Intér^et et limites des tests d agrégation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles *

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1 Revue Intér^et et limites des tests d agrégation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles * Strengths and weaknesses of platelet aggregation in diagnosis ofq1 Marie-Christine Alessi 1, Bernard Payrastre 2,3, Pierre Sie 3 1 Laboratoire d hematologie, Inserm UMR 162, faculte demedecine, universite de la Mediterranee, Marseille, France 2 Inserm U148, I2MC et universite Paul- Sabatier, Toulouse, France 3 CHU de Toulouse, laboratoire d hematologie, Toulouse, France <marie-christine.alessi@univ-amu.fr> Resume Les defauts hereditaires des fonctions plaquettaires, ou thrombopathies, correspondent a un groupe heterogene d anomalies dont le diagnostic met tres souvent en premiere ligne l interpretation des resultats de l agregation plaquettaire realisee in vitro sur un plasma riche en plaquettes citrate. Cette revue a pour but de decrire les differents types de reponses plaquettaires obtenus dans le cas de thrombopathies d origine constitutionnelle, de façon a faciliter le diagnostic biologique des anomalies plaquettaires. n Mots cles : plaquettes, agregation plaquettaire, thrombopathies constitutionnelles, diagnostic Abstract The hereditary defects in platelet functions correspond to a heterogeneous group of abnormalities. Platelet aggregation performed with Platelet-Rich Plasma is often the first-line procedure in the diagnosis of platelet dysfunctions. The aim of this review is to describe the various platelet aggregation profiles characterizing hereditary platelet dysfunctions to assist the biologists in the diagnosis of platelet disorders. n Key words: platelets, aggregation, inherited platelet dysfunctions, diagnosis doi: /hma * Cette revue a ete redigee dans le cadre du Centre de reference des pathologies plaquettaires (CRPP). Tires a part : M-C. Alessi L agregation plaquettaire realisee in vitro sur plasma riche en plaquettes (PRP) citrate est un test essentiel au diagnostic des thrombopathies. L agregation plaquettaire est la consequence de l activation des plaquettes induite par differents agonistes et met en jeu differentes voies de signalisation qui varient en fonction du type et de la dose de l agoniste utilise. Le defaut peut concerner la reponse plaquettaire induite par un seul agoniste mais, dans la plupart des cas, l orientation diagnostique devra integrer et interpreter des defauts de reponse a plusieurs agonistes en raison de la mise en jeu de voies de signalisation communes a plusieurs agonistes et de l existence de voies d amplification (adenosine diphosphate [ADP], thromboxane A2 [TXA2]) d importance variable selon l agoniste teste. Le principe du test est base sur une mesure photometrique de l eclaircissement du PRP secondaire au phenomene d agregation. Il est sensible aux conditions techniques de realisation, en particulier a l etape Pour citer cet article : Alessi MC, Payrastre B, Sie P. Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles. 217 ; xx : doi : /hma vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217 1

2 preanalytique (prelevement, delai entre le prelevement et la realisation de l analyse et preparation de l echantillon). Un document de concertation sur ce sujet a ete produit par le sous-comite «plaquettes» de la Societe internationale de thrombose et hemostase (ISTH) en 213 [1], recemment complete par la publication d un guide pour le diagnostic des desordres plaquettaires hereditaires [2]. L interpretation des resultats de l agregation plaquettaire se heurte aussi a un manque de standardisation analytique. Plusieurs agregometres et reactifs sont disponibles sur le marche mais ne presentent pas les m^emes caracteristiques (specifications techniques, volume test, provenance et caracteristiques des agonistes, etc.) ce qui limite les comparaisons interlaboratoires. Enfin, il est important de rappeler que nombre de defauts d agregation ne sont pas necessairement reproduits lors d examens successifs, des variations physiopathologiques ou la prise de medicaments ou xenobiotiques modifiant le comportement plaquettaire. Il est donc essentiel, en particulier lorsque les defauts observes sont d intensite moderee, de renouveler l examen a distance avant d authentifier une anomalie. Les desordres conduisant a un defaut d agregation plaquettaire sont nombreux. Pour repondre a l objectif de ce document, qui est d ^etre un guide pratique d interpretation, il