VALIDATION ET CONTRÔLE QUALITÉ DES MÉTHODES D'AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE (PCR) UTILISÉES POUR LE DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES

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1 CHAPITRE VALIDATION ET CONTRÔLE QUALITÉ DES MÉTHODES D'AMPLIFICATION EN CHAÎNE PAR POLYMÉRASE (PCR) UTILISÉES POUR LE DIAGNOSTIC DES MALADIES INFECTIEUSES INTRODUCTION Le diagnostic de maladies infectieuses est réalisé par la détection directe et/ou indirecte d agents infectieux. Par les méthodes directes, les particules des agents et/ou leurs composants, tels que les acides nucléiques, les protéines structurales ou non-structurales, les enzymes, etc., sont détectés. Les méthodes indirectes démontrent la présence des anticorps induits par les infections. Les méthodes les plus usuelles pour la détection directe sont l isolement ou la culture in vitro, la microscopie électronique, l immunofluorescence, l immunohistochimie, les épreuves immuno-enzymatiques (ELISA), l hybridation d acides nucléiques (NAH, Nucleic-acid Hybridisation), les épreuves à base de micro- et macro-puces et les diverses techniques d amplification d acides nucléiques comme la réaction d amplification en chaîne par polymérase (PCR) ou les méthodes d amplification isothermiques comme l amplification basée sur les séquences d acides nucléiques (NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ou l amplification isothermique par clivage invasif ou par la méthode dite LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification). Comme les épreuves de NAH, de micro- et macro-puces et les diverses épreuves d amplification utilisent pour cibles les molécules d acides nucléiques, elles sont également appelées méthodes de diagnostic moléculaire. Les méthodes les plus usuelles de détection indirecte d agents infectieux sont les épreuves sérologiques, telles que la neutralisation virale, l ELISA, les épreuves d inhibition de l hémagglutination, puis une série de méthodes techniques plus récentes telles que les biocapteurs, la bioluminétrie, la polarisation de fluorescence, la chimioluminescence, etc. En général, les laboratoires de diagnostic utilisent simultanément les méthodes directes et indirectes, afin d obtenir le plus de certitude possible pour un diagnostic. Les expériences des deux dernières décennies indiquent que les techniques de PCR vont finalement supplanter bon nombre des méthodes directes classiques de détection d agents infectieux. Il apparaît clairement que la PCR est en train de remplacer l isolement de virus ou la culture de bactéries, pour la détection d agents difficiles ou impossibles à cultiver. Il existe plusieurs raisons à cette tendance qui incluent le fait que l isolement de virus nécessite: i) la présence de microorganismes qui se multiplient (virus ou bactéries) ; ii) des locaux et des équipements coûteux pour les cultures cellulaires et la maintenance ; iii) un minimum de plusieurs semaines pour réaliser le diagnostic ; et iv) une expertise particulière qui manque ou diminue aujourd hui dans bon nombre de laboratoires. Bien qu initialement les épreuves de PCR aient été coûteuses et lourdes à mettre en œuvre, elles sont maintenant devenues des outils relativement peu chers, sûrs et d emploi facile dans les laboratoires de diagnostic (2-4, 6, 7, 11-13). La sensibilité et la spécificité de la PCR sont généralement meilleures que les procédures d isolement ou les ELISA de capture d antigène. L introduction de diverses méthodes de PCR en temps réel, des automates pour l extraction des acides nucléiques et des plateformes automatisées a résulté à l heure actuelle en un grand arsenal d épreuves robustes, très rapides et fiables pour le diagnostic moléculaires. Dans ce chapitre les applications diagnostiques des diverses méthodes de PCR sont résumées avec un intérêt particulier pour l harmonisation et la validation au niveau international. 50 Manuel terrestre de l OIE 2005

2 A. MÉTHODES DE PCR UTILISÉES EN DIAGNOSTICS MOLÉCULAIRES DE ROUTINE 1. Les principes de la PCR La réaction d amplification en chaîne par polymérase (PCR) implique qu il y ait dans cette technique une amplification basée sur une réaction enzymatique. Le terme de «réaction en chaîne» fait référence à plusieurs cycles de copies de l ADN spécifique, issus dans ce cas du génome d un agent infectieux. La région devant être amplifiée est délimitée par deux (ou plus) séquences nucléotidiques courtes, appelées sites d amorce, qui encadrent la séquence cible. Les amorces, oligonucléotides courts complémentaires des sites d amorce, se lient à la chaîne d ADN devant être copiée. En utilisant une polymérase, qui n est pas dénaturée au cours des cycles de chaleur, il est possible de copier la séquence ciblée par l ajout aux amorces de nucléotides libres. En répétant les cycles de chaleur 20 à 40 fois, le taux de copies d ADN cibles acquises augmente de façon exponentielle en en produisant suffisamment pour les opérations suivantes, telles que la détection, le clonage ou le séquençage. La sensibilité du diagnostic par PCR est très élevée car plusieurs millions de copies de la cible sélectionnée sont produites. La spécificité peut également être très élevée selon les séquences nucléotidiques spécifiques des cibles sélectionnées, et le motif des amorces. Les amorces peuvent être choisies pour détecter des séquences de nucléotides très spécifiques dans les génomes des agents infectieux sélectionnés, ou peuvent être choisies pour être complémentaires de régions bien conservées du génome, permettant ainsi la détection des membres d une famille ou du genre d un agent infectieux. Une synthèse détaillée des techniques moléculaires a été publiée (17). a) Amplification de l ADN Si le génome de l agent infectieux est de l ADN, l amplification est effectuée directement, avec ou sans purification préalable de l ADN cible. Dans de nombreux cas, l utilisation d ADN extrait ou purifié à partir d un matériel devant être analysé (ex : du sang) permet d augmenter la sensibilité analytique et diagnostique. b) Amplification d ARN (PCR par transcription inverse) Les génomes de nombreux agents infectieux contiennent de l acide ribonucléique (ARN) qui ne peut pas être amplifié directement par PCR. Pour l amplification par PCR, de l ADN cible simple brin est nécessaire, mais n est pas disponible dans le cas de virus à ARN. Ce problème peut être résolu par l addition d une étape avant de commencer la PCR. En utilisant une transcriptase inverse, il est possible de transcrire l ARN en ADN complémentaire (ADNc), qui est un ADN double brin et peut être utilisé dans une épreuve