Introduction à la Génomique. 1. Les outils de base. 1. Les outils de base 2. Les techniques d hybridation

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1 Introduction à la Génomique 1. Les outils de base 2. Les techniques d hybridation Southern blot et dérivés, micro arrays 3. La PCR 4. Les marqueurs polymorphes 5. Le clonage positionnel 1. Les outils de base Les enzymes Techniques de marquage Electrophorèse Enzymes de biologie moléculaire Enzymes de restriction = endonucléases Ligase Phosphatase Kinase ADN pol fragment de klenow (activité exonucléase) T4 DNA pol Digestion par enzymes de restriction extrémités cohésives EcoRI GAATTC G AATTC CTTAAG CTTAA G PstI CTGCAG CTGCA G GACGTC G ACGTC extrémités franches HaeIII GGCC GG CC CCGG CC GG 1

2 Formation de molécules d ADN recombinant AmpR digestion Les enzymes de restriction permettent de couper l ADN en des endroits précis (reconnaissance de séquences le plus souvent palindromiques) La ligase permet de «coller» deux fragments d ADN avec des extrémités compatibles insert L animation suivante (DNA restriction) peut être visualisée ou téléchargée ici : restriction (Ampicilline) Techniques de Marquage Différentes types de marquage Radioactif 32 P : exposition courte (24h, très sensible), 1/2 vie = 15 jours, rayonnement ß- important (taches diffuses) 35 S : exposition 1 semaine, 1/2 vie = 3 mois, moins de rayonnement ß- important (taches plus nettes) 3 H : rayonnement ß- très faible (taches très nettes), exposition plusieurs semaines (utilisé pour hybridation in situ) Froid Biotine - streptavidine + anticorps Nucléotides couplés à des fluorochromes Stratégies de Marquage Random Priming (amorçage au hasard) 3 3 Penser à dénaturer la sonde (100 C) avant utilisation C dctp* datp dttp dgtp 25 C, hybridation Toutes les séquences Avec les amorces De 6 bases possibles (hexamères aléatoires) ADN polymérase I, Fragment de Klenow (pas d activité exonucléase) 3 3 2

3 Stratégies de Marquage Nick Translation (déplacement de coupure) Stratégies de Marquage Marquage d oligonucléotide synthétique Dnase I (création de cassures simple brin) ADN polymérase I (action - exonucléase) P OH OU OH OH T4 polynucléotide kinase P P P -Ribose γ β α -Adénine (γ32 P ATP) Penser à dénaturer la sonde (100 C) avant utilisation.. dctp* datp dttp dgtp ADN polymérase I, (activité polymérasique) P OH Electrophorèse en gel d agarose Coulage du gel Electrophorèse en gel d agarose Chargement du gel 3

4 Electrophorèse en gel d agarose Electrophorèse en gel d agarose cette animation (gel electrophoresis) peut être visualisée ici : cathode anode Gel Photo (top view) Interaction ADN + molécule intercalante fluorescente (Bromure d éthidium (BET) ou mégafluor) L ADN devient «visible» sous les UV Electrophorèse (gel d agarose) Introduction à la Génomique Cathode Paires de bases Anode 1 2 Poids moléculaire (échelle logarithmique) Migration en mm (par rapport au puits) 1. Les outils de base 2. Les techniques d hybridation Southern blot et dérivés, micro arrays 3. La PCR 4. Les marqueurs polymorphes 5. Le clonage positionnel 4

5 2. Hybridation moléculaire : Principe 2. Hybridation moléculaire : Principe % simple brin 100% 50% Dénaturation : Chauffer à une température > Tm (faire bouillir ) Hybridation : Température < Tm (refroidissement lent ) Refroidissement rapide : les molécules restent sous forme simple brin (ex : SSCP) Tm température Tm : température de fusion (melting) Facteurs influençant Composition en bases (% GC) ADN < 30bases : Tm = 2(A+T) + 4(G+C) Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C) - (650/ longueur) Ex : oligonucléotide 20 bases (10 AT, 10 GC) Tm1 = 2(10) + 4(20) = 60 C Tm2 = 69,3 + 0,41*50 - (650/20) = 57,3 C Facteurs influençant Longueur des Fragments Présence de mésappariements Tm : - 1 C par % de mésappariement Influence du milieu Concentration en sels (cations) Plus la concentration en cation est basse, plus la double hélice est instable, plus l hybridation demandera de spécificité : hybridation «stringente» (à 0,2M en ion Na+) 5