nous a semble souhaitable de developper dans un premier temps les thrombopathies d observation relativement courante, de mecanisme etabli, dont le diagnostic peut ^etre precise par des techniques complementaires facilement accessibles dans le cadre du reseau du centre de reference (cytometrie en flux, microscopie electronique, exploration ciblee de composants granulaires, sequençage d un gene candidat ou d un panel de genes, etc.). Les autres thrombopathies decrites dans la litterature, de mecanisme souvent incertain, sont presentees dans un second temps. Les tests realises en plaquettes lavees ne sont pas abordes dans ce document. Le diagnostic se pose devant une absence d agregation a tous les agonistes a faibles et fortes doses, en particulier aux agonistes des recepteurs actives par les proteases (PAR) (thrombine et TRAP [thrombin receptor-activating peptides]), alors que l agglutination a la ristocetine, mediee par le facteur von Willebrand, est conservee bien que souvent reduite. Le syndrome hemorragique est en regle generale severe. Le defaut est lie a une absence ou a une forte reduction de la liaison du fibrinogene a son recepteur plaquettaire, la GPIIbIIIa. Le deficit quantitatif de GpIIbIIIa a la surface des plaquettes constitue la thrombasthenie de Glanzmann, de transmission autosomique recessive, dont le diagnostic est dans la majorite des cas confirme par la mise en evidence d une perte complete d expression de la GpIIbIIIa a la surface de la plaquette par cytometrie en flux. Il s agit de la forme la plus frequente de thrombasthenie de Glanzmann. L existence d un defaut d agregation a tous les agonistes avec conservation de l expression de GPIIbIIIa oriente vers deux possibilites : une anomalie qualitative de la GpIIbIIIa entraînant un defaut d activation qui l emp^eche de se lier au fibrinogene constitue le variant de thrombasthenie de Glanzmann, un deficit en kindline 3 (defaut d adhesion des leucocytes de type III ou LADIII a transmission autosomique recessive). La kindline 3 est associee au cytosquelette et est requise pour l activation de la GPIIbIIIa [3] (figure 1). L agregation plaquettaire est soit absente avec tous les agonistes, soit, parfois, seulement diminuee (d environ 3 % de la normaleq2) au TRAP et au collagene atres forte dose (figure 2). L addition de MnCl 2 permet une activation de la GPIIbIIIa independante de la signalisation inside out et corrige partiellement le defaut. Ce defaut s accompagne d un deficit immunitaire, avec comme signes principaux une hyperleucocytose et des infections a repetition, ce qui permet de le distinguer d un variant de thrombasthenie de Glanzmann. Signal d activation α β α β Thrombopathies constitutionnelles de mécanisme établi On distinguera successivement les absences d agregation en reponse a plusieurs agonistes, les defauts de reponse a plusieurs agonistes et les defauts de reponse a un agoniste. Absence d agrégation en réponse à l ensemble des agonistes Phospholipase C DAG IP3 PKC CalDAG-GEFI Taline RAP1-GTP RAP1-GTP Taline Kindline 3 Kindline 3 Figure 1. Representation schematique des voies de signalisation impliquees dans l activation des integrines par CalDAG-GEFI, un facteur d echange GDP/GTP specifique des petites proteines G, Rap. L interaction Rap1*GTP avec RIAM (non montre) stimule la fixation de la taline sur la beta integrine. La kindline 3 se lie a la portion cytoplasmique de la beta integrine. 2 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217

3 Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles ADP 2 µm ADP 1 µm Coll 2 µg/ml Coll 1 µg/ml TRAP 6 1µM TRAP 6 5 µm EPI 25 µm AA 1 mm Figure 2. Agregation plaquettaire en reponse aux principaux agonistes utilises a faible et forte dose chez un patient porteur d une mutation homozygote FERMT3 a l origine d une absence de la proteine Kindline 3 [3] (Donnees obtenues a partir de l agregometre TA-8V de SD innovation et des reactifs Agro-bio). vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217 3