de PCR (cette procédure est appelée PCR couplée à la transcription inverse : RT-PCR). Traditionnellement, la réaction de transcription inverse était effectuée dans un tube de réaction séparé et l ADNc produit, transféré ensuite dans un nouveau tube pour la PCR. Cependant, sont maintenant disponibles dans le commerce des polymérases d ADN stables à la chaleur, ayant une activité de transcriptase inverse, et des tampons dans lesquels la RT et les polymérases d ADN sont actives. Les deux permettent de réaliser une réaction de RT-PCR dans un même tube et en une séquence directe sans manipulations supplémentaires limitant ainsi les risques de contaminations. Dans la plupart des cas, il sera nécessaire d extraire et de purifier l ARN avant la transcription inverse. c) Détection d amplicon de PCR Le produit de PCR, ou amplicon, peut être détecté en utilisant une variété de procédures. La plus commune inclue une détection non spécifique des produits de PCR basée sur la taille de l amplicon en utilisant l électrophorèse en gel d agarose et la révélation de l ADN avec un colorant intercalant non spécifique, tel que le bromure d éthidium (il est possible actuellement de remplacer ce dernier par des colorants non carcinogènes comme le GelRed). Une reconnaissance spécifique de la séquence cible amplifiée peut être effectuée par transfert de l ADN en Southern blot suivi d une hybridation avec les sondes d oligonucléotides complémentaires de la séquence cible. Les sondes d hybridation peuvent être une enzyme, être chimioluminescente, ou marquée par un radionucléotide pour permettre la détection visuelle de la séquence cible spécifique. Quelques exemples de méthodes de PCR couramment utilisées sont donnés ci-dessous. 2. PCR conventionnelle La «PCR conventionnelle» (ou simplement PCR) utilise une paire d amorce d oligonucléotides pour amplifier une petite partie du génome de l agent infectieux. La sensibilité analytique est typiquement élevée avec un nombre minimum de 100 à copies de l ADN cible détectable. La spécificité analytique peut être élevée, en fonction de la sélection de la cible, le motif des amorces et le test d optimisation. La sensibilité et la spécificité analytiques peuvent, toutes les deux, être améliorées en effectuant une PCR nichée (voir le point 3 ci-dessous). Les méthodes de détection, telles que le Southern blotting suivi de l hybridation avec des sondes, peuvent encore améliorer la sensibilité et la spécificité, mais elles demandent du temps, nécessitent la manipulation au Manuel terrestre de l OIE

3 laboratoire d ADN amplifié, et l interprétation des résultats peut être techniquement subjective. Étant donné la complexité et le coût, ces méthodes de détection ne sont généralement pas considérées aujourd hui comme des procédures adaptées à une utilisation courante en laboratoire de diagnostic. 3. PCR nichée Les épreuves de PCR nichée utilisent deux jeux de cycles d amplification avec 4 amorces, désignées amorces externe et interne. En général, les épreuves de PCR nichée procurent une sensibilité et une spécificité analytiques supérieures par rapport aux épreuves de PCR conventionnelles. Cependant, il existe un risque important de contamination croisée car les produits issus du premier cycle d amplification sont souvent utilisés comme matrice de départ pour le deuxième cycle, ce qui peut entraîner des transferts de matériel entre les différents tubes de PCR. La PCR nichée a été en grande partie remplacée par des PCR en temps réel qui sont aussi sensibles mais au cours desquelles les risques de contamination sont réduits. La limite la plus faible de détection avec la PCR nichée est classiquement inférieure à 10 copies génomiques de l ADN cible. La spécificité analytique est également augmentée car dans la PCR nichée, 4 amorces d oligonucléotides doivent se lier spécifiquement avec les cibles sélectionnées afin de donner une réaction positive (4). 4. PCR en temps réel La PCR en temps réel diffère de la PCR classique car les produits amplifiés de PCR sont détectés directement pendant les cycles d amplification en utilisant des sondes d hybridation qui augmentent la spécificité de l épreuve. Des méthodes variées en temps réel, telles que TaqMan, les amorces Scorpions, le transfert d énergie résonant (FRET pour Fluorescence Resonance Energy Transfer), le transfert d énergie avec sonde-amorce (PriProET pour Primer-Probe Energy Transfer), SybrGreen, Light-Upon-eXtension (LUX) ou les techniques Molecular Beacon sont devenues des outils utilisés en routine pour la détection d agents infectieux. La PCR en temps réel a été utilisée pour la détection de bactéries, de virus ou de parasites issus d un grand éventail d espèces animales (2-4, 14, 17). Ces nouvelles techniques présentent plusieurs avantages supplémentaires par rapport aux méthodes de PCR «classiques» conventionnelles ou de PCR nichées. En général, une seule paire d amorce est utilisée, ce qui procure une sensibilité souvent proche ou égale à celle de la PCR nichée traditionnelle, mais avec un risque beaucoup plus faible de contamination. La fluorescence, indiquant la présence du produit amplifié, est mesurée à travers le couvercle ou le coté du tube de réaction et une manipulation post-pcr de l ADN amplifié n est pas nécessaire. Ces procédures prennent nettement moins de temps comparées à la détection traditionnelle du produit de PCR post-amplification en gels d agarose suivi d une révélation en bromure d éthidium ou de colorant équivalent pour la détection de l ADN, et là encore, le risque de contamination est réduit. L utilisation d un format en plaque de microtitration à 96 puits, sans besoin de PCR nichée, permet d automatiser la procédure et de l adapter à des dosages de grande envergure (10, 17). Le diagnostic peut être encore plus automatisé par l utilisation de robots pour les extractions d ADN/ARN et le pipetage. En comparaison avec les méthodes classiques d amplification, un autre avantage de la PCR en temps réel est la possibilité de réaliser une épreuve quantitative (6, 7). Avec une PCR en temps réel, le délai de diagnostic peut être réduit de quelques heures à quelques minutes. La PCR en temps réel peut aussi être utilisée comme une PCR à transcription inverse en utilisant un protocole à une étape ; cela permet aux étapes de RT et de PCR de se dérouler dans le même tube au cours du même protocole de PCR (17). 