6 Applications : Southern Blot 1. Les échantillons d ADN digérés par enzyme de restriction sont chargés sur un gel d électrophorèse Applications : Southern Blot Puits 1 : Marqueurs de taille radioactifs Puits 2 : ADN digéré par l enzyme A Puits 3 : ADN digéré par l enzyme B Gel d électrophorèse 4. Après incubation dans une solution de blocage, la membrane est placée dans un sac plastique scellé avec une solution contenant la sonde marquée Sonde radioactive L ADN est dénaturé Le gel est placé sur une éponge 2. Les différents fragment d ADN sont séparés par électrophorèse mais invisibles Poids Papier absorbant Membrane Gel Eponge Tampon 3. Membrane, papier absorbant et poids sont placés sur le gel. Le tampon remonte par capillarité et transfère les fragments d ADN du gel vers la membrane 5. La membrane est lavée pour enlever la sonde non hybridée, séchée, puis mise en contact avec un film d autoradiographie Autoradiogramme : Autoradiographie Les marqueurs sont révélés car radioactifs Puits 2 et 3 : seules les bandes hybridées avec la sonde sont révélées. Applications : Dot blot Dépôts des ADN directement sur membrane Pas d information sur la taille des fragments Sondes = oligonucléotides marqués Applications : Dot blot Dot blot : hybridation différentielle avec les oligosondes spécifiques de l allèle normal (a) et de l allèle muté (b, mutation F508) du gène CF responsable de la mucoviscidose (ASO : Allele-specific oligo) Ex: mucoviscidose. Mutation la plus fréquente: GAA AAT ATC ATC TTT GGT GTT glu asn ile ile phe gly val a b F508 GAA AAT ATC ATT GGT GTT glu asn ile ile gly val Deux oligonucléotides : - séquence normale - séquence mutée m+ : ADN témoin non muté m- : ADN témoin F508 homozygote 6

7 Applications : northern blot Principe identique au Southern blot Mais : ARN, petite taille, pas de digestion Sonde utilisée, ARN ou ADN Applications : étude de l expression des gènes en fonction des tissus Applications : Les puces à ADN (DNA microarrays, DNA chips) Immobilisation des séquences connues (sondes) sur un support Ajout d un mélange de séquences inconnues (cible) marquées Détection de l hybridation par la présence de marquage fixée sur la puce Les étapes d une expérience Choix de la sonde (oligos, ADNc, chromosome,...génome entier ) Fabrication de la puce (fixation de la sonde) Fabrication de la cible (ARNm --> ADNc fluorescent) Hybridation Lecture et analyse informatique Micro Arrays, un exemple : Quels gènes de levure sont exprimés en aérobie et/ou en anaérobie Saccharomyces cerevisiae, génome entièrement séquencé, ~ 6000 gènes 7

8 Préparation des ARNm Synthèse des ADNc amorce = poly dt, transcriptase inverse Culture des cellules (conditions différentes) +O 2 + RNase -O 2 Extraction des ARNm +O 2 -O 2 +O 2 -O 2 Mélange des ADNc Ajout des ADNc sur la puce-1 +O 2 Puce à ADN (un point = une séquence codante. Levure, 6000 gènes, donc 6000 points) -O 2 -O 2 +O 2 8

9 Ajout des ADNc sur la puce-2 Hybridation Lavage Lecture de la puce Insertion de la puce dans le système de lecture (laser) Analyse de la fluorescence +O 2 -O 2 aérobique Exprimé ± O 2 anaérobique +O 2 -O 2 Image superposée (merged) résultat Applications : Hybridation in situ Puce contenant tous les gènes de levure (S. cerevisiæ) Coupes de tissus, embryons de drosophile, chromosomes Sondes radioactives ou fluorescentes L utilisation des fluorochromes permet de combiner plusieurs sondes + ADNc ±O 2 9