4 Réduction de l agrégation en réponse à plusieurs agonistes Anomalie de CalDAG-GEF1 CalDAG-GEFI est un facteur d echange de la GTPase monomerique, Rap1, impliquee dans la signalisation inside-out des integrines (figure 1). Une famille française porteuse d une mutation de RASGRP2 dans un domaine critique d interaction avec Rap1b a permis de decrire le premier cas de deficit en CalDAG-GEFI [4]. D autres familles porteuses de mutations ont depuis ete identifiees et publiees. En raison de l importance de CalDAG-GEFI dans l initiation de l activation plaquettaire par l ADP et dans la secretion plaquettaire, l anomalie s apparente aux defauts de la voie P2Y12/Gi (voir paragraphe suivant). L agregation plaquettaire est fortement reduite lorsque les plaquettes sont stimulees par de faibles doses d agonistes (ADP 2 mm, TRAP 1 mm, adrenaline 5 mm, acide arachidonique [AA],5-1 mm, collagene 2 mg/ml). La perte de CalDAG-GEFI peut ^etre compensee si de fortes doses d agonistes sont utilisees comme le TRAP (5 mm), le collagene (1 mg/ml), l AA (1,5 mm) voire l ADP (5-1 mm) ou lors d activation directe de la proteine kinase C (PKC) par le phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (figure 3). On notera en particulier une reponse quasi normale a l AA aux concentrations usuelles (1-1,5 mm) alors que l agregation a l epinephrine (25 mm) est fortement reduite. Anomalie de la voie d amplification médiée par l adénosine diphosphate Les plaquettes expriment plusieurs recepteurs purinergiques : deux sont des recepteurs a l ADP couples aux proteines G (P2Y1 et P2Y12) ; le troisieme est un recepteur a l ATP, P2X1, qui a une fonction de canal calcique [5]. L agregation induite par l ADP explore la voie P2Y1/Gq consideree comme une voie «starter» et la voie d activation/amplification P2Y12/Gi (figure 2). Un defaut de P2Y1 se caracterise par une anomalie isolee du changement de forme (shape change) visible sur le trace au pied de la courbe d agregation. La coliberation de l ATP et de l ADP au cours de l activation plaquettaire explique que la stimulation par l ATP du recepteur P2X1, qui n induit pas a elle seule l agregation, amplifie le signal de stimulation de P2Y1/Gq et l agregation induite par l ADP et les autres agonistes. Ainsi, les trois recepteurs agissent physiologiquement en synergie. Neanmoins, a notre connaissance, il n existe pas de thrombopathie constitutionnelle liee a un deficit en P2Y1, et un seul cas de mutation ponctuelle du gene de P2X1 a ete rapporte (cf. infra : Thrombopathies de mecanisme incertain). Par ailleurs, l activation de P2Y12 inhibe les voies de retrocontr^ole negatif de l agregation plaquettaire, essentiellement mediees par l adenosine monophosphate cyclique (AMPc) produit par l adenylate cyclase (AC) (figure 4) lorsque celle-ci est activee par la prostacycline endotheliale (PGI2), la prostaglandine 1 (PGE1) ou l adenosine via leurs recepteurs specifiques, ou directement par la forskoline. Ce retrocontr^ole est implique dans la croissance du thrombus in vivo mais n est pas explore in vitro par l agregation plaquettaire en PRP. En pratique, un defaut constitutionnel d agregation a l ADP en agregometrie est lie a une anomalie de la voie d activation/amplification P2Y12/Gi/phosphatidyl-inositol 3 (PI3) kinase/akt/rab1b (figure 4). Le profil d agregation a l ADP en plasma citratedepend de la concentration d ADP utilisee. Aux faibles concentrations (1 mm), l agregation n est pas stable. La courbe est dite reversible. Aux concentrations intermediaires (2-4 mm) l activation induite par l ADP exogene se complete par la secretion de l ADP endogene contenu dans les granules denses (d), ce qui peut donner lieu, en PRP citrate, au phenomene dit de double vague (agregation suivi d un debut de desagregation, puis d agregation complete et stable). Aux concentrations fortes ( 1 mm), l agregation est stable. Il est important de noter qu il existe une variabilite individuelle d autant plus nette que les doses d ADP sont faibles (1-4 mm). La velocite de l agregation est tres dependante de la concentration d ADP utilisee, ce qui est moins le cas pour l intensite maximale. L ADP secrete des granules d est un amplificateur de l activation plaquettaire induite par d autres agonistes comme le TXA2, le collagene et les agonistes des recepteurs PAR a faible doses. Un defaut de reponse a l ADP, quelle que soit son origine (defaut de la voie P2Y12 ou defaut de secretion plaquettaire), en interrompant cette boucle d amplification, reduit la reponse aux concentrations sous-optimales de ces agonistes. Ceci explique qu un defaut sur la voie de l ADP s associe a des reponses diminuees aux faibles doses de nombreux agonistes. Les defauts d agregation induite par l ADP peuvent avoir des causes multiples. Les reponses obtenues en fonction des doses d ADP et l association a des defauts d agregation initiee par d autres agonistes vont cependant aider a l orientation etiologique. Anomalie du récepteur P2Y12 Chez les patients porteurs d une mutation deletere a l etat homozygote ou heterozygote composite, ledefaut d agregation en reponse a l ADP est souvent complet, m^eme aux tres fortes doses d ADP (1 mm) [6-9] (figure 5A). L intensite du defaut depend cependant du nombre, mais egalement de la qualite des recepteurs presents a la surface des plaquettes. Le defaut d agregation est en general tres net si le taux residuel des recepteurs est inferieur a 3 %. Le changement de forme des plaquettes 4 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217