5. PCR multiplexe Les PCR utilisant des amorces multiples dirigées contre différentes cibles en une seule épreuve sont appelées épreuves de PCR multiplexe. En PCR multiplexe, des agents infectieux variés peuvent être détectés et différenciés dans un même tube et en même temps. Les différentes cibles de PCR amplifiées dans une épreuve classique de PCR sont identifiées à partir de la taille des produits de PCR. L utilisation des méthodes classiques de PCR nichée pour la construction d épreuves multiplexes est compliquée par la nécessité pour les cibles d être de différentes tailles, et par le fait que les amorces peuvent entrer en compétition dans le même mélange réactionnel. Ces deux facteurs peuvent avoir un impact négatif sur l efficacité de la PCR. En revanche, le concept de PCR en temps réel (paires d amorce unique) donne d excellentes possibilités pour la construction de systèmes multiplexes à haute sensibilité (4, 9) basés sur une taille plus uniforme des cibles, des conditions d amplification uniformes et une détection différentielle des cibles en utilisant des sondes d hybridation spécifiques marquées avec des fluorophores différents. Il convient de remarquer que des amorces communes peuvent être utilisées afin d amplifier des régions spécifiques du génome d un groupe d agents pathogènes, puis des sondes (TaqMan) fluorescentes peuvent être employées pour discriminer entre les membres de ce groupe. Il ne s agit pas d une PCR multiplexe à proprement parler, bien que cette technique soit décrite à tort comme telle. 6. Autres méthodes de diagnostic moléculaire Bien que ce chapitre concerne essentiellement le diagnostic basé sur des techniques de PCR, il convient de mentionner brièvement qu outre la PCR, il existe beaucoup de nouvelles méthodes pour la détection moléculaire des agents pathogènes comme, par exemple, les méthodes d amplification isothermiques (amplification basée 52 Manuel terrestre de l OIE 2008

4 sur la séquence des acides nucléiques [NASBA, Nucleic Acid Sequence Based Amplification], amplification isothermique par clivage invasif ou par la méthode LAMP [Loop-mediated Isothermal Amplification]), diverses épreuves avec des micro- ou macro-puces utilisant des sondes padlock, des amplifications basées sur un cycle tournant et d autres approches moléculaires. Il existe d autres approches qui sont en cours de développement pour détecter et analyser les produits de PCR comme MALDI et Luminex. L avantage de ces approches, associées avec une PCR multiplexe, est que le typage des différentes souches ou types d un micro-organisme est maintenant possible. Il est évident que la gamme des outils du diagnostic moléculaire est renforcée par ces méthodes. B. PRINCIPES DE VALIDATION DES ÉPREUVES DE DÉTECTION DES ACIDES NUCLÉIQUES Lorsque l on réalise des analyses sur du matériel clinique, il est important de fournir des données de bonne qualité. Pour cela, quelques critères clés doivent être remplis. La mise en place de systèmes d assurance qualité (AQ) et de contrôle qualité (CQ) est nécessaire, comme par exemple un ensemble de protocoles qualité, incluant l utilisation d échantillons témoins qui assure que le système fonctionne convenablement et confirme la reproductibilité des données et leur qualité. Les systèmes AQ et CQ, combinés à un personnel compétent et entraîné, ont déjà été établis dans de nombreux laboratoires de par le monde. Le test de validation est un autre facteur essentiel pour assurer que les résultats de l épreuve reflètent le statut réel des échantillons (8). Pour évaluer la performance d une épreuve de diagnostic, il est nécessaire d utiliser une méthode de validation pour documenter la performance attendue de l épreuve en question. La validation est une évaluation d une épreuve de diagnostic afin de déterminer comment l épreuve satisfait à une utilisation particulière. Les principes généraux de la validation d épreuves peuvent être trouvés dans le Chapitre , «Principes de validation des méthodes de diagnostic des maladies infectieuses». Ce chapitre étend ces principes de validation aux épreuves moléculaires de diagnostic. Pour des explications concernant des termes et des définitions, veuillez consulter le Chapitre C. VALIDITATION D UNE ÉPREUVE INTRODUCTION 1. Choix d une épreuve adaptée à son emploi futur Les épreuves de PCR peuvent être adaptées à de nombreux objectifs. Il est en général possible d utiliser la PCR chaque fois qu il faut réaliser la détection directe d un agent infectieux. Au cours des premières années du développement des techniques pour le diagnostic par PCR, de nombreux laboratoires ont été confrontés à des problèmes de performances et de contamination ; la PCR avait donc une mauvaise réputation comme technique adaptée au diagnostic. Les améliorations de ces dernières années ont inversé cette opinion. Les nouvelles technologies (par ex : la PCR en temps réel) font que la PCR est moins susceptible de donner de faux résultats du fait de contaminations et qu elle est plus facile à réaliser. En outre, l extraction automatique des acides nucléiques et les procédures de pipetage automatisées ont considérablement diminué les coûts, amélioré la répétabilité, et réduit la charge de travail. Pendant les «premières années», de nombreuses épreuves «faites maison» ont été développées par les laboratoires sans harmonisation ni validation (ou très peu). L OIE, les laboratoires nationaux et les Laboratoires de référence de l Union Européenne (ECRL, European Community Reference Laboratories) ont un grand rôle à jouer dans la conduite de programmes de validation et d harmonisation. Il convient de reconnaître que la technique de PCR telle qu elle est réalisée à l heure actuelle est sûre (les risques de résultats faussement positifs sont considérablement plus faibles), qu elle est en règle générale validée sous une forme ou une autre, et bien adaptée aux emplois pour lesquels elle est développée. Quelques exemples démontrant l importance de la PCR sont donnés ci-dessous, et les définitions du ou des objectifs peuvent être trouvées au Chapitre Permettre le diagnostic quand le titre en anticorps est si faible qu une exposition à l agent pathogène ne peut pas être confirmée par un test sérologique (par ex : le test immuno-enzymatique [ELISA] donnant à plusieurs reprises des résultats douteux lors de programmes d éradication de la leucose bovine enzootique). Assurer la distinction entre infection et immunité d origine maternelle chez les jeunes animaux (par ex : les veaux lors de programmes d éradication). Détecter l acide nucléique (bactérien ou viral) quand les prélèvements pour le diagnostic ne sont pas compatibles avec l isolement du fait de leur toxicité (par ex : le sperme, les fœtus momifiés). Manuel terrestre de l OIE

5 Dans les phases finales de programmes d éradication, quand une recherche approfondie de rares cas est nécessaire (par ex : en cas de latence avec un herpesvirus ou le dépistage des animaux faiblement réactifs au cours des programmes d éradication de la maladie d Aujeszky). Faire la distinction entre les souches vaccinales et les souches sauvages (stratégie DIVA, differentiating infected from vaccinated animals). Élaborer les relations phylogénétiques des virus et utiliser ces informations en épidémiologie moléculaire. Permettre un premier diagnostic rapide et sûre lors de l apparition de foyers (par ex : les foyers d influenza aviaire hautement pathogène en 2006). Estimer la charge virale (par ex : dans les infections à circovirus porcin type 2). Dépistage rapide des animaux vaccinés qui semblent présenter des symptômes. Détection d agents pathogènes mutants résistants aux antibiotiques, etc. Démontrer l absence d infection chez les animaux vivants ou les produits d origine animale. Cependant, il convient de remarquer que certains animaux infectés peuvent ne pas avoir d acide nucléique détectable dans les tissus examinés. 2. Considérations préliminaires sur le développement d une épreuve a) Précautions et témoins En raison de l incertitude en ce qui concerne la sûreté et la fiabilité de la PCR utilisée en routine pour le diagnostic, des précautions particulières doivent être prises dans les laboratoires utilisant cette technique pour la détection des agents infectieux afin d éviter les réactions faussement positives ou faussement négatives. Ces précautions associées à des témoins internes (imitant les résultats) garantissent une interprétation correcte des résultats, sans réponses faussement positives dues à des contaminations. Les témoins internes réels utilisant des «gènes de ménage» rentrent en compétition avec la séquence cible mais seulement pour les réactifs en excès tels que la polymérase et les nucléotides. Un minimum de compétition implique que la quantité de la cible soit connue, ce qui n est pas le cas avec les échantillons de terrain. Des ARNs «en armure» (Armored RNA ) permet au mime d être ajouté au cours de l étape d extraction, ce qui permet de savoir si l extraction a été réalisée avec succès. L inconvénient de l utilisation de «gènes de ménage» comme témoins internes est qu ils peuvent être présents en grande quantité chez les agents pathogènes recherchés. b) Précautions à prendre pour éviter des résultats faussement positifs Des réactions faussement positives (échantillons négatifs se révélant positifs lors de la PCR) peuvent survenir lors de problèmes liés au laboratoire (contaminations croisées) ou de problèmes liés à l épreuve elle-même (optimisation insuffisante des performances). Les erreurs proviennent soit du fait d un transfert de produit à partir d un échantillon positif soit, et c est le cas le plus fréquent, du fait d une contamination croisée à partir de produits issus d expériences précédentes, et divers protocoles et équipements ont été utilisés pour éviter des réactions faussement positives. Les échantillons et les réactifs doivent être manipulés dans des hottes à flux laminaire séparées, hottes qui sont par ailleurs régulièrement décontaminées par des rayons UV (l utilisation de la lumière ultra-violette exige un bon entretien pour être efficace) ou de l eau de Javel. La mise au point et l utilisation de portoirs et d instruments pour ouvrir les tubes peuvent prévenir les résultats faux-positifs (2). En outre, il convient d appliquer les bonnes pratiques de laboratoire notamment pour les étapes élémentaires (extraction de l ADN, préparation du mélange réactif et des amorces, préparation des échantillons, électrophorèse sur gel d agarose des produits de l amplification, etc.) qui devront être réalisées dans des zones différentes du laboratoire ou dans des locaux distincts (Fig. 1 ; référence 1, 4, 17). Il faut aussi utiliser des lots différents de pipettes au cours de chaque étape. L utilisation d une pression positive ou de pointes à filtre est recommandée. Les différentes étapes devraient, dans la mesure du possible, être réalisées par des personnes différentes, chacune d entre elles étant confinées à des zones limitées du laboratoire. Le maximum de précautions doit être pris pour éviter l introduction de produits d amplification dans les zones «propres» du laboratoire à partir de zones du laboratoires potentiellement contaminées en interdisant les échanges de papiers, de matériel, de personnes ou de tout autre vecteur de contamination. Les mouvements en sens inverse ne devraient être possibles qu après décontamination des surfaces, des équipements, des tubes, etc., et après changement des blouses et des gants. Si l on suspecte que l échantillon contient une grande quantité d agent pathogène ou d acide nucléique, il est préférable de le diluer avant son introduction dans les zones «propres» du laboratoire. 54 Manuel terrestre de l OIE 2008

6 Figure 1. Organisation recommandée pour un laboratoire réalisant des diagnostics avec des PCR en temps réel. Les échantillons à tester sont transférés dans la «salle de préparation» pour l extraction des acides nucléiques. Le mélange réactionnel pour la PCR est préparé dans la «salle propre» et transféré dans la «salle de préparation» pour réaliser la répartition dans les plaques de PCR et l addition de la matrice. Les plaques ou les tubes prêts pour la réaction sont alors transférés dans la «salle des appareils» pour réaliser la PCR. La «salle propre» n est utilisée que pour la préparation du mélange réactionnel de la PCR ; il est interdit d y introduire de l ADN ou des produits d amplification. Il est recommandé de disposer avant la «salle propre» d un sas hermétique dans lequel le personnel peut prendre les blouses et les chaussures uniquement utilisées dans cette salle. La «salle de préparation» ne sert qu au traitement des échantillons et à la mise en place de la PCR (avec le mélange réactionnel préparé dans la «salle propre»). Il est interdit d introduire dans cette salle des produits d amplification et rien de ce qui vient de la «salle de préparation» ne doit être introduit dans la «salle propre». Les thermocycleurs de trouvent dans la «salle des appareils» et aucun produit ne peut retourner de cette salle vers la «salle propre» ou la «salle de préparation». Si le laboratoire possède un système de contrôle de la pression de l air, la «salle propre» doit être en surpression par rapport aux autres salles. S il est prévu de réaliser des PCR nichées, il est recommandé d ajouter 2 autres salles. Une «deuxième salle de PCR» pour préparer la deuxième réaction de PCR (ce qui implique la manipulation de produits d amplification ce qui interdit donc de le faire dans la «salle de préparation), ainsi qu une «salle d électrophorèse» pour l analyse des produits sur gel d agarose. Il est aussi extrêmement important d inclure des témoins négatifs, par exemple des échantillons semblables à l échantillon à tester mais qui ne contiennent pas la cible. Dans les laboratoires qui ont des problèmes de contaminations croisées, il est recommandé d inclure au moins un témoin négatif pour 5 échantillons à tester. En outre, il convient d inclure en routine des échantillons témoins tant négatifs que positifs dans des échantillons à tester pour estimer les performances de l épreuve de PCR. c) Précautions à prendre pour éviter des résultats faussement négatifs La PCR s est avérée une méthode très efficace pour détecter les acides nucléiques, comme le génome viral dans des échantillons cliniques. Cependant, dans les phases terminales de l infection, un animal peut ne plus héberger d acide nucléique dans les tissus soumis à l épreuve. Dans ces cas, les résultats négatifs en PCR doivent, par conséquent, être considérés comme un élément d un processus complexe de diagnostic. Les résultats faux-négatifs (les échantillons contenant l agent d intérêt mais détectés comme négatifs) surviennent majoritairement à cause d effets inhibiteurs et/ou d erreurs de pipetage, cependant des mauvaises manipulations de l échantillon peuvent aussi être à l origine de tels résultats. De ce fait, des témoins internes sont utilisés comme indicateurs d efficacité de l épreuve de PCR. Les témoins internes de PCR peuvent comprendre de l ADN étranger ajouté à l échantillon ou de l ADN ubiquitaire présent naturellement dans l échantillon. De l ADN étranger ajouté à l échantillon, peut comprendre des mimes d ADN ou d ARN. Les mimes d ADN, oligonucléotides de synthèse, ont les mêmes séquences de liaison d amorce que les cibles de PCR, mais encadrent un fragment d ADN hétérologue d une taille différente. Les séquences de nucléotides identiques de liaison d amorce permettent la co-amplification de la cible et du mime dans le même tube avec une compétition minimale. Les différences de taille donnent une discrimination facile par une analyse en Southern blot. L Armored RNA, un concept identique aux mimes ADN, utilise un fragment d ARN témoin enveloppé dans des protéines d enveloppe de bactériophage pour protéger et stabiliser l ARN pour le contrôle ou la normalisation des épreuves de RT-PCR (pour plus de détails sur les témoins, voir ci-dessus). Manuel terrestre de l OIE

7 Avec les épreuves de PCR en temps réel, il est également possible d utiliser des témoins internes, un gène ubiquitaire naturellement trouvé, un fragment sélectionné du génome de l animal hôte tel que l actine béta, GAPDH, ou l ARN ribosomique. En utilisant en multiplexe un tel témoin intrinsèque coloré avec un fluorophore rapporteur particulier, il est possible de tester la qualité de l échantillon et de confirmer l efficacité de la PCR, puisque l agent cible et l ADN intrinsèque sont détectés simultanément (14). Les témoins internes (comme les mimes) augmentent la fiabilité du diagnostic par PCR (1, 4). Une précaution doit être prise lorsque l on choisit et valide les témoins internes. Un contrôle important est nécessaire pour s assurer que l amplification de PCR du témoin interne ajouté n entre pas en compétition avec la PCR du diagnostic et de ce fait ne diminue pas la sensibilité analytique. Les témoins internes sont utilisés à des concentrations légèrement supérieures à la limite de détection du diagnostic PCR pour s assurer de la performance de l épreuve. Il faut également se rappeler que les témoins internes ont un inconvénient similaire aux échantillons extrêmement infectés et non représentatifs d acides nucléiques cibles et peuvent conduire à des résultats faux-négatifs. d) Préparation des étalons Les laboratoires de référence doivent fournir des échantillons de référence représentatifs d un agent infectieux donné. De tels échantillons peuvent être des agents infectieux cultivés ou des prélèvements cliniques, etc., qui sont distribués de telle sorte que l agent infectieux soit bien conservé. Ainsi, les échantillons sont distribués sous forme congelée, dans des solvants organiques (ex. Trizol) ou par d autres moyens adaptés. Les échantillons peuvent également être envoyés sous forme d acides nucléiques (congelés, déshydratés ou en éthanol). Pour des détails plus spécifiques, il faut se reporter aux chapitres concernant individuellement les maladies. Les laboratoires de référence doivent également fournir les mimes appropriés. La disponibilité d échantillons de référence est essentielle pour le succès du processus de validation. Il s agit, malheureusement, du problème le plus délicat à résoudre lorsque l on planifie une procédure de validation. Il ne suffit pas d utiliser des agents pathogènes cultivés ou des échantillons expérimentaux ; de vrais échantillons provenant du terrain peuvent présenter des caractéristiques différentes de celles des échantillons provenant du laboratoire. Il peut être difficile d obtenir des échantillons du terrain qui soient vraiment négatifs ou positifs du fait, notamment, que la PCR est généralement considérée comme ayant une sensibilité analytique supérieure à toutes les méthodes de référence («gold standard»), ce qui rend difficile la détermination avec d autres méthodes du statut des échantillons prévus pour la validation. Comme cela a été déjà signalé, les laboratoires de référence peuvent fournir de tels échantillons de référence. Une autre méthode consiste en l utilisation des méthodes Bayésiennes qui offrent une approche probabilistique pour valider les tests diagnostics en l absence de «gold standard» (5) ; ces méthodes ne sont pas abordées plus avant dans ce chapitre. D. VALIDATION D UNE ÉPREUVE PREMIÈRE ÉTAPE 1. Optimisation et normalisation des réactifs et détermination des paramètres critiques de contrôle La collecte d échantillon, la préparation et le transport (se reporter au Chapitre , «Prélèvement et expédition des échantillons pour le diagnostic» de ce Manuel terrestre) et les méthodes d extraction d acide nucléique (se reporter au Chapitre , «Les biotechnologies dans le diagnostic des maladies infectieuses et le développement des vaccins») sont tous des paramètres critiques dans la performance d une épreuve et doivent être optimisés pour le diagnostic des maladies. Les méthodes adaptées varient en fonction du type d échantillon et d organisme. En général, le sérum sanguin, les tissus et les écouvillons sont des échantillons adaptés à une extraction facile des acides nucléiques, alors que les échantillons de fèces, les échantillons autolysés et la semence sont plus difficiles à manipuler. L extraction des cibles à ARN diffère de l extraction de cibles à ADN et l ARN est plus enclin à la dégradation. Les méthodes commerciales (robotisées, colonnes de centrifugation, extractions basées sur le magnétisme, etc.) et les méthodes de base reposant sur la chimie sont utilisées pour l extraction d ARN et d ADN. Il est crucial de déterminer la méthode d extraction la plus reproductible et efficace avant de poursuivre la validation d une épreuve. Si la méthode d extraction est changée, des données équivalentes doivent être obtenues ou bien il faut répéter entièrement la procédure de validation. Tout l équipement utilisé au cours du processus doit être correctement entretenu. Les appareils (blocs de chauffage, réfrigérateurs, congélateurs, thermocycleurs, pipettes, etc.) qui nécessitent un étalonnage doivent être étalonnés en accord avec les protocoles d assurance qualité du laboratoire. Il aussi important de valider correctement le matériel et le protocole employé. Un bon exemple en est la généralisation des méthodes robotisées d extraction dans les procédures de diagnostic de routine. Il ne suffit pas de comparer les caractéristiques de cette technique avec celles des autres méthodes d extraction utilisées. Le robot et le protocole 56 Manuel terrestre de l OIE 2008

8 doivent être validés pour vérifier qu il n existe pas de risque de contamination croisée, par ex. : travailler sur un mélange d échantillons positifs et négatifs. Au cours du développement d épreuves de PCR «classique» ou en temps réel, tous les paramètres, protocoles et réactifs doivent être optimisés. Une épreuve normalisée est une technique qui donne de façon constante le même résultat à partir d un échantillon donné quand elle est répétée plusieurs fois et réalisée par du personnel différent dans des laboratoires différents. Au cours de l optimisation de l épreuve de PCR, il est également possible d estimer la capacité de la méthode à ne pas être affectée par de petits changements dans les paramètres principaux. Une documentation sur les variations intentionnelles au cours de l exécution d une épreuve est nécessaire pour caractériser les paramètres critiques de l épreuve. Des exemples de tels paramètres incluent : temps et température d incubation, concentrations des tampons, des amorces, du MgCl 2, du ph, et du taux d autres composants ajoutés (ex : dntp, sérum albumine bovine, etc.). La caractérisation des paramètres critiques de contrôle est cruciale pour identifier ce qui doit être correctement contrôlés au cours de l épreuve. Des variations intentionnelles de l épreuve peuvent conduire à une estimation préliminaire de la robustesse de l épreuve. 2. Répétabilité Un accord entre les répétitions au sein et entre les réalisations d une épreuve doit être convenu à cette étape. Cela donne une information importante sur l épreuve avant de poursuivre la validation. Si une variabilité excessive est mise en évidence, elle doit être corrigée avant de continuer le processus de validation. La répétabilité d une épreuve de PCR nécessite que chaque réplicat soit traité comme un échantillon indépendant. Du fait de la variation d un réplicat (en fait, un triplicat), 3 fractions aliquotes d un sujet d analyse de départ sont préparées et amplifiées, et la variation de la valeur moyenne est déterminée comme un indicateur de la répétabilité. Il est, par conséquent, inacceptable d estimer les amplifications des triplicats à partir d une seule extraction. De même, les réplicats de plusieurs essais doivent être traités comme des échantillons individualisés. Cette procédure conduira à des estimations de la variabilité intra- et inter-épreuves. Dans une épreuve de PCR en temps réel, les valeurs Ct obtenues à partir des échantillons répliqués peuvent être utilisées pour déterminer le coefficient de variation entre essais (CV ; voir Chapitre , «Gestion de la qualité dans les laboratoires de diagnostic vétérinaire», section 6.d) «Incertitude»). Il est important que le sujet d analyse à détecter par PCR soit dans la même matrice que les échantillons à tester destinés à être utilisés dans l épreuve. Si, par exemple, l épreuve est utilisée pour démontrer l absence d un agent pathogène dans une matrice connue pour ses propriétés inhibitrices dans la PCR (telle que la semence et les diluants), il est particulièrement important d évaluer soigneusement la répétabilité. Quand de nouveaux lots de nucléotides ou d autres réactifs provenant de nouveaux fabricants sont employés dans l épreuve, la répétabilité de l épreuve doit à chaque fois être établie à nouveau. 3. Détermination de la spécificité et de la sensibilité analytiques La sensibilité analytique (ou limite de détection) est définie comme la capacité à distinguer l agent pathogène ciblé d autres agents infectieux. Cette capacité est déterminée par l analyse d agents pathogènes génétiquement apparentés et de matériel clinique obtenus d animaux atteints par des maladies qui ressemblent à celle pour laquelle l épreuve est prévue. Il est préférable d obtenir des échantillons de terrain à partir d animaux infectés, mais cela peut se révéler difficile voire impossible. Dans ces cas, il est possible d utiliser des virus cultivés sur cultures cellulaires. Le degré acceptable de réactivité croisée dépend en grande partie de l objectif poursuivi par le test et doit être établi pour chaque cas. Il est utile de réaliser des études «par ordinateur» en complément des estimations par le laboratoire. La sensibilité analytique (ou limite de détection) est définie comme le plus faible taux d agent détecté par l épreuve, et peut être représentée par le nombre de copies du génome, la dose infectieuse, les unités formant colonies, les unités formant plaque, etc., de l agent pathogène qui peut être détecté et distingué d un résultat nul. Pour déterminer la sensibilité analytique, une dilution en cascade est utilisée jusqu à ce que l épreuve ne puisse plus détecter la cible en question dans plus de 5 % des replicats. Les fragments clonés des produits de PCR en question peuvent être utilisés comme échantillons de référence, soit comme ADN ou comme ARN cible, l ARN étant transcrit in vitro en ADN. Les estimations de la sensibilité analytique peuvent varier significativement pour la même épreuve quand différentes matrices échantillons sont utilisées. Lorsqu on réalise des séries de dilution, il est important d employer un diluant dont les qualités sont semblables à la matrice échantillon, par exemple, dilution d une semence positive dans de la semence négative et non dans un tampon. Manuel terrestre de l OIE

9 E. VALIDATION D UNE ÉPREUVE SECONDE ÉTAPE Les caractéristiques d exécution (ou paramètres de l épreuve) apportent les informations sur la façon dont la méthode fonctionne dans des conditions spécifiques. Quelques unes des caractéristiques d exécution sont données dans le Chapitre Estimation des performances de l épreuve a) Populations animales de référence i) Animaux de référence non infectés / non exposés Des échantillons réellement négatifs, c est-à-dire provenant d animaux qui n ont pas pu être exposés à l agent pathogène sont parfois difficiles à obtenir. Il est souvent possible de récolter des échantillons dans des pays qui ont éradiqué la maladie en question. Il est important que les échantillons négatifs soient représentatifs des échantillons qui seront analysés (espèces, âges, sexes, races, etc.). ii) Animaux de référence infectés / exposés Trouver des animaux positifs de référence en nombre suffisant peut poser problème. Des animaux naturellement ou expérimentalement infectés sont nécessaires dont le statut positif est démontré par isolement de l agent pathogène. Avant de recourir à des animaux expérimentalement infectés, voir le Chapitre iii) Statut de l animal de référence établi par d autres épreuves Le terme «gold standard» est couramment utilisé pour décrire toute épreuve étalon servant à la comparaison mais devrait être réservé aux méthodes qui classent de façon univoque les animaux en infectés ou non-infectés. En général, on considère que les nouveaux tests de PCR sont meilleurs que tous les «gold standard» actuellement existants et le «gold standard» retenu peut, par conséquent, ne pas être adapté pour la comparaison. Ceci est particulièrement vrai lorsqu il s agit de démontrer qu un animal négatif de référence est vraiment négatif. La validation des techniques moléculaires en les comparant à un «gold standard» peut être compliquée du fait que les PCR sont plus sensibles, ce qui entraîne une spécificité apparente plus faible. Ce problème peut, dans une certaine mesure, être résolu par une bonne appréciation de l origine des échantillons, l historique de la maladie et en séquençant tous les produits d amplification de la PCR pour confirmer l identité de l agent pathogène. 2. Détermination du seuil de coupure La sensibilité du diagnostic (Se-D : proportion d animaux de référence connus pour être infectés, connus, qui sont détectés comme positifs dans l épreuve) et la spécificité du diagnostic (Sp-D : proportion d animaux de référence non-infectés et qui sont détectés comme négatifs dans l épreuve) sont les paramètres les plus importants obtenus au cours de la validation d une épreuve. Le nombre d échantillons de référence requis pour déterminer l estimation et l erreur admissible de la Se-D et la Sp-D peut être calculé. Pour cela, une prédiction raisonnable de la Se-D et la Sp-D doit être utilisée. Généralement, la confiance dans l estimation est posée à 95 %. Cependant, aucune formule ne prend en compte les nombreux facteurs hôte/organisme qui peuvent affecter le résultat d une épreuve. Le nombre d échantillons pour déterminer l estimation de la Se-D et la Sp-D est indiqué dans le Chapitre En pratique, il peut être difficile d obtenir un nombre suffisant d échantillons pour calculer un intervalle de confiance satisfaisant, particulièrement dans le cas d une maladie non endémique ou répandue ; mais avec le temps, des données supplémentaires améliorent l estimation du seuil de confiance. L utilisation d échantillons expérimentalement infectés n est pas appropriée car cela peut ne pas être représentatif d échantillons naturellement infectés. Si des échantillons provenant d animaux naturellement infectés ne sont pas disponibles, des infections expérimentales réalisées par des moyens qui se rapprochent des infections naturelles peuvent fournir des échantillons utiles. Un exemple est donné par les maladies transmises par des tiques et pour lesquelles les animaux sont exposés à des tiques. Il n est pas toujours possible de se conformer aux lignes directrices (par ex. : les recommandations de l OIE pour la validation des tests). Lorsque l on ne possède qu un petit nombre d échantillons pour une évaluation d un test ou en l absence d un «gold standard», une approche consiste à déclarer une épreuve moléculaire comme «partiellement validée» puis à améliorer la validation quand un nombre significatif d échantillons cliniques est testé. Dans ce cas, les échantillons positifs sont confirmés par d autres techniques, telles que l isolement de l agent pathogène en question ou le séquençage ; on vérifie aussi que les échantillons négatifs conviennent à l épreuve de PCR (non inhibiteurs) en utilisant les gènes de contrôle. Le principe de cette validation «en cours de route» permet l introduction rapide de nouvelles épreuves et la réduction des coûts de la validation. Cette approche n est possible que si des tests sur une gamme appropriée de cultures, d échantillons artificiellement préparés (pour les données analytiques) et d échantillons cliniques (pour démontrer que la cible est présente dans les tissus) apportent des arguments sérieux pour considérer que l épreuve peut être diffusée comme «partiellement validée» (15). 58 Manuel terrestre de l OIE 2008

10 F. VALIDATION D UNE ÉPREUVE TROISIÈME ÉTAPE 1. Établir la reproductibilité de l épreuve La reproductibilité est un paramètre important de la précision d une épreuve. Elle est déterminée dans plusieurs laboratoires qui utilisent la même procédure (protocole, réactifs et témoins). Au moins 3 laboratoires réalisent l épreuve sur le même panel d échantillons (un minimum de 20 échantillons), avec des fractions aliquotes identiques distribuées dans chacun des laboratoires. Cette opération fournira des informations sur la robustesse de l épreuve. Les estimations de la reproductibilité sont essentielles avant que l épreuve puisse être distribuée à d autres laboratoires. À l heure actuelle, la reproductibilité n est que rarement évaluée complètement dans les laboratoires de diagnostic vétérinaire qui réalisent des PCR. Dans le passé, beaucoup de laboratoires ont utilisé des épreuves mises au point dans ces mêmes laboratoires, vraisemblablement pour des raisons pratiques. Il convient, lorsque c est possible, d appliquer des techniques publiées et normalisées, notamment par les Laboratoires de référence de l OIE, les Laboratoires de référence de l Union Européenne ou les laboratoires nationaux. En outre, des procédures de validation inter-laboratoires doivent être conduites afin de normaliser les épreuves et d harmoniser les activités de diagnostic entre les différents pays. G. VALIDATION D UNE ÉPREUVE QUATRIÈME ÉTAPE 1. Mise en œuvre du programme Les Laboratoires de référence jouent un rôle essentiel dans la mise en œuvre de nouvelles épreuves moléculaires ou d épreuves déjà existantes en cours de validation. Il est instamment demandé aux Laboratoires de référence de l OIE, aux Laboratoires de référence de l Union Européenne et aux laboratoires nationaux d aider à la généralisation de ces épreuves pleines de promesses pour le diagnostic des maladies. Un exemple en est l assistance apportée par les laboratoires de l OIE dans le diagnostic de la grippe aviaire en Europe par des méthodes moléculaires. 2. Suivi de la validité des performances de l épreuve a) Interprétation des résultats de l épreuve facteurs affectant la validité de l épreuve Un facteur essentiel qui affecte l interprétation des résultats de l épreuve est la prévalence du sujet d analyse dans la population cible. Même une épreuve de PCR très précise et exacte avec une Se-D et une Sp-D approchant 99 % peut néanmoins conduire à de fausses conclusions (voir Chapitre 1.1.4). En ce qui concerne les épreuves basées sur les acides nucléiques, les résultats faussement positifs sont particulièrement préoccupants dans les populations ayant une faible prévalence. Dans ces cas, il peut être nécessaire de confirmer les résultats positifs en PCR par l analyse des séquences du produit d amplification afin de corriger d éventuelles erreurs dues à des cibles ou une fixation des amorces non spécifiques. b) Maintien des critères de validation Quand l épreuve est utilisée en routine, il est important d assurer un contrôle de qualité interne. L épreuve doit donc être suivie et contrôlée constamment pour la répétabilité et l exactitude. L OIE recommande que des estimations de la reproductibilité entre laboratoires (organisation de tests de compétence inter-laboratoires) soient conduites au moins 2 fois par an (16). Cette procédure est, en général, menée par un laboratoire de référence qui distribue les panels d échantillons, récupère les résultats des laboratoires, analyse les données et rédige un rapport envoyé aux laboratoires. Si une épreuve doit être appliquée dans une autre région géographique et/ou population, il peut s avérer nécessaire de revalider ou de documenter son équivalence dans les nouvelles conditions. La revalidation ou l équivalence devrait être déterminée si l épreuve est appliquée à une matrice différente d échantillons, par ex. validé sur sang et utilisé sur un autre tissu, ou validé sur des tissus de bovins et utilisé sur une autre espèce. Des protocoles différents d extraction peuvent être nécessaires si des espèces ou des tissus différents sont testés, car certains peuvent contenir des facteurs inhibiteurs différents. Ceci est particulièrement vrai pour des épreuves PCR puisqu il est commun que des mutations ponctuelles surviennent dans de nombreux agents pathogènes (par exemple les virus à ARN). Les mutations, qui peuvent survenir au sein de sites d amorces ou de sondes, peuvent affecter l efficacité d une épreuve et de ce fait les critères établis de performance ne sont plus valides. Il est également recommandé de confirmer régulièrement la séquence cible dans les régions génomiques sélectionnées pour des isolats nationaux ou régionaux d agents infectieux. Ceci est particulièrement vrai pour les sites d amorce, pour s assurer qu ils restent stables et que, de cette manière, la validation d une épreuve ne peut pas être mise en question. La validation et l estimation de la robustesse Manuel terrestre de l OIE

11 peuvent nécessiter d être répétées lorsque l épreuve est transférée du laboratoire qui le développe vers le terrain car les conditions peuvent être inférieures aux conditions optimales et le personnel moins bien formé. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BALLAGI-PORDÁNY A. & BELÁK S. (1996). The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR. Mol. Cell. Probes, 10, BELÁK S. & THORÉN P. (2001). Molecular diagnosis of animal diseases. Expert Rev. Mol. Diagn., 1, BELÁK S. (2005). The molecular diagnosis of porcine viral diseases: a review. Acta Vet. Hung., 53, (Review). 4. BELÁK S. (2007). Molecular diagnosis of viral diseases, present trends and future aspects. A view from the OIE Collaborating Centre for the Application of Polymerase Chain Reaction Methods for Diagnosis of Viral Diseases in Veterinary Medicine. Vaccine, 25, BRANSCUM, A.J., GARDNER I.A. & JOHNSON W.O. (2005). Estimation of diagnostic-test sensitivity and specificity through Bayesian modelling. Prev. Vet. Med., 68, BURNS M.J., NIXON G.J., FOY C.A. & HARRIS N. (2005). Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods - evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC Biotechnol., 5, BUSTIN S.A. (2005). Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Rev. Mol. Diagn., 5, BURKHARDT H.J. (2000). Standardization and quality control of PCR analyses. Clin. Chem. Lab. Med., 38, ELNIFRO E.M., ASHSHI A.M., COOPER R.J., & KLAPPER P.E. (2000). Multiplex PCR: optimization and application in diagnostic virology. Clin. Microbiol. Rev., 13, JUNGKIND D. (2001). Automation of laboratory testing for infectious diseases using the polymerase chain reaction our past, our present, our future. J. Clin. Virol., 20, HUGGETT J., DHEDA K., BUSTIN S. & ZUMLA A. (2005). Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. Genes Immun., 6, (Review). 12. LAUERMAN L.H. (2004). Advances in PCR technology. Anim. Health Res. Rev., 5, (Review). 13. LOUIE M., LOUIE L. & SIMOR A.E. (2000). The role of DNA amplification technology in the diagnosis of infectious diseases. CMAJ., 163, MACKAY I.M., AARDE K.E. & NITSCHE A. (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res., 30, SAWYER J., WAKELEY P., WEST D., FEARNLEY C., ANDERSON S., FLOWERS M., WEBSTER K., ERRINGTON J. & WILLIAMS R. (2006). Discussion 324-5, Practical experiences of moving molecular diagnostics into routine use at the Veterinary Laboratories Agency. Dev. Biol. (Basel), 126, WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH (OIE) (2002). OIE Guide 3: Laboratory Proficiency Testing. In: OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. OIE, Paris, France, VILJOEN G.J., NELL H & CROWTHER J.R. (2005). Molecular Diagnostic PCR Handbook. IAEA-FAO, Springer, Dordrecht, The Netherlands. * * * NB : Il existe un Centre collaborateur de l OIE pour le diagnostic basé sur la biotechnologie des maladies infectieuses en médecine vétérinaire (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l OIE pour une liste actualisée : 60 Manuel terrestre de l OIE 2008