10 Applications : Hybridation in situ Exemple : embryon de drosophile, 2 sondes s hybridant aux ARNs de 2 gènes de développement (ftz et wg) Translocation entre chromosomes 1 et 6 chez le porc mise en évidence par FISH Introduction à la Génomique 1. Les outils de base 2. Les techniques d hybridation Southern blot et dérivés, micro arrays 3. La PCR 4. Les marqueurs polymorphes 5. Le clonage positionnel 3. Polymerase chain reaction Principe Matériel et méthodes Limites et précautions Applications Conclusion 10

11 Principe PCR = Amplification spécifique in vitro d un segment particulier d ADN à partir d un mélange de séquences PCR 1 génome 1 génome + 2 n copie de la séquence recherchée PCR : Matériel ADN matrice ADN polymérase datp, dgtp, dttp et dctp (dntp) 2 Amorces Tampon (MgCl 2 ) PCR : Principe PCR : Méthodes Voir Animations Température d hybridation : Inférieure de ~5 C au Tm des amorces ADN polymérase thermorésistante (par ex : Taq polymérase (extraite de Thermus aquaticus) pour résister aux passages successifs à 94 C) 11

12 PCR : résultat Choix des amorces : Séquence d une partie du gène mitochondrial «cytb» du lynx (Lynx lynx) -taaacttatttacccccttcatattaaccgcaatgtttatcctactt -atttgaataaatgggggaagtataattggcgttacaaataggatgaa ttacctatcattatatctaacacccaactatataaaaatagcctatatcc aatggatagtaatatagattgtgggttgatatatttttatcggatatagg tcattacgtaaaaaccacaatctcctatgcctttactatcagcatgatcc agtaatgcatttttggtgttagaggatacggaaatgatagtcgtactagg cgactataatattcatctcttcagggcaggaaacagttatctcaaactga gctgatattataagtagagaagtcccgtcctttgtcaatagagtttgact Gel à 3% d agarose coloré au Bromure d Ethidium contenant l ADN de Bordetella pertussis amplifié avec les amorces QH8F et QH2R. Puits: 1, contrôle négatif (tous les réactifs sauf l ADN matrice); 2, échelle de 100-bp; 3, souche B. pertussis 1772 de type prn1 (260 bp); 4, isolat Bordetella pertussis de type prn2 (275 bp); 5, isolat B. pertussis de type prn3 (260 bp); 6, isolat B. pertussis de of type prn4 (245 bp); et 7, B. pertussis de type prn5 (245 bp). Mäkinen et al., emmerging infectious diseases, Vol. 7, 2001 cactgattatcaatccaaacccttaagctatcactgagctttaaaataga gtgactaatagttaggtttgggaattcgatagtgactcgaaattttatct ctacttctcaatcatcttcatccccgtagcacttttcgtcacatgat- gatgaagagttagtagaagtaggggcatcgtgaaaagcagtgtacta- PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Contaminations PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Sans difficultés jusqu à 2-3 kb Possible jusqu à 20 kb en conditions optimisées (enzyme très fidèle, temps d élongation) 12

13 PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Contaminations PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice En théorie, une copie est suffisante (mais peu de produit à la fin). Pour augmenter la sensibilité : PCR nichée (meilleure spécificité aussi PCR1 PCR2 PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Contaminations PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs 13

14 PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Contaminations PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Hybridation spécifique Distance entre les amorces Pas d hybridation sur elles-mêmes ni l une avec l autre PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Contaminations PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Il existe des polymérases plus ou moins fidèles. Adapter en fonction de ce que l on veut faire (coût différent) 14

15 PCR : limites et précautions PCR : limites et précautions Taille du fragment à amplifier Nombre de copies de matrice Inhibiteurs Choix des amorces Choix de la polymérase Contaminations Liées à la sensibilité de la technique Précautions : séparer les opérations, contrôles positif et négatif Plateau variable (perte d efficacité de la Taq, réactifs devenant limitants, dénaturation moins efficace, ) 96 amplifications d une même échantillon phase plateau variable Besoin de quantification : PCR quantitative ou PCR en temps réél La fluorescence émise, fonction du nombre d amplicons, est mesurée à chaque cycle PRCq : principe Les 3 méthodes de détection principales: a. Molécules se fixant à l ADN db (SYBR Green) b. Sondes d hydrolyse (TaqMan, Beacons, Scorpions) c. Sondes d hybridation (Light Cycler) 15

16 PCR en temps réel : méthode TaqMan 1 2 Comme PCR classique : ADN matrice, amorces, dntps, polymerase En plus : sonde qui s hybride sur la matrice entre les amorces La sonde porte un fluorochrome et un extincteur (quencher) Animation : 3 PCR en temps réel : principe de la technique TaqMan 4 Rn vs Cycle, échelle linéaire Rn vs Cycle, échelle logarithmique Linéaire ~20 to ~

17 Linéaire ~20 to ~1500 seuil = 300 échantillon +R n seuil ΔR n R n Contrôle négatif R n C T cycles Dilutions de 10 en 10 17

18 Seuil (threshold) Quantification Quantification absolue (résultat en nombre de copies): nombre de génomes viraux, Calcul avec courbe étalon Ct Quantification relative (resultat par rapport à un échantillon référence): expression d un gène, Comparaison des Ct ( Ct) Dilutions de 10 en 10 Quantification absolue Quantification absolue Ct Ct= 29.7 Log Qté = 3.28 soit Qté = 1, Log Qté 18

19 Quantification relative : Ct principe: les échantillons dont la concentration de départ diffère d un facteur 2 auront une différence de Ct de 1 Quantification relative : Ct Mais on va normaliser par rapport à un gène de référence! = actin, GAPDH, 18S ΔCT = CT (cible( cible) ) - CT (référence( référence) Les échantillons qui diffèrent d un facteur 10 auront un écart de Ct de 3,33 Δ Δ CT = Δ CT (traité( traité) ) - Δ CT (non traité) Example 1: Ct(A)= 30 Ct(B)= 31 RQ = 2 1 = 2 Example 2: Ct(A)= 30 Ct(B)= 33,3 RQ = = 10 Relative Quantity = 2 Ct Quantité relative = 2 CT (échantillon) - CT (basal) Ct method: Exemple Ct method: Exemple Exemple 1: Exemple 2: ΔCT = CT (cible) - CT (Reference) ΔCt(ctrl SOCS3)= = 7 ΔΔ CT = Δ CT (traité) - Δ CT (contrôle) ΔCt(traité traité SOCS3)= = 4 ΔΔCt = 4 7 = -3 RQ = 2 3 = 8 l expression desocs3 dans l échantillon traité est 8 fois supérieure à celle de l échantillon non traité ΔCT = CT (cible) - CT (Reference) ΔCt(ctrl SOCS3)= 28-16= 12 ΔΔ CT = Δ CT (traité) - Δ CT (contrôle) ΔCt(traité traité SOCS3)= 25-13=12 ΔΔCt =12-12=0 RQ = 2 0 = 1 l expression desocs3 dans l échantillon traité est identique à celle de l échantillon non traité ctrl 18S tr 18S tr SOCS3 ctrl SOCS3 tr 18S ctrl 18S tr SOCS3 ctrl SOCS3 19

20 méthode Ct Pas besoin de dilutions en série gain de temps, de matériel MAIS: l efficacité d amplification de la cible et du contrôle doivent être comparables CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY , ,048 1, ,096 2,213 1, ,192 4,205 2, ,384 7,990 3,748 1, ,768 15,181 6,747 2, ,536 28,844 12,144 4, ,072 54,804 21,859 8, , ,127 39,346 14, , ,842 70,824 23, ,048, , ,482 40, ,097, , ,468 69, ,194,304 1,356, , , ,388,608 2,578, , , ,777,216 4,898,763 1,338, , ,554,432 9,307,650 2,408, , ,108,864 17,684,534 4,335, , ,217,728 33,600,615 7,804,726 1,667, ,435,456 63,841,168 14,048,506 2,835, ,870, ,298,220 25,287,311 4,819, ,073,741, ,466,618 45,517,160 8,193,466 Efficacité de l amplification AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA 1,200,000, % 100% EFF EFF 1,000,000,000 90% EFF 1,000,000,000 90% EFF 80% EFF 800,000,000 70% EFF 80% EFF 800,000,000 70% EFF 600,000, ,000, ,000, ,000, ,000, ,000, PCR CYCLE NUMBER PCR CYCLE NUMBER 10,000,000,000 1,000,000, % EFF 100,000,000 90% EFF 80% EFF 10,000,000 70% EFF 1,000, ,000 10,000 1, PCR CYCLE NUMBER Efficacité La pente de la partie linéaire de la représentation logarithmique est le reflet de l efficacité méthode ΔCt La cible a-t-elle la même efficacité d amplificationd que le contrôle endogène? L efficacité de la réaction peut-être calculée par l équation : Eff=10 (pente) 1. L efficacité de la PCR doit être % (pente idéale = -3.3) Plusieurs variables peuvent affecter l efficacité de la PCR. Longueur de l amplicon, structure secondaire, dessin des amorces Courbes étalon NON OUI méthode ΔΔCt 20

21 PCR : Applications Clonage Etude de l expression des gènes : RT-PCR Analyse qualitative de la structure des génomes PCR multiplexe Amplification spécifique d allèle PCR-SSCP PCR : Applications Clonage Dès qu on en connaît la séquence, on peut amplifier n importe quel fragment d ADN (pour le cloner, l étudier, le muter La PCR a énormément simplifié la manipulation des gènes PCR : Applications Etude de l expression des gènes : RT-PCR Un gène donné est-il exprimé dans tel ou tel tissu?? RT-PCR = PCR précédé d une étape de transcription inverse (ARNÞ ADNc). Meilleure sensibilité que le northern blot. AAAAA- AAAAA- AAAAA- TTTTT- 1er cycle de PCR TTTTT- Autres cycles de PCR + transcriptase inverse + amorce PCR : Applications Analyse qualitative de la structure des génomes Détection de la présence d un pathogène par la mise en évidence de son génome (ADN ou ARN) PCR multiplexe : plusieurs couples d amorces dans le même tube Diagnostic pour plusieurs pathogènes en une seule réaction (FIV-FeLV) Diagnostic de maladies génétiques, ex : Myopathie de Duchenne, due à délétion importante du gène DMD : quels sont les exons qui sont touchés? 21

22 exon1 exon2 exon15 exon16 exon28 exon pb 200 pb pb -380pb -250pb -200pb -140pb 380 pb PCR : Applications Analyse qualitative de la structure des génomes Amplification spécifique d allèle (ASA) T A Séquence non mutée G C Séquence mutée Amorce amont n 1 : le dernier nucléotide en correspond à la séquence non mutée T T A Amorce amont n 2 : le dernier nucléotide en correspond à la séquence mutée G T C Diagnostic de Myopathie de Duchenne par PCR multiplexe : Les amorces sont choisies de façon à amplifier des segments de tailles différentes à partir de différents exons. Puits 2 : ADN normal Puits 3 à 5 : ADN de personnes atteintes. Les bandes manquantes permettent d estimer l ampleur de la délétion T G A G G C PCR : Applications Analyse qualitative de la structure des génomes PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) : Un ADN dénaturé et refroidi brusquement reste simple brin avec une conformation dépendante de sa séquence PCR : Applications Analyse qualitative de la structure des génomes PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) ADN non muté ADN muté homozygote ADN muté hétérozygote PCR-SSCP PCR-SSCP PCR-SSCP Gel non dénaturant 22

23 PCR : Applications Analyse qualitative de la structure des génomes PCR-SSCP (single strand conformation polymorphism) PCR : Applications Analyse qualitative de la structure des génomes Evolution, médecine légale : amplification d ADN à partir de prélèvements abîmés et de petite taille Lutte contre les fraudes Sexage Figure 1 : analyse du gène p53 par PCR-SSCP N : ADN normal; T, ADN de tumeur; (A), exon 7; (B), exon8. Les mutations sont indiquées par les flèches Figure 2 : Mutation du gène p53 identifiées par séquençage de l ADN des exons 7 et 8 amplifié en figure 1. (A), exon 7; (B), exon8. Les bases mutées sont indiquées par les flèches Pooart et al., Clinical Biochemistry, vol 3, 1999, Pages ELISA: détection des AC ELISA: détection des Ag - + Ag connu spécifique de l AC recherché Incubation du sérum à tester - + AC connu spécifique de Ag recherché Ag Incubation du liquide biologique à tester Lavage - + Ez Ajout des AC anti-fc marqué par une enzyme Ez Lavage - + Ajout des AC spécifiques de Ag couplés un fluorochrome Lavage Ez Ajout du substrat chromogène de Ez Lavage Pas de coloration Coloration Pas de coloration Coloration 23

24 Western blot Extrait protéique 100 C Sodium Dodécyl Sulfