de ce stage. Je le remercie pour la confiance qu il m a accordée et pour m avoir laissé une grande autonomie de travail. Je souhaite remercier tous les membres du LIAB, pour leur gentillesse et leur accueil. Je pense particulièrement à Doris Antoinette MBEH, doctorante en biomédecine, qui m a permis de mener à bien ce projet. Je la remercie pour sa sympathie, ses idées constructives et le temps qu elle m a consacré. Je souhaite également exprimer mes remerciements sincères aux chercheurs Mahmood MOHAMMADI et Abderrazak MERZOUKI qui m ont autorisé à travailler dans leurs laboratoires, à savoir le laboratoire de microbiologie et le laboratoire de culture cellulaire. J adresse ma reconnaissance à l agent de recherche en biochimie, Benoit BESSETTE, et au thésard en biomedical, Nasr TABATABAEI, qui m ont permis l accès à certaines de leurs installations. Et enfin je remercie Madame Thérèse LEBLOIS, ma référente de stage, pour son suivi. Je garderais un très bon souvenir de ce stage où chaque personne m a accordé un peu de son temps et a bien voulu me transmettre une partie de son savoir. iii

4 SOMMAIRE REMERCIEMENTS... iii SOMMAIRE... iv ABREVIATIONS ET ACRONYMES... v TABLE DES ILLUSTRATIONS... vi INTRODUCTION... 1 I. STRUCTURE D ACCUEIL Ecole Polytechnique de Montréal Laboratoire d Innovation et d Analyse de Bioperformances... 2 II. CONTEXTE DE L ETUDE Lignée cellulaire A Nanoparticules Champ magnétique... 7 III. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX Extraction des magnétosomes Culture cellulaire A Tests de viabilité IV. RESULTATS ET DISCUSSION CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE... vi GLOSSAIRE... viii TABLE DES ANNEXES... ix RESUME... xiv ABSTRACT... xiv Les mots marqués d un astérisque (*) sont définis dans le glossaire. Les références sont notées entre crochets [ ]. iv

5 ABREVIATIONS ET ACRONYMES ATCC : American Type Culture Collection ATP : Adénosine triphosphate BMT : Bactéries magnétotactiques cf. : confer CHUM : Centre Hospitalier de l'université de Montréal CM : Champ magnétique CO 2 :: dioxyde de carbone DMSO : Diméthylsulfoxyde EDTA : Acide éthylène diamine tétraacétique EPM : École polytechnique de Montréal h : heure(s) HCl : Chlorure d hydrogène HEPES : Acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique ICM : Institut de Cardiologie de Montréal IRM : Imagerie par Résonnance Magnétique KPSI : Knots Per Square Inch LIAB : Laboratoire d'innovation et d'analyse de Bioperformance min : minutes ml : millilitres mt : militesla NaOH : Hydroxyde de sodium NPM : Nanoparticules Magnétiques rpm : rotation par minute PBS : Tampon phosphate salin SDS : Sodium dodecyl sulfate SP : Source Personnelle SVF : Sérum de Veau Fœtal µl : microlitres µg/ml : microgrammes par millilitre M : micromolaire o C : degrés Celsius v

6 TABLE DES ILLUSTRATIONS FIGURES Figure 1 : Blason de l EPM. [1]... 2 Figure 2 : Cellules A549 en croissance normale vues au microscope. [8]... 4 Figure 3 : Echelle du nanomètre. [SP]... 5 Figure 4 : Bactéries magnétotactiques attirées par un aimant. [9]... 5 Figure 5 : Bactérie magnétotactique vue au microscope électronique à transmission. [10]. 6 Figure 6 : Schéma du dispositif induisant un CM. [SP]... 7 Figure 7 : Solénoïde utilisé. [SP]... 8 Figure 8 : Représentation schématique du solénoïde utilisé, d'axe central z. [SP]... 9 Figure 9 : Culture bactérienne. [SP] Figure 10 : Cell Disruptor. [14] Figure 11 : Schéma du dispositif aimanté. [SP] Figure 12 : Hotte avec matériel nettoyé. [SP] Figure 13 : Flasque de 25 cm 2 contenant cellules et milieu de culture. [SP] Figure 14 : Microscope inverse. [SP] Figure 15 : Comptage cellulaire, d'un point de vue statistique. [SP] Figure 16 : Hématimètre de Neubauer. [SP] Figure 17 : Tubes avec ou sans NP. [SP] Figure 18 : Schéma du dispositif magnétique. [SP] Figure 19 : Flasques présentes dans l'incubateur pour le traitement de 24h. [SP] Figure 20 : Récapitulatif de toutes les expériences pour les tests de viabilité. [SP] Figure 21 : Schéma du dispositif magnétique pour vérifier l'évolution de la température.. 23 Figure 22 : Diagramme des tests sans NPM à 4.60 mt. [SP] Figure 23 : Diagramme des tests avec 10 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] Figure 24 : Diagramme des tests avec 100 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] Figure 25 : Diagramme des tests sans NPM à 8.74 mt. [SP] Figure 26 : Diagramme des tests avec 10 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] Figure 27 : Diagramme des tests avec 100 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] TABLEAUX Tableau 1 : Masses d'hepes et d'edta à peser. [SP] Tableau 2 : Composition du milieu de culture. [SP] Tableau 3 : Détermination du facteur multiplicatif. [SP] Tableau 4 : Dénombrement de tous les témoins. [SP] Tableau 5 : Dénombrement de tous les traitements imposés aux échantillons. [SP] Tableau 6 : Résultats des tests sans NPM à 4.60 mt. [SP] Tableau 7 : Résultats des tests avec 10 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] Tableau 8: Résultats des tests avec 100 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] Tableau 9 : Résultats tests sans NPM à 8.74 mt. [SP] Tableau 10 : Résultats des tests avec 10 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] Tableau 11 : Résultats des tests avec 100 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] Tableau 12 : Evolution de la température à 4.60 mt. [SP] Tableau 13 : Evolution de la température à 8.74 mt. [SP] vi

7 INTRODUCTION Dans l ensemble des pays industrialisés, on assiste à un essor considérable des nanosciences et des nanotechnologies. Utilisées dans tous les domaines depuis les années 90, les nanoparticules sont de plus en plus présentes dans notre quotidien (électronique, cosmétique...). Aujourd hui, les principaux champs d investigation concernent la recherche médicale et pharmaceutique. Les projets d utilisation de nanoparticules magnétiques dans le corps humain s accroissent et supposent que des cellules vivantes soient exposées, à la fois, à des ondes magnétiques et à des particules nanométriques. La maîtrise du magnétisme au cœur du vivant et des nanoparticules multifonctions permet d inventer de nouvelles solutions diagnostiques, thérapeutiques et réparatrices. Bien que cette nouvelle technologie promette des progrès remarquables dans le domaine médical, elle soulève aussi de nombreuses inquiétudes en particulier au sujet des éventuels effets sur la santé humaine. Actuellement, nos connaissances sur la toxicité des nanoparticules manufacturées activées à distance grâce à un champ magnétique externe demeurent assez limitées du fait du faible nombre d études toxicologiques, des résultats souvent contradictoires qu elles exposent et du manque de recul que l on a sur cette technologie naissante. C est pourquoi, il est indispensable d étudier, en parallèle avec les recherches fondamentales portant sur les propriétés et les applications des nanotechnologies, l impact éventuel de ces nouveaux objets. De ce fait, mon projet est consacré à l étude de l effet d un champ magnétique sur des cellules humaines, exposées ou non à des nanoparticules magnétiques manufacturées. La première partie de ce rapport a pour objet de décrire le matériel choisi pour cette étude. La technique d exposition des cellules humaines, avec ou sans nanoparticules, au champ magnétique sera présentée. Les tests de viabilité cellulaire mis en œuvre seront expliqués. Ainsi, les résultats obtenus seront présentés et une conclusion pourra en être tirée quant à la nocivité du champ. Une attention toute particulière sera portée sur le principe du comptage cellulaire. En parallèle, la méthode pour extraire des nanoparticules d origine bactériologique sera exposée. 1

8 I. STRUCTURE D ACCUEIL 1. Ecole Polytechnique de Montréal Figure 1 : Blason de l EPM. [1] L'École polytechnique de Montréal (EPM) est un établissement d'enseignement d ingénierie situé sur le campus de l Université de Montréal, sur la face nord du Mont Royal, et fondé en Sous la direction de Christophe GUY, l EPM dispense son enseignement dans plusieurs disciplines de l'ingénierie tel que l aérospatial, la mécanique ou encore le biomédical. De plus, cette structure réalise près du quart de la recherche universitaire dans ces domaines au Québec, plus de publications scientifiques et techniques publiées par des professeurs et des chercheurs de Polytechnique depuis 10 ans. Avec plus de diplômés depuis 1873, cet établissement totalise aujourd hui 242 professeurs et plus de 7100 étudiants. Son budget annuel de fonctionnement s élève à plus de 200 millions de dollars, dont un budget de recherche de 72 millions de dollars. [1] 2. Laboratoire d Innovation et d Analyse de Bioperformances Mon stage s est effectué au Laboratoire d'innovation et d'analyse de Bioperformances (LIAB) de l EPM, à l institut de génie biomédical/génie mécanique situé dans l aile A du pavillon principal. Les manipulations se sont déroulées principalement dans le pavillon Bombardier, inauguré en Depuis sa création, en juin 1999, le LIAB est dirigé par le Professeur L Hocine YAHIA et est composé de deux associés de recherche : le Docteur Edward SACHER ainsi que le Docteur Taraneh DJAVANBAKHT SAMANI. On y trouve également des post-doctorants, des étudiants en deuxième et troisième cycles et des stagiaires (cf. Annexe 1). Le LIAB est un laboratoire multifonctionnel qui rassemble des chercheurs de l EPM, de l'institut de cardiologie de Montréal (ICM) et du Centre Hospitalier de l'université de Montréal (CHUM). Les principales recherches effectuées au sein du LIAB portent sur la nanomédecine, les nanotechnologies, la médecine régénérative et la biocompatibilité des technologies médicales. 2

9 II. CONTEXTE DE L ETUDE Au sein de l environnement biologique, les nanoparticules magnétiques (NPM) peuvent répondre à des stimuli physiques externes, comme par exemple un champ magnétique. Ces nano-objets peuvent être injectés dans l organisme afin d interagir avec les constituants du vivant. C est ainsi qu'ils peuvent servir de traceurs pour l imagerie médicale en créant localement une inhomogénéité de champ, qui perturbe la dynamique magnétique des protons environnants et engendre un contraste sur l image. [2][3] Ils peuvent également être utilisés comme vecteurs pour transporter un médicament jusqu à sa cible. En effet, une cellule ou tout objet biologique contenant un nombre suffisant de NPM peut être manipulé par attraction magnétique. [4] Enfin, dans un champ magnétique dépendant du temps (à des fréquences de quelques centaines de khz), les NPM oscillent en échauffant leur environnement. L hyperthermie locale qui en résulte peut affecter des cellules malignes. [5][6] Ces multiples fonctionnalités des nanoparticules magnétiques vont de pair avec une innocuité biologique remarquable. En effet, les nanoparticules composées d oxyde de fer peuvent être à terme être assimilées par l organisme, grâce au métabolisme régulant la quantité du fer dans nos organes. [7] Cependant, il est nécessaire d effectuer des tests de viabilité cellulaire pour vérifier le couplage nanoparticules/champ magnétique. Les sousparties suivantes présentent les cellules humaines, les nanoparticules ainsi que le champ magnétique choisis pour cette étude. L étude de l impact biologique du champ magnétique et des nanoparticules manufacturées a été menée en condition in vitro. 1. Lignée cellulaire A549 Pour cette étude, la lignée cellulaire A549, communément utilisée par les laboratoires de recherche, a été choisie de part sa facilité à être cultiver. Cette lignée est issue d un adénocarcinome d épithélium pulmonaire prélevé chez un patient de type caucasien, âgé de 58 ans. Elle est distribuée par l American Type Culture Collection (ATCC), société privée américaine, dont la mission est axée sur l'acquisition, l'authentification, la production, la conservation, le développement et la distribution de micro-organismes, de lignées cellulaires et d'autres matériaux pour la recherche en sciences de la vie. [8] 3

10 Figure 2 : Cellules A549 en croissance normale vues au microscope. [8] Les cellules ont été conservées tel que recommandé par le fournisseur, c est-à-dire dans une solution contenant du sérum de veau fœtal (SVF) à une concentration finale de 10% et du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 5%, complété par un milieu de culture F-12K. Le DMSO est un solvant polaire organique utilisé comme agent cryoprotecteur. Il permet d'éviter une trop grande mortalité lors de la congélation. Le tube utilisé a un volume total de 1 ml et contient cellules. A l EPM, ce type de cellules est stocké à l azote liquide en phase vapeur dans la chaire de recherche du Canada en génie tissulaire du cartilage. C est donc dans ce laboratoire qu une partie de mes manipulations a eu lieu. Les cellules A549 seront soumises au champ magnétique (CM), en présence ou non de nanoparticules (NP). La prochaine partie va donc permettre de mieux comprendre la notion de nanoparticules et de présenter celles utilisées pour ce projet. 2. Nanoparticules Les NP sont des éléments ayant une taille nanométrique, entre 1 et 100 nanomètres. Cette petite taille leur permet d interagir facilement avec les composants biologiques. Elles sont composées de quelques centaines à quelques milliers d atomes. Du fait de leur taille, les propriétés physiques et chimiques de ces nano-objets* sont différentes de celles des matériaux classiques. Leur champ de développement est extrêmement vaste et inclut la 4

11 recherche médicale. On peut différencier deux grands types de nanoparticules, les NP naturelles, présentes dans l'environnement et les NP manufacturées, produites par l'homme dans un but industriel ou de recherche. Figure 3 : Echelle du nanomètre. [SP] NP naturelles Une partie de cette étude a consisté en l extraction de nanoparticules naturelles provenant de bactéries magnétotactiques (BMT). Ces bactéries sont des micro-organismes présents principalement dans les sédiments marins, enfouis à l'interface oxique/anoxique*. Les BMT peuvent se déplacer grâce au magnétotactisme, c'est-à-dire qu'elles se dirigent selon les lignes du champ magnétique terrestre pour atteindre des milieux favorables à leur croissance. Les BMT vont donc réagir sous l action d un aimant comme l atteste la figure suivante. Figure 4 : Bactéries magnétotactiques attirées par un aimant. [9] En microscopie électronique, elles sont facilement identifiables : leur cytoplasme contient des chaînes de granules d oxydes métalliques opaques aux électrons appelés magnétosomes. Généralement de taille uniforme, ces derniers sont alignés le long de l axe de la cellule. Ce sont ces organites qui sont à l'origine des propriétés magnétiques des BMT. 5

12 Figure 5 : Bactérie magnétotactique vue au microscope électronique à transmission. [10] Les magnétosomes sont constitués de cristaux entourés par une biomembrane lipidique. Ces cristaux sont formés de magnétite (Fe 3 O 4 ) et dans quelques cas, de greigite (Fe 3 S 4 ). [9] A l EPM, Monsieur MOHAMMADI, chercheur en microbiologie, travaille actuellement sur une bactérie magnétotactique appelée Magnetococcus espèce MC-1. Cette bactérie micro-aérophile*, d une taille comprise entre 30 et 80 nm, est composée de deux flagelles lui permettant de se déplacer. Cette espèce de BMT produit des nanoparticules de magnétite qui sont assemblées en chaine. C est donc cette bactérie qui a été utilisée pour l extraction des magnétosomes dont le protocole sera présenté par la suite. [11] NP manufacturées Les nanoparticules peuvent également être produites par toute une série de procédés chimiques, physiques ou biologiques. Les nouvelles nanoparticules sont principalement synthétisées en phase gazeuse, par déposition de vapeurs, par chimie des solutions et par broyage. [12] Avec la diversité des NP manufacturées existantes, notre étude s est restreinte aux nanoparticules magnétiques d oxyde de fer Fe 3 O 4 pour leur importance dans le développement actuel des applications biomédicales. De plus, ces NP sont approuvées par la F. D. A. grâce à leur qualité d agent de contraste pour l imagerie par résonnance magnétique (IRM). [13] Les NPM ont été fournies par Sophie LAURENT, chercheuse en chimie à l Université de MONS en Belgique. Elle a utilisé le procédé de chimie des solutions pour synthétiser les NPM. En effet, Madame LAURENT a mélangé 5 ml d'une solution aqueuse de FeCl 2.4H 2 O (0,045 M) et FeCl 3.6H 2 O (0,0375 M) ainsi que 250 ml de diéthylène-glycol. Le mélange a ensuite été chauffé à 170 C et maintenu à cette température pendant 15 min avant l'addition de la base NaOH solide jusqu'à une 6

13 concentration finale de 0,375 M. La température est maintenue à 170 C pendant 1 h puis refroidissement à 60 C est réalisé. Enfin les nanoparticules synthétisés ont été recueillies avec un aimant et ont été lavé avec 100 ml d'une solution HNO 3 (1 M). 3. Champ magnétique Un champ magnétique est caractérisé par des forces électriques liées à l'intensité d un courant. Il représente donc les forces qu'une charge en mouvement exerce sur d'autres charges également en mouvement et n'existe que lorsqu'il y a circulation de courant. Le dispositif induisant un CM provient du laboratoire de NanoRobotique du Pr. Sylvain Martel, à l École Polytechnique de Montréal. Il est composé d une machine à induction reliée à une station de chaleur ainsi qu à un solénoïde (cf. Annexe 2). [14] De plus, pour éviter que la machine à induction ne chauffe, celle-ci est associée à un système de refroidissement hydraulique externe. L étudiant doctorant en biomedical, Nasr TABATABAEI, m a permis d utiliser ce dispositif dont il se servait pour la réalisation de ses travaux de thèse. Figure 6 : Schéma du dispositif induisant un CM. [SP] 7

14 Caractéristiques du solénoïde Un solénoïde est un dispositif constitué d'un fil électrique enroulé régulièrement formant ainsi N spires parallèles. Parcouru par un courant, il produit un champ magnétique dans son voisinage, et plus particulièrement à l'intérieur de l'hélice où ce champ est quasiment uniforme. Le solénoïde étudié a une longueur L de 30 mm et un rayon R de 38 mm; et est formé de 3 spires N. Figure 7 : Solénoïde utilisé. [SP] Calcul du champ magnétique induit par le dispositif Le CM généré sur l axe central d un solénoïde dépend du courant I circulant dans le solénoïde et de la densité de spires n. De plus, le CM induit dépend de la distance entre le point P et le solénoïde et la taille du solénoïde le tout représenté à l aide de deux angle α 1 et α 2 (cf. Figure 8) : (1) Avec B : Champ magnétique sur l axe central au point P n : Nombre de spires par unité de longueur ( ) I : Courant électrique (A) α 1 : Angle pour positionner le côté 1 par rapport au point P α 2 : Angle pour positionner le côté 2 par rapport au point P µ 0 : Constante magnétique, µ 0 / [15] Dans notre cas, on considère que le point P est situé au centre du solénoïde, de sorte que :. 8

15 Figure 8 : Représentation schématique du solénoïde utilisé, d'axe central z. [SP] Sur la figure ci-dessus, on peut voir que l angle α 2 correspond à la soustraction de l angle plat de 180 et de l angle α 1. L équation (1) devient alors : D après les fonctions trigonométriques, on a : Le champ magnétique induit peut alors s exprimer comme ci-dessous : Avec 9

16 Selon les intensités choisies, la valeur du champ magnétique induite se calculera avec cette formule : III. PROTOCOLES EXPERIMENTAUX 1. Extraction des magnétosomes Les bactéries magnétotactiques ont été cultivées dans le laboratoire de Monsieur MOHAMMADI afin de pouvoir en extraire les magnétosomes. La méthode d extraction est expliquée ci-dessous. Culture bactérienne Les bactéries Magnetococcus MC-1 ont été cultivées dans un milieu de culture enrichi en fer sous des conditions de micro-aérobie. Le milieu a été effectué avec 50 M de sulfate ferreux heptahydraté pour permettre la formation des magnétosomes. [11] Figure 9 : Culture bactérienne. [SP] 10

17 Apres avoir isolé les BMT de leur milieu de culture, elles ont été introduites dans une solution tampon dont la préparation est expliquée ci-dessous. Préparation de la solution tampon La solution tampon a été préparé avec de l'hepes (ou acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1- pipérazine éthane sulfonique), dont la formule brute est C 8 H 18 N 2 O 4 S et de l EDTA (ou acide éthylène diamine tétra acétique), de formule C 10 H 16 N 2 O 8. Cette solution, à ph 7.4, doit avoir un volume total de 100mL et doit contenir 50mM HEPES et 4mM EDTA. Les masses de ces substances ont été calculées comme indiqué cidessous. Données : - M HEPES = 238,3 g.mol -1 - M EDTA = ou 372,2 g.mol -1 Formules utilisées : Avec n : quantité de matière en mol C : concentration molaire en mol.l -1 V : volume de la solution en L Avec n : quantité de matière en mol m : masse du composé en g M : masse molaire du composé en g.mol -1 HEPES n HEPES = * = mol m HEPES = * 238,3 = 1,192 g EDTA n EDTA = * 0,100 = 0, mol m EDTA = * = 116,9 mg Tableau 1 : Masses d'hepes et d'edta à peser. [SP] Pour obtenir la solution tampon voulue, il faut donc dissoudre g d HEPES et mg d EDTA dans 100 ml d eau puis ajuster le ph a 7.4 à l aide d un acide (HCl) ou d une base (NaOH). Une fois la solution tampon prête, il faut procéder à l extraction des magnétosomes. 11

18 Isolation des magnétosomes Les bactéries ont été extraites du milieu de culture par centrifugation (15000 rpm pendant 15 min à 4 o C). Après extraction de tout le milieu de culture, elles ont été pesées puis resuspendus dans la solution tampon avec un ratio de 1g de bactéries pour 10 ml de tampon. Elles ont ensuite été introduites dans un système conçu pour briser la paroi cellulaire : le Cell Disruptor. Ce dernier permet de libérer et récolter les composants intracellulaires grâce à l'utilisation d'une pression élevée. Trois passages au Cell Disruptor ont été effectués à une pression de KPSI (cf. Annexe 3). [16] Figure 10 : Cell Disruptor. [14] A l aide d un dispositif aimanté, les magnétosomes ont pu être isolés. En effet, ces NPM ont été attirées par l aimant et sont restées accolé à la paroi du tube. Le reste des constituants des BMT et la solution tampon ont été éliminés par aspiration. Figure 11 : Schéma du dispositif aimanté. [SP] Les magnétosomes ont été lavé trois fois avec 10mM HEPES. Ils ont été ensuite immergés dans une solution contenant 20% de SDS pendant 60min dans un agitateur, afin de détruire toutes les protéines potentiellement retrouvées à la surface des magnétosomes. La même méthode utilisant l aimant et l aspiration du milieu a été effectuée pour récupérer les 12

19 magnétosomes dépourvues de protéines. Pour la conservation, les magnétosomes ont été mis en suspension dans de l eau. [17] 2. Culture cellulaire A549 Conditions de la culture cellulaire - Stérilité La distinction entre un laboratoire classique et un laboratoire de culture cellulaire est le fait que dans la salle de culture, il faut maintenir un degré d asepsie afin d'éviter toute contamination par des micro-organismes (bactéries, champignons...). Ces contaminants sont introduits par plusieurs sources tel que l'opérateur ou les solutions utilisées, c'est pourquoi des règles de conduite strictes ont été établies. A l entrée du laboratoire, le port d un sarreau et de gants est obligatoire. La culture cellulaire impose l utilisation d une hotte à flux laminaire afin de travailler stérilement. A chaque utilisation de la hotte, il est nécessaire de la nettoyer avant et après les manipulations. Pour cela, il faut allumer la lampe UV de la hotte pendant 30 minutes et laver la paillasse à l isopropanol à 70 %. Après le nettoyage, le ventilateur et la lumière visible peuvent être allumés. Le matériel utilisé sous l enceinte stérile doit être nettoyé a l isopropanol également (béchers, pipettes, tubes ). Figure 12 : Hotte avec matériel nettoyé. [SP] 13

20 - Milieu de culture Les cellules ont été cultivées dans un milieu de culture constitué de F-12K, de 10 % de sérum de veau fœtal ainsi que de 0.5 % d antibiotiques (pénicilline et streptomycine) afin d éviter une éventuelle contamination bactérienne. L'importante variété de protéines contenues dans le SVF maintient les cellules en culture dans un milieu où elles peuvent survivre, grandir et se multiplier. Ceci fait de lui le sérum le plus utilisé en culture cellulaire. Pour un volume total de 500 ml de milieu de culture, les quantités des différents constituants sont indiquées sue le tableau suivant. Produit Quantité (en ml) Concentration final Milieu F-12K X Sérum de veau fœtal % Pénicilline et streptomycine % Tableau 2 : Composition du milieu de culture. [SP] - Matériels spécifiques Les cultures ont été conservées dans un incubateur à CO 2. Ainsi, la température, la quantité de dioxyde de carbone et l hygrométrie* ont pu être contrôlées. Le taux d'humidité requis est apporté par un bac d'humidification situé dans le bas de l'incubateur. Les cellules étaient alors à 37 C sous une atmosphère contrôlée à 5 % de CO 2 et 95 % d humidité. Des flasques de culture à bouchon filtrant de 25 cm 2 ont été utilisées pour la culture cellulaire. En théorie, le volume de milieu recommandé est de 0.2 ml/cm 2 de surface de culture pour les cellules adhérentes soit 5 ml pour le type de flasque utilisé. Figure 13 : Flasque de 25 cm 2 contenant cellules et milieu de culture. [SP] 14

21 La présence et l évolution des cellules dans les flasques ont été vérifiée à l aide d un microscope inversé. À l inverse de la configuration standard d'un microscope optique où la lumière arrive sur l échantillon par le bas et où l observation se fait par le dessus, pour le microscope inversé la source de lumière est placée au-dessus de l échantillon et les objectifs en dessous. Ainsi, les cellules présentes dans les flasques peuvent être visualisées. Figure 14 : Microscope inverse. [SP] Les différentes solutions (milieu de culture, PBS, trypsine ) ont été conservées au réfrigérateur à 4 C et chauffées au bain-marie à 37 C pour pouvoir être utilisées. Mise en culture des cellules Le tube de 1 ml contenant les cellules A549 congelées a été mis au bain-marie à 37 C. Après décongélation, les cellules sont reprises dans un volume de 9 ml de milieu nutritif pour être ensuite centrifugés à 1200 rpm pendant 5 min, à 4 C. Notons qu il ne faut pas oublier d équilibrer la centrifugeuse. Apres centrifugation, le surnageant a été vidé dans la poubelle de déchets biologiques car il contient le DMSO, toxique pour les cellules. Le tube a été gratté pour resuspendre le culot et 10 ml de milieu complet a été ajouté. Afin d obtenir les cellules en suspension, la solution a été homogénéisé. 15

22 Etant donné que le nombre de cellules de départ était très important, une partie des cellules a été congelés pour conserver la lignée et avoir à disposition un stock de cellules. Pour cela, cinq tubes de 1 ml ont été remplis à raison de cellules par tube complété avec du milieu de culture contenant 15% de DMSO. Ces tubes ont été placés au congélateur à - 80 C avant d être stocké à l azote liquide, 24h plus tard. Le reste de la suspension cellulaire a été rempli dans des flasques pour être incubé. Croissance des cellules - Changement du milieu de culture Les cellules consomment les nutriments du milieu et produisent des métabolites. Il faut donc renouveler le milieu de culture régulièrement, en général, tous les deux jours. Si ce dernier n est pas effectué, la nourriture se fait de plus en plus rare entrainant la mort des cellules. - Passage secondaire Par ailleurs, en condition in vitro, les cellules A549 prolifèrent dans des flasques sur lesquels elles adhèrent fortement aux parois grâce aux protéines d adhérence qu elles secrètent. Les cellules A549 en culture sont adhérentes et vont alors croître jusqu'à tapisser entièrement le fond de la flasque. Dès lors qu elles recouvrent 80% de la surface de culture (équivaut à 80% de confluence), il faut procéder au passage cellulaire. A 80% de confluence, les cellules ont donc été repiquées dans une nouvelle flasque avec du milieu de culture neuf. Pour ce faire, le milieu appauvri a été retiré par aspiration à l aide d une pipette pasteur. Les cellules ont été rincées avec du tampon phosphate salin (PBS) qui permet d enlever toute trace de milieu. Une solution de trypsine a ensuite été ajoutée pendant 2 min à l incubateur afin de décoller les cellules du fond de la flasque. Cette enzyme permet l hydrolyse des liaisons peptidiques responsables de l adhérence cellulaire. On appelle cette technique de décollement des cellules : la trypsination. La réaction enzymatique a été arrêtée par l'ajout du milieu complet. En effet, le SVF contenu dans le milieu inactive la trypsine. Après l'incubation, les échantillons sont agités vigoureusement au Vortex et centrifugés à 1200 rpm pendant 5 minutes, à 4 C. Le culot 16

23 de cellules a été resuspendu par grattage, après avoir vidé le surnageant, et homogénéisées dans 1.5 ml de milieu de culture. Dans un tube Eppendorf, un prélèvement de 100 µl de la suspension cellulaire et 20 µl de bleu de trypan ont été mélangés afin de procéder à la numération cellulaire, expliquée plus en détail ci-dessous. Grâce à cette technique, une dilution est ainsi effectuée pour qu il y ait un nombre moins important de cellules dans la flasque. En fonction du nombre de cellules voulues, il faut donc calculer le volume à prélever à partir de la concentration calculée. Comptage cellulaire On peut considérer que les cellules sont réparties de façon homogène dans un échantillon. D un point de vue statistique, le comptage cellulaire se base sur la numération d un prélèvement de cet échantillon, dans le but d estimer la taille globale de l échantillon. Figure 15 : Comptage cellulaire, d'un point de vue statistique. [SP] Le comptage cellulaire a été effectué à l aide du bleu de trypan. La coloration au bleu de trypan est une méthode de coloration des cellules mortes. En effet, ce réactif a tendance à entrer dans les cellules qu'il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question entraîne un mécanisme d exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l énergie, seules les cellules possédant une source d ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera incolore au microscope, au contraire une cellule morte n aura pas les moyens de la rejeter et deviendra bleue. Le comptage cellulaire au bleu de trypan permet ainsi de déterminer la viabilité d un échantillon. Cette méthode est peu coûteuse et rapide à mettre en place. Une fois que l eppendorf contenant les cellules et le bleu de trypan a bien été mélangé, 10 µl du mélange ont été ajouté dans le sillon de chargement d une chambre de l hématimètre de Neubauer, recouverte d une lamelle (Figure 16). 17

24 Figure 16 : Hématimètre de Neubauer. [SP] D abord, il faut compter le nombre de cellules vivantes présentent sur la première ligne d un des quadrillages de l hématimètre. Cette ligne correspond aux 4 carreaux en haut à gauche et aux 4 en bas à droite, comme indiqué sur la figure ci-dessus en bleu. En fonction du nombre de cellules que celle-ci contient, il faut se référer au tableau suivant. Ainsi, selon le nombre de lignes comptées, il faut déterminer le facteur multiplicatif. Si la 1 ère ligne contient Nombre de lignes à compter Facteur multiplicatif Plus de 40 cellules 1 8 Environ 20 cellules 2 4 Moins de 20 cellules 4 1 Tableau 3 : Détermination du facteur multiplicatif. [SP] Une fois le facteur multiplicatif déterminé, le nombre de cellule contenu dans l échantillon peut être calculé grâce à la formule ci-dessous : 18

25 Nombre de cellules vivantes dans l échantillon = 3000 * d * n * f * v Avec d : facteur de dilution n : nombre de cellules vivantes comptées f : facteur multiplicatif v : volume de l échantillon 3. Tests de viabilité Dans notre expérimentation, différents facteurs sont entrés en jeu. Certains sont restés constants tel que le milieu de culture des cellules alvéolaires, la taille des nanoparticules d oxyde de fer et la fréquence des ondes magnétiques; et d autres ont été modifiés comme la valeur du CM appliqué sur les cellules, elle-même conditionnée par l intensité du courant circulant dans le solénoïde, la durée de l exposition ou encore la concentration des NPM. Par la suite, des tests pour évaluer l évolution de la température en présence des NPM seront mises en œuvre. Le but étant de vérifier s il existe un lien entre la valeur du CM, la durée d exposition, la concentration de NPM et la toxicité sur les cellules A549. Tests de viabilité cellulaire Pour ces tests de viabilité, un protocole a été mis en place, faisant intervenir des témoins et des échantillons qui ont été exposés à un CM. Notons que les nanoparticules d oxyde de fer synthétiques ont une taille comprise entre 20 et 40 nm. Deux concentrations ont été utilisées pour ces tests : 10 et 100 μg/ml de NPM (cf. Figure 17). De plus, chaque contenant a été rempli à raison de cellules A549, complété par le milieu de culture et, en fonction du test, les NPM. Figure 17 : Tubes avec ou sans NP. [SP] 19

26 - Témoins Pour toute étude de cytotoxicité, il est nécessaire de garder un témoin. Dans notre cas, chaque expérience comporte deux témoins, un premier témoin T1 qui a été incubé et un second T2, qui a été transporté. En effet, les échantillons ont été exposés au CM dans un laboratoire situé à 15 min à pied du laboratoire de culture cellulaire. C est pourquoi il a fallu prendre en considération le déplacement des échantillons. Le témoin T2 va donc permettre de vérifier si les cellules ont été affectées par ce déplacement. Tous les témoins utilisés pour cette étude sont dénombrés sur le tableau ci-dessous. Témoins T1.1 T2.1 T1.2 T2.2 T1.3 T2.3 Sans NPM X X Avec NPM 10 µg/ml X X 100 µg/ml X X Incubé X X X Transporté X X X Tableau 4 : Dénombrement de tous les témoins. [SP] - Echantillons exposés au champ magnétique Quant aux différents traitements imposés aux échantillons, ils sont présentés ci-dessous. Les échantillons ont été exposés 30 et 60 min à deux valeurs de champ magnétique : 8.74 mt (valeur maximal du dispositif utilisé) et 4.60 mt., soit des intensités valant 190 A et 100 A. A savoir, le champ magnétique terrestre est de l'ordre de 50 µt. En revanche, la fréquence des ondes magnétiques est restée constante, à 157 KHz. Traitements A B C D E F G H I J K L Sans NPM X X X X Avec NPM 10 µg/ml X X X X 100 µg/ml X X X X Champ 4.60 mt X X X X X X magnétique 8.74 mt X X X X X X Durée 30 min X X X X X X 20

27 d exposition 60 min X X X X X X Tableau 5 : Dénombrement de tous les traitements imposés aux échantillons. [SP] Les tubes ont été insérés dans une mousse isolante en polystyrène et placés au centre du solénoïde comme le montre la figure suivante. Figure 18 : Schéma du dispositif magnétique. [SP] - Comptage cellulaire Le comptage cellulaire a été effectué une première fois, une heure après l exposition au CM. Vingt-quatre heures après les traitements, les cellules ont été repiquées de leur support (cf. Figure 19) par trypsination puis comptées à l aide de l hématimètre de Neubauer. Les témoins on été comptés en même temps que les échantillons soumis au CM. Figure 19 : Flasques présentes dans l'incubateur pour le traitement de 24h. [SP] 21

28 Figure 20 : Récapitulatif de toutes les expériences pour les tests de viabilité. [SP] 22

29 Tests d évolution de la température Comme mentionné précédemment, les NPM soumises à un CM peuvent osciller et échauffer l environnement dans lequel elles se trouvent. Or, si la température augmente audessus de 37 C, la croissance cellulaire ralentit, provoquant la mort cellulaire. En revanche, si la température diminue, la croissance cellulaire ralentit, mais les cellules restent viables. C est pourquoi il est très important de surveiller l évolution de la température dans les échantillons exposés au CM. Pour ce fait, la température a été vérifiée aux deux valeurs de CM utilisées pour les tests de viabilité avec : - le milieu de culture seul - la suspension cellulaire sans NPM - la suspension cellulaire avec 10 µg/ml de NPM - la suspension cellulaire avec 100 µg/ml de NPM Figure 21 : Schéma du dispositif magnétique pour vérifier l'évolution de la température. IV. RESULTATS ET DISCUSSION La première question à se poser quand on veut étudier les effets biologiques d une substance, est de savoir quels sont ses effets cytotoxiques, c est-à-dire, entre autres, ses effets sur la viabilité cellulaire. On entend par viabilité cellulaire la capacité d une cellule à vivre et la capacité à se reproduire. Ainsi, les effets cytotoxiques des nanoparticules d oxyde métallique couplées à un champ magnétique ont été évalués au moyen de tests 23

30 biologiques évaluant la viabilité cellulaire. Les résultats obtenus sont présentés puis discutés dans cette partie. Tests sans NPM à 4.60 mt Pour calculer le nombre de cellules dans un échantillon, la formule expliquée auparavant est utilisée : Nombre de cellules vivantes dans l échantillon = 3000 * d * n * f * v Pour accroitre la fiabilité des résultats, le comptage cellulaire a été renouvelé 3 fois. Une moyenne a donc été faite. Elle est indiquée en violet sur le tableau ci-dessous. Dans notre cas, 100 μl de suspension cellulaire et 20 μl de bleu trypan ont été mélangé. Le facteur de dilution est alors de 1.2. Par exemple, pour le témoin T1 après 1h de traitement, on a compté 4 cellules au premier comptage, 3 au deuxième et 4 au dernier. Etant donné que ces resultats ont été obtenus en comptant 4 lignes, le facteur multiplicatif f est alors égal à 1. De plus, le culot de cellules a été resuspendu dans 1.5 ml de milieu suite à la centrifugation. On a alors : Nombre de cellules dans l échantillon = 3000 * 1.2 * 4 * 1 * 1.5 = cellules vivantes Nombre de cellules dans l échantillon = 3000 * 1.2 * 3 * 1 * 1.5 = cellules vivantes Nombre de cellules dans l échantillon = 3000 * 1.2 * 3 * 1 * 1.5 = cellules vivantes Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes) Après 1h Après 24h Témoin incubé (T1) Témoin transporté (T2) Exposition 30min (E30) Exposition 60min (E60) Tableau 6 : Résultats des tests sans NPM à 4.60 mt. [SP] 24

31 Nombre de cellules vivantes Tests sans NPM à 4.60 mt h 24h T1 T2 E30 E60 Figure 22 : Diagramme des tests sans NPM à 4.60 mt. [SP] Une heure après le traitement, une augmentation des cellules est visible pour l échantillon exposé 60 min alors que celui exposé 30 min présente une réduction importante du nombre de cellules. Au vue du nombre de cellules après le comptage d une heure, on peut supposer qu une exposition brève à un champ magnétique de 4.60 mt a une influence négative sur les cellules alors qu une exposition plus prolongée semble bénéfique. De plus, il semblerait que le témoin T2 soit affecté par le déplacement parce que l on aperçoit une légère diminution du nombre de cellules 1h après le traitement (le nombre de cellules initial étant de 20000). Sur du long terme, les échantillons exposés montrent une diminution de la quantité de cellules vivantes contrairement aux cellules des témoins qui n ont pas cessé de proliférer. Tests avec 10 µg/ml NPM à 4.60 mt Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes) Après 1h Après 24h Témoin incubé (T1) Témoin transporté (T2) Exposition 30min (E30) Exposition 60min (E60) Tableau 7 : Résultats des tests avec 10 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] 25

32 Nombre de cellules vivantes Tests avec 10 µg/ml NPM à 4.60 mt h 24h T1 T2 E30 E60 Figure 23 : Diagramme des tests avec 10 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] Pour ces tests, les tubes exposés aux NPM et au CM ont été affectés 1 h après le traitement mais 24h plus tard cet effet n est plus présent et la quantité des cellules a augmentée comme pour les témoins. Néanmoins, suite au premier comptage cellulaire, l échantillon exposé plus longtemps est plus marqué par la diminution des cellules. Il semblerait donc que l ajout de 10µg/mL de nanoparticules magnétiques et la durée d exposition influent sur la nocivité du champ. Tests avec 100 µg/ml NPM à 4.60 mt Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes) Après 1h Après 24h Témoin incubé (T1) Témoin transporté (T2) Exposition 30min (E30) Exposition 60min (E60) Tableau 8: Résultats des tests avec 100 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] 26

33 Nombre de cellules vivantes Tests avec 100 µg/ml NPM à 4.60 mt h 24h T1 T1 E30 E60 Figure 24 : Diagramme des tests avec 100 µg/ml NPM à 4.60 mt. [SP] A une concentration de 100 µg/ml de NPM, des chutes très nettes sont observées pour les échantillons exposées au CM après 24h. Le fait d augmenter la concentration de nanoparticules présentes dans l échantillon semble augmenter la nocivité du CM sur du long terme. Par contre, le comptage cellulaire d une heure montre un petit accroissement des cellules pour l échantillon exposé 60 min. Les témoins quant à eux semblent ne pas être affectés énormément par la présence des nanoparticules magnétiques. Tests sans NPM à 8.74 mt Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes) Après 1h Après 24h Témoin incubé (T1) Témoin transporté (T2) Exposition 30min (E30) Exposition 60min (E60) Tableau 9 : Résultats tests sans NPM à 8.74 mt. [SP] 27

34 Nombre de cellules vivantes Tests sans NPM à 8.74 mt h 24h T1 T2 E30 E60 Figure 25 : Diagramme des tests sans NPM à 8.74 mt. [SP] Tout comme pour les traitements sans NP à un CM de 4.60 mt, une augmentation est visible une heure après le traitement mais cette fois-ci pour l échantillon exposé pendant 30 min et non 60 min. Après le comptage d une heure, on peut émettre l hypothèse qu une exposition brève à un champ magnétique de 8.74 mt a une influence positive sur les cellules alors qu une exposition plus prolongée semble nocive. Contrairement aux échantillons exposés au CM, les cellules présentent dans les témoins ont proliférés. Tests avec 10 µg/ml NPM à 8.74 mt Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes) Après 1h Après 24h Témoin incubé (T1) Témoin transporté (T2) Exposition 30min (E30) Exposition 60min (E60) Tableau 10 : Résultats des tests avec 10 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] 28

35 Nombre de cellules vivantes Tests avec 10 µg/ml NPM à 8.74 mt h 24h T1 T2 E30 E60 Figure 26 : Diagramme des tests avec 10 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] Comparés aux tests avec 10 µg/ml de NPM à 4.60 mt, les échantillons montrent une baisse importante du nombre de cellules vivantes que ce soit 1h ou 24h après le traitement, exceptes pour le témoin T1 qui voit sa quantité de cellules s amplifier 24h après l ajout de 10 µg/ml de NPM. Un champ magnétique de 8.74 mt en présence de 10 µg/ml de NPM accentue la toxicité sur les cellules. Tests avec 100 µg/ml NPM à 8.74 mt Comptage cellulaire (nombre de cellules vivantes) Après 1h Après 24h Témoin incubé (T1) Témoin transporté (T2) Exposition 30min (E30) Exposition 60min (E60) Tableau 11 : Résultats des tests avec 100 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] 29

36 Nombre de cellules vivantes Tests avec 100 µg/ml NPM à 8.74 mt T1 T2 E30 E60 1h 24h Figure 27 : Diagramme des tests avec 100 µg/ml NPM à 8.74 mt. [SP] A une concentration de 100 µg/ml, une multiplication des cellules est visible dans l échantillon E30 après 1h alors qu après 24h, une légère diminution se fait ressentir. Les résultats de ces tests présentes très peu de variations et ne sont donc pas représentatifs. Discussion sur les tests de viabilité - Sans nanoparticules Fe 3 O 4 Au vue des résultats obtenus, on peut affirmer qu un CM peut avoir tantôt un effet bénéfique et tantôt un effet nocif sur les cellules alvéolaires A549. Alors que nos échantillons-témoins ne présentent aucune variation significative du nombre de cellules, à faible densité magnétique (4.60 mt), on constate une augmentation des cellules humaines dans l échantillon exposé 60 min. Cette influence positive est également observée si on multiplie environ par deux la valeur du champ magnétique (8.74 mt) mais cette fois-ci pour une exposition de seulement 30 min. On remarque une certaine proportionnalité dans le sens où si l on double l intensité du CM, une durée d exposition deux fois moins importante est nécessaire afin d obtenir les mêmes résultats. En revanche, à faible densité magnétique (4.60 mt) et à courte durée d exposition (30 min) ainsi qu à forte densité magnétique (8.74 mt) et à longue durée d exposition (60 min), les effets des ondes s avèrent nocifs et entrainent la mort de nombreuses cellules. 30

37 - Avec nanoparticules Fe 3 O 4 Les concentrations 10 et 100 μg/ml ont été testées sur des témoins. Aucun effet cytotoxique significatif n a été observé sur les cellules alvéolaires. Pourtant en soumettant les cellules avec 10 μg/ml NPM au champ magnétique, on note une influence négative très prononcée à une valeur de CM valant 8.74 mt 1h après le traitement. De même, un jour après l exposition de 60 min, les cellules A549 survivantes ont été passées par trypsination et seulement quelques cellules ont adhéré à la flasque de culture. Les cellules adhérentes étaient incapables de proliférer et ont progressé graduellement vers un état apoptotique. Cette observation est également valable pour l exposition de 30 min et suggère que les effets d un champ magnétique de 8.74 mt sur les cellules demeurent, mêmes après un jour de traitement. Dans ce cas, la toxicité des nanoparticules est additive, en ce sens qu elle complète et intensifie celle exprimée par le champ magnétique. La viabilité des cellules A549, en présence de 100 μg/ml de NPM, exposées à un CM de 4.60 mt a été évaluée. Suite à une exposition de 30 min, les résultats montrent un fort effet cytotoxique avec un plateau à 50 % de mortalité 24h après le traitement. A l inverse, les variations sont peu significatives à 8.74 mt. De plus, le dénombrement des cellules vivantes a été réalisé par la technique au bleu trypan. Il s avère que cette technique de comptage semble mal adaptée aux fortes concentrations en nanoparticules. En effet des agglomérats de cellules avec les NPM ont parfois été observés dans l`hématimètre de Neubauer au microscope, rendant difficile le comptage des cellules. Cela est probablement dû à une mauvaise trypsination en présence de nanoparticules. 31

38 Evolution de la température - Champ magnétique de 4.60 mt Temps (en min) Milieu Suspension cellulaire sans NP Température (en C) Suspension cellulaire avec 10 µg/ml NP Suspension cellulaire avec 100 µg/ml NP T = T = T = T = T = T = T = Tableau 12 : Evolution de la température à 4.60 mt. [SP] Pour les échantillons contenant ou non les cellules, une élévation de 0.5 degrés Celsius est perceptible après 60 min d exposition à un CM de 4.60 mt. Aucune différence n est observée entre les différentes concentrations de nanoparticules d oxyde de fer ou là, la température passe de 23.5 à 25 C. - Champ magnétique de 8.74 mt Temps (en min) Milieu Suspension cellulaire sans NP Température (en C) Suspension cellulaire avec 10 µg/ml NP Suspension cellulaire avec 100 µg/ml NP T = T = T = T = T = T = T = Tableau 13 : Evolution de la température à 8.74 mt. [SP] 32

39 Quand le champ magnétique est environ multiplié par deux, la hausse de température est beaucoup plus importante que ce soit pour les échantillons sans NPM (3.5 C en 60 min) ou avec NPM (4.5 C en 60 min). Les augmentations de température observées ne sont pas significatives puisqu en temps normal les cellules humaines vivent dans un environnement à 37 C alors que la température maximum constatée est de 28 C à un CM de 8.74 mt. Cependant, on peut supposer que les variations de température peuvent influer sur l efficacité du mécanisme de prolifération des cellules. 33

40 CONCLUSION Ce travail a eu pour but d enrichir les connaissances sur les effets biologiques des nanoparticules couplées au champ magnétique sur des cellules humaines. Nous avons confirmé, que les nanoparticules Fe 3 O 4 et le champ magnétique ne sont pas inertes pour les pneumocytes A549. En effet, l`intensité du champ magnétique et la durée d exposition, accentués par la concentration des NPM, sont des paramètres influençant l effet cytotoxique des pneumocytes cancéreux. Ces résultats permettent donc de mettre en garde sur un effet néfaste de l association champ magnétique/nanoparticules pour la santé humaine, qui doit être confirmé par des études in vitro plus poussées. Cependant, une influence positive a parfois été observée. C est pourquoi, il serait intéressant de faire d autres études afin de déterminer le seuil de toxicité pour les cellules. De plus, étudier les possibles modifications morphologiques des cellules ou encore l interaction des nanoparticules avec les organites de la cellule avant et après avoir été exposé au CM aiderait à mieux comprendre le phénomène biologique engendré. Enfin, étendre cette étude en faisant des tests de viabilité cellulaire avec des magnétosomes permettrait de comparer les effets du CM avec les nanoparticules naturelles et avec les nanoparticules manufacturées. Ce projet a nécessité une approche multidisciplinaire associant physico-chimie, microbiologie et toxicologie humaine. Il m a permis de mettre en pratique mes connaissances théoriques acquises durant ma formation. Cela a été très formateur, et m a permis de réaliser l importance de prendre en considération le facteur humain, mais aussi de me rendre compte de la difficulté de mise au point des protocoles et du suivi de la culture cellulaire. Le sujet abordé était particulièrement intéressant et a renforcé mes connaissances ainsi que mon expérience dans le domaine biomédical. J ai pu être en contact avec différents corps de métiers tels que des chercheurs, des microbiologistes ou encore des chimistes.. 34

41 BIBLIOGRAPHIE [1]. École Polytechnique de Montréal. Polytechnique Montréal - Le génie en première classe. [en ligne]. École Polytechnique de Montréal. [réf. du 16 janvier 2013]. Disponible sur : < [2]. CROMER BERMAN, Stacey M. ; WALCZAK, Piotr ; BULTE, Jeff W.M. Tracking stem cells using magnetic nanoparticles. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology, 2011, vol.3, n 4, p. [3]. COROT, Claire ; ROBERT, Philippe ; IDEE, Jean-Marc et al. Recent advances in iron oxide nanocrystal technology for medical imaging. Advanced Drug Delivery Reviews, 2006, vol.58, n 14, p. [4]. HOFMANN, Andreas ; WENZEL, Daniela ; BECHER, Ulrich M. Combined targeting of lentiviral vectors and positioning of transduced cells by magnetic nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2009, vol.106, n 1, p. [5]. FORTIN, Jean-Paul ; WILHEM, Claire ; SERVAIS, Jacques et al. Size-sorted anionic iron oxide nanomagnets as colloidal mediators for magnetic hyperthermia. Journal of the American Chemical Society, 2007, vol.129, n 9, p. [6]. MAIER-HAUFF, Klaus ; ULRICH, Frank ; NESTLER, Dirk et al. Efficacy and safety of intratumoral thermotherapy using magnetic iron-oxide nanoparticles combined with external beam radiotherapy on patients with recurrent glioblastoma multiforme. Journal of Neuro-Oncology, 2011, vol.103, n 2, p. [7]. LEVY, Michael ; LUCIANI, Nathalie ; ALLOYEAU Damien et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials, 2011, vol.32, n 16, p. [8]. ATCC (American Type Culture Collection).The essentials of life science research. [en ligne]. American Type Culture Collection [réf. du 04 février 2013]. Disponible sur : < [9]. SHIN, Jaeha ; YOO, Chang-Hyuk ; LEE, Junghoon et al. Cell response induced by internalized bacterial magnetic nanoparticles under an external static magnetic field. Biomaterials, 2012, vol.33, n 22, p. vi

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43 GLOSSAIRE A Apoptose : mort cellulaire programmée. ATP : molécule qui, dans la biochimie de tous les organismes vivants connus, fournit par hydrolyse l'énergie nécessaire aux réactions chimiques du métabolisme. C Cytotoxicité : propriété qu a un agent chimique ou biologique d altérer les cellules, éventuellement jusqu à les détruire. H Hygrométrie : caractérise la quantité d'eau sous forme gazeuse présente dans l'air humide. I Interface oxique/anoxique : frontière entre le milieu riche en oxygène et celui dépourvu d'oxygène. M Micro-aérophile : organisme dont la croissance est optimale dans un milieu où la concentration en oxygène est inférieure à la concentration atmosphérique. N Nano-objet : objet dont toutes les dimensions dans l'espace sont de l'ordre du nanomètre (comprises entre 1 et 100 nanomètres). V Viabilité cellulaire : capacité d une cellule à vivre et à se reproduire. viii

44 TABLE DES ANNEXES Annexe 1 : Hiérarchie au sein du LIAB. [SP]... x Annexe 2 : Spécifications du dispositif induisant un CM. [14]... xi Annexe 3 : Spécifications du Cell Disruptor. [16]... xii Annexe 4 : Diagramme de Gantt. [SP]... xiii ix

45 Annexe 1 : Hiérarchie au sein du LIAB. [SP] x

46 Annexe 2 : Spécifications du dispositif induisant un CM. [14] xi

47 Annexe 3 : Spécifications du Cell Disruptor. [16] xii

48 Annexe 4 : Diagramme de Gantt. [SP] xiii