5 Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles ADP 2 µm ADP 1 µm Coll 2 µg/ml Coll 1 µg/ml TRAP 6 1µM TRAP 6 5 µm EPI 25 µm AA 1 mm Figure 3. Agregation plaquettaire induite par differents agonistes a faible et forte concentration chez un patient presentant un deficit homozygote en CalDAG-GEFI [4]. ((Donnees obtenues a partir de l agregometre TA-8V de SD innovation et des reactifs Agro-bio). vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217 5

6 PAR1 & 4, TPα TXA2, thrombine PAR1 & 4, TPα, P2Y1 ADP P2Y12 G12/13 Gq Gi vwf Rho-GEF Akt PI3K ζ Src PLCβ PLCγ2 Syk Lyn LAT PI3K Akt Akt PI3K ATP Src AC AMPc FAK Taline IIb IIIa αiibβ3 GpIb/V/IX FcRγ Fibrinogène GpVI Collagène Figure 4. Principales voies de l activation plaquettaire. G12/13, Proteine G a sous unite a12/13 ; Gq, Proteine G a sous unite aq ; Gi Proteine G a sous unite ai ; ADP, Adenosine diphosphate; TxA2, thromboxane A2; TP, TxA2 receptor; PAR, protease-activated receptor; P2Y1/P2Y12, recepteurs purinergiques ; RhoGEF, Rho guanine nucleotide exchange factor; PLC-b, phospholipase C-b; PLC-g, phospholipase C-g ;PI-3-K, phosphoinositide-3- kinase; Akt, proteine kinase B ; AC, adenylate cyclase; FAK, Focal Adhesion Kinase ; Src, Src family kinase ; LAT, T lymphocyte adaptator protein Syk, Spleen tyrosine kinase ; Lyn, Lyn tyrosine kinase ; FcR-g, Recepteur au Fc gamma ; z proteine D apres Payrastre B et coll, 214; 2 : visible sur le trace n est pas affecte car il depend du recepteur P2Y1. L agregation est reduite en reponse a de faibles doses de collagene ou de TRAP, soulignant le r^ole amplificateur de l ADP dans des conditions de faible stimulation. Ce phenomene n est pas ou peu observe avec de fortes doses de collagene (> 1 mg/ml) ou de TRAP (en general 5 mm). Il est interessant de noter la faible reduction de l agregation qui donne reponse a l adrenaline (1 mm) (figure 5), qui paraît plus severement affectee en cas de defaut touchant la voie du TXA2, de defaut granulaire (cf. infra) ou de la famille des proteines Gi. Toutefois, aucun cas de mutation de Gi n a ete rapporte dans la litterature, hormis une reduction quantitative de 25 % du niveau de Gia [1]. L agregation induite par l AA est moderement reduite [5]. Le porteur de mutation a l etat heterozygote presentera en general un tableau intermediaire avec une agregation quasi normale ou qui s ameliore aux fortes doses d ADP [11, 12]. L intensite du defaut depend du nombre et de la qualite des recepteurs P2Y12 presents a la surface des plaquettes. Ainsi, chez un patient porteur de la substitution K174E a l etat heterozygote, dont les plaquettes ont une capacite de liaison a l ADP reduite de moitie, le trace obtenu sous une stimulation 3 mm d ADP est quasi normal [11] (figure 5B). D autres mutations heterozygotes, comme la variation (P341A), dont la capacite de liaison est conservee, ne s accompagnent pas d anomalie de l agregation. La detection des heterozygotes se base alors sur une methode plus sensible permettant d evaluer un defaut d inhibition de l adenylate cyclase a de tres faibles doses d ADP (,1 mm), lorsque celle-ci est stimulee par la PGE2 [13, 14] ou la forskoline ou, plus aisement, sur une faible dephosphorylation de VASP (pour vasodilatorstimulated phosphoprotein) a l ADP apres traitement a la PGE1 en cytometrie de flux. Dans certains cas, bien que les profils d agregations soient normaux, un defaut severe de secretion d ATP a ete mis en evidence quand les plaquettes etaient stimulees par l ADP (2-4 mm) [15]. La figure 6 illustre des profils d agregation obtenus chez un patient traite par un inhibiteur du P2Y12 (clopidogrel) au long 6 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217

7 Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles A Aggregation (%) Aggregation (%) 7 7 ADP (1 μm) 6s Adrenaline (1 μm) 6s P C P C ADP (1 μm) Collagen (3 μg/ml) ADP (1 μm) + (1 μm) AR-C6785 P P C C Collagen (1 μg/ml) P C P C B Aggregation (%) Aggregation (%) 7 7 ADP 3 μm 6s 6s Patient Control ADP 1 μm Patient Control Patient Control ADP 3 μm Patient Control Patient Control ADP 1 μm + (1 μm ARC-6785 (P2Y 12 antagonist) Figure 5. Profils d agregation chez des patients porteurs de mutations sur le gene P2RY12 a l etat homozygote (A [19]), simple heterozygote (B [11]). Le trace en B correspond a la substitution K174E. Les plaquettes ont une capacite de liaison a l ADP reduite de 5%. Le trace obtenu pour 3mM d ADP est quasi normal. cours. Le profil d agregation obtenu s apparente a un deficit modere en P2Y12. Le defaut porte avant tout sur la reponse a l ADP et a la faible dose de collagene. Anomalie de la sécrétion d ADP Les maladies de Chediak-Higashi [16] et de Hermansky- Pudlak [17] sont des desordres autosomiques recessifs caracterisees par un deficit en granules d et respectivement liees a des mutations sur le gene LYST ou les genes HPS. Elles sont evoquees devant l existence d un albinisme associe. Un cas de deficit en granules d associe a un retard psychomoteur a ete rapporte avec, comme autres anomalies, un defaut d agregation a l epinephrine et de secretion d ATP [18]. A c^ote de ces formes syndromiques, un deficit en granules denses (d-storage pool disease) de transmission autosomique dominante peut s observer, associe a un syndrome hemorragique modere, sans albinisme. Ces deficits sont de diagnostic plus difficile. Ils se caracterisent par une reduction de l agregation plaquettaire aux faibles doses d agonistes en accord avec une reduction des r^oles amplificateurs de la secretion granulaire. Les profils d agregation vont varier en fonction de la severite du deficit. Dans les cas de deficit severe, les profils d agregation s apparentent au deficit en P2Y12, mais quelques caracteristiques sont a souligner : le defaut d agregation a l ADP 1 mm est en regle generale modere [19, 2], laissant supposer qu a cette dose la secretion influence peu l agregation induite par l ADP lui-m^eme. Les reponses au collagene et au TRAP faibles doses sont reduites, ainsi que la reponse a l epinephrine (figure 7). Dans les deficits moderes, l agregation plaquettaire peut ^etre normale ou peu perturbee. En cas de suspicion, des methodes complementaires devront ^etre mises en œuvre, notamment la mesure du contenu et de la secretion des granules denses (dosage de l ATP, de la serotonine, test a la mepacrine, expression membranaire du CD63, comptage en microscopie electronique a transmission des granules denses des plaquettes entieres fixees). Anomalie de la voie d amplification médiée par le thromboxane A2 Lors de l addition d AA exogene au PRP, celui-ci est transforme en TXA2 par l action de la cyclo-oxygenase 1 (COX1) et de la prostaglandine G/H synthase 1 (PGHS) plaquettaires. Cette transformation est egalement mise en œuvre lorsque l AA endogene des phospholipides membranaires est libere par un jeu de phospholipases lors de l activation plaquettaire par d autres agonistes. Le TXA2 produit par la transformation de l AA endogene ou exogene a un effet autocrine et paracrine via un recepteur specifique (TPa) couple aux proteines Gq et G12/13 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217 7

8 ADP 2 µm ADP 1 µm Coll 2 µg/ml Coll 1 µg/ml TRAP 6 1µM TRAP 6 5 µm EPI 5 µm EPI 25 µm Figure 6. Profils d agregation obtenus chez un patient traite exclusivement par du clopidogrel ((Donnees obtenues a partir de l agregometre TA-8V de SD innovation et des reactifs Agro-bio). 8 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217

9 Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles ADP 2 µm ADP 1 µm Coll 2 µg/ml Coll 1 µg/ml TRAP 6 1µM TRAP 6 5 µm EPI 5 µm EPI 25 µm Figure 7. Profils d agregation obtenus chez un patient atteint d un deficit severe en granules denses (P Saultier et al. haematologica 217 et donnees obtenues a partir de l agregometre TA-8V de SD innovation et des reactifs Agro-bio). vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217 9

10 (figure 4). Cette voie correspond a un mecanisme d amplification essentiel pour obtenir l agregation aux faibles concentrations de nombreux agonistes. Ce defaut se revelera non seulement par un defaut de reponse a l AA (qui peut se corriger si on augmente les doses d AA) mais egalement par l absence de deuxieme vague en reponse a l adrenaline, une absence d agregation aux faibles doses (2 mg/ml) de collagene et une agregation franchement reversible a1mm d ADP. Ce defaut est le plus souvent lie a une anomalie du recepteur TPa, de transmission autosomique dominante, mais peut correspondre a un defaut de conversion de l AA exogene en TXA2. L utilisation d analogues du TXA2, comme l U46619 ou le STA2, et le dosage du TXB2 (metabolite stable du TXA2) dans le serum permettent de distinguer ces deux mecanismes. Dans le premier cas [21-23] (defaut de reponse au TXA2 par anomalie du TPa), l agregation induite par STA2 ou U46619 est affectee (l agregation se normalise parallelement a l augmentation des doses d analogues). Une liaison diminuee du TXA2 a son recepteur ou un defaut de couplage a la proteine Gq sans anomalie de la liaison au recepteur TP peuvent ^etre en cause. Dans le deuxieme cas [24] (defaut de conversion de l acide arachidonique en TXA2), l agregation induite par les analogues du TXA2 est normale et le TXB2 serique est tres bas. Un defaut de ce type devra faire evoquer en premier lieu une prise d inhibiteurs de COX1 tels que des anti-inflammatoires non steroïdiens, dont l aspirine (figure 8). Des mutations du gene TBXAS1, qui code une thromboxane synthase, ont ete identifiees chez des patients atteints de dysplasie hematodiaphysaire de Ghosal (densite osseuse des diaphyses augmentee et anemie aregenerative corticosensible), associee a des defauts de reponse plaquettaire a l AA essentiellement a faible dose alors que l agregation induite par le U46619 est normale [25]. Il n a pas ete decrit a ce jour d anomalie des genes de COX1 ou prostaglandine G/H synthase 1 (PGHS), bien que ce defaut ait ete suggere. Défaut spécifique de réponse à un agoniste Défaut d agrégation au collagène L agregation au collagene in vitro ne correspond pas a une voie d amplification et met en jeu une signalisation specifique en aval qui n est pas essentielle pour les autres agonistes. Ceci explique le caractere specifique du defaut d agregation. Ce defaut oriente le plus souvent vers un deficit constitutionnel [26] ou acquis (autoanticorps) en GPVI ou de la voie de signalisation en aval de GPVI, ou encore de l integrine a2b1 (GpIa/IIa). L agregation plaquettaire peut ^etre totalement absente ou seulement reduite, probablement en relation avec le nombre de recepteurs residuels presents. La proteine C reactive (CRP) ou peptide activateur issu du collagene et la convulxine (extraite d un venin de serpent) sont des agonistes specifiques de la GPVI permettant d evaluer la voie GPVI sans mettre en jeu la voie a2b1 (GpIa/IIa). Un deficit profond (15 a 25% residuels) en GPIa a ete associe a une absence d agregation au collagene [27] sans qu une anomalie moleculaire de cette GP n ait ete identifiee. Des deficits acquis en GPIa-IIa ont egalement ete decrits [28, 29]. Les defauts constitutionnels ou acquis en rapport avec les voies de signalisation en aval de GPVI sont rares. Toutefois, certaines nouvelles therapeutiques ciblees (inhibiteurs de Src, de Syk ou de Btk) utilisees dans le traitement des hemopathies malignes lymphoïdes ou myeloïdes peuvent inhiber specifiquement l agregation au collagene en interferant avec les voies de signalisation [3]. La toxine rhodocytine active CLEC2 (pour C-type lectin-like receptor 2) dont la voie de signalisation est proche de celle induite par GPVI. Un defaut d agregation a la rhodocytine, a la convulxine et a la CRP peut signer l existence d un defaut de signalisation en aval des recepteurs a motif ITAM. Défaut de réponse à la ristocétine Il est classique d indiquer que la reponse a la ristocetine n est pas une reponse d agregation, mais d agglutination en presence de facteur von Willebrand. Cependant, l intensite de cette reponse est clairement reduite par les antiiibiiia et met en jeu des phenomenes d agregation qui expliquent que l intensite delareponse a la ristocetine puisse ^etre diminuee ou reversible si l activation de la IIbIIIa est reduite. Les thrombopathies par anomalie du recepteur au facteur Willebrand (complexe GpIb/V/IX) s accompagnent d un defaut specifique de reponse a la ristocetine. Dans la maladie de Bernard et Soulier, de transmission recessive (deficit en GpIb/IX), l agregation a la ristocetine (>1,2 mg/ml) est reduite. Le diagnostic est evoque devant une thrombopenie macrocytaire et confirme par la mise en evidence du deficit par cytometrie en flux. Dans le pseudo-willebrand plaquettaire, d^u a une mutation qui augmente l affinite de la GpIb pour le facteur Willebrand normal, l agregation a la ristocetine a faible dose (,6 mg/ml) est presente. Le diagnostic differentiel avec un variant 2b de maladie de Willebrand est realise par l epreuve croisee (persistance de l agregation a la ristocetine faible dose dans le melange des plaquettes du patient avec un plasma normal en cas de pseudo- Willebrand plaquettaire). Déficit en Gas Une tendance aux saignements a ete decrite chez des patients presentant une hyperactivite de la voie Gs 1 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217

11 Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles 8 ADP 2 µm ADP 1 µm Coll 2 µg/ml Coll 1 µg/ml TRAP 6 1µM TRAP 6 5 µm EPI 25 µm AA 1 mm Figure 8. Profils d agregation obtenus chez un patient traite par aspirine (Donnees obtenues a partir de l agregometre TA-8V de SD innovation et des reactifs Agro-bio). correspondant a une insertion de trente-six paires de bases dans le gene codant la sous-unite extralarge de Gs [31].La symptomatologie n existe que si l allele delete est transmis par le pere. Ces cas sont associes a un retard mental, a une epilepsie et a des anomalies moderees du squelette. L agregation plaquettaire est normale alors que le temps de saignement est fortement allonge. Le diagnostic passe par la mise en evidence d une inhibition majoree de l agrega- vol. xx n8 xx, xxx-xxx

12 Control Patient 1 Patient 2 Aggregation (%) Figure 9. Inhibition exageree de l agregation plaquettaire induite par le collagene (2 mg/ml) par la PGE1 (doses croissantes de a 166 ng/ml), agoniste des recepteurs couples a Gs, chez 2 patients ayant une insertion de 36 pb dans la sous unite extralarge de Gs.[31]. tion plaquettaire par les agonistes des recepteurs couples a Gs comme la PGI2 et la PGE1 (figure 9). Thrombopathies constitutionnelles de mécanisme incertain Il s agit essentiellement de troubles touchant des proteines de signalisation, en particulier les proteines G (figure 4). Défaut isolé de réponse à l épinéphrine Le defaut de deuxieme vague en reponse a l epinephrine (5-1 mm) serait present chez 1 a 15 % des sujets normaux. Cette anomalie serait en rapport avec un nombre reduit de recepteurs a2a, dont le niveau d expression serait sous contr^ole genetique. Ce defaut a egalement ete decrit au cours du syndrome Quebec, sans que le mecanisme en soit elucide. Déficit en Gaq Gaq (figure 4) se situe en aval des recepteurs P2Y1, TXA2 et PAR. Un deficit de 25 % de Gaq aete mis en evidence dans une famille, mais il n a pas, pour l instant, ete associe a une anomalie moleculaire [24, 32] Des anomalies d agregation sont observees aux faibles doses des PAR1 et 4 et de U46619 [24]. Undefaut de liberation de l AA endogene responsable d un defaut d amplification a l ADP (8 mm) et d un defaut profond de reponse a l epinephrine (8 mm) et au collagene (2,5 mg/ml) sans anomalie de reponse a l AA exogene a ete decrit chez quatre patients [24]. L hypothese initiale etait un defaut de liberation de l AA sans anomalie de conversion ni du recepteur au TXA2, mais aucune anomalie moleculaire n est venue etayer cette hypothese. Ce patient a ensuite ete considere comme porteur d un deficit en proteine Gaq. Défaut de phospholipase C b Ce defaut a ete suggere par Rao en Une anomalie du metabolisme du calcium et une diminution des niveaux d ARNm de la phospholipase C b2 [33] dans les plaquettes mais non dans les neutrophiles ont ete mises en evidence. Pour ces patients l agregation plaquettaire etait reduite pour la plupart des agonistes. Le defaut profond d agregation induite par le collagene est a relie a un defaut d amplification par le TXA2. Aucune anomalie moleculaire n est venue etayer cette hypothese. Défaut portant sur le récepteur P2X1. Le recepteur P2X1, dont l agoniste est l ATP, contribue a la regulation de l entree de calcium lors de l activation des plaquettes. Une forme dominante negative du recepteur s associerait egalement a undefaut selectif d agregation a l ADP sans anomalie de l agregation a l AA, au TRAP14 et a la ristocetine. Malheureusement, les traces d agregation plaquettaire du patient porteur de l anomalie n ont pas ete rapportes dans la publication relative a ce cas [34]. Conclusion Depuis plus de quarante ans, l agregation plaquettaire en PRP a fait la preuve de son inter^et diagnostique. Le respect des procedures preanalytiques et une meilleure connaissance des differents agonistes commercialises devraient permettre d ameliorer l interpretation des resultats. Des procedes d agregation automatises commencent a voir le jour et vont probablement permettre egalement de reduire 12 vol. xx n8 xx, xxx-xxx 217

13 Inter^et et limites des tests d agregation pour le diagnostic des anomalies fonctionnelles plaquettaires constitutionnelles Tableau 1. Tableau récapitulant à titre indicatif les résultats de l agrégation plaquettaire (intensité maximale) en fonctions des principales étiologies. Un bilan de dépistage comprenant une agrégation induite par 2 et 1 mm ADP, 5 et 25 mm épinéphrine, 2 et 1 mg/ml collagène, 1 et 5 mm de 143 TRAP et 1 mm d acide arachidonique(aa) doit permettre une orientation étiologique. Le bilan sera complété dans un second temps par de fortes 144 doses d ADP (1 mm) dans le cas d une suspicion de déficit sévère en P2Y12 et d une stimulation par le U46619 en cas de suspicion d une 145 anomalie sur la voie du TXA2. A (absence d agrégation), I (agrégation réduite ou réversible), N (agrégation normale). ADP (mm) Epinéphrine (mm) Collagène (mg/ml) AA (mm) U466l9 (mm) TRAP (mm) Commentaire l 2 l l 5 l 2 l l.5 l l 3 l.6 5 l Anomalie du récepteur P2Y12 A A A A A N NI R N A A N NR N NR NR A N RA Déficit sévère (homozygote) Défaut CalDAG-GEFI N R R R A R R R N A A N RA N NR R A N A Déficit sévère (homozygote) Maladie de Glanzmann type 1 complet A A A A A A A A A A A A A A A A A A A Moins sévère si variant Déficit en kindline 3 A A A A A A A A A A A A A A A A A I A Déficit sévère (homozygote) Déficit de réponse isolé au collagène N N N N N N N N R A A N N N N N N N N Mutation GP6 Défaut sur la voie du TXA2 N N NR R R R RA A N A A AR AR N AR A A N N Mutation du récepteur TP Défaut sévère de sécrétion des granules denses N N N NRR N NRNR N AA N NR NNNR NR N A la variabilite de cette methode et de l ouvrir a des laboratoires moins specialises. Face a ces evolutions, il devient important d optimiser l interpretation de l agregation plaquettaire en proposant une procedure standardisee. Un bilan de depistage comprenant une agregation induite par 2 et 1 mm d ADP, 25 mm d epinephrine, 2 et 1 mg/ml de collagene, 1 et 5 mm de TRAP et 1 mm d AA (tableau 1) est en mesure d assurer une premiere orientation diagnostique. Le bilan pourra ^etre complete dans un second temps par de fortes doses d ADP (1 mm) dans le cas d une suspicion de deficit severe en P2Y12 et d une stimulation par le U46619 en cas de suspicion d une anomalie sur la voie du TXA2. L essor des technologies d exploration du genome a permis d elargir le panel des pathologies plaquettaires a rechercher face a un syndrome hemorragique cutaneomuqueux d origine plaquettaire. Ces nouvelles techniques vont constituer un outil remarquable d aide au diagnostic des pathologies plaquettaires constitutionnelles. Il est probable que de nouvelles formes de thrombopathies voient le jour dans les annees a venir. Ce changement technologique va peut-^etre amener dans un futur proche a reconsiderer la place de l agregation plaquettaire non plus comme une technique de depistage mais de confirmation de l implication fonctionnelle de la variation genetique identifiee. Liens d inter^et : Les auteurs declarent n avoir aucun lien d inter^et en rapport avec cet article. Références 1. Cattaneo M, Cerletti C, Harrison P, et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: a consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost 213 ; 11 : Gresele P. Subcommittee on platelet physiology of the international society on thrombosis and hemostasis. Diagnosis of inherited platelet function vol. xx n8 xx, xxx-xxx

14 disorders: guidance from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 215 ; 13 : Robert P, Canault M, Farnarier C, et al. A novel leukocyte adhesion deficiency III variant: kindlin-3 deficiency results in integrin- and non integrin-related defects in different steps of leukocyte adhesion. J Immunol 211 ; 186 : Canault M, Ghalloussi D, Grosdidier C, et al. Human CalDAG-GEFI gene (RASGRP2) mutation affects platelet function and causes severe bleeding. J Exp Med 214 ; 211 : Gachet C. P2 receptors, platelet function and pharmacological implications. Thromb Haemost 28 ; 99 : Cattaneo M, Lecchi A, Randi AM, McGregor JL, Mannucci PM. Identification of a new congenital defect of platelet function characterized by severe impairment of platelet responses to adenosine diphosphate. Blood 1992 ; 8 : Nurden P, Savi P, Heilmann E, et al. An inherited bleeding disorder linked to a defective interaction between ADP and its receptor on platelets. Its influence on glycoproteiniib-iiia complex function. 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15 Questions a l auteur Q1 Merci de completer. Q2 La formulation «L agregation plaquettaire [est] diminuee (d environ 3 % de la normale)» est ambigu e. Est-elle diminuee de 3 % par rapport a la normale, ou reduite a 3 % de sa valeur normale (c est-a-dire diminuee de 7 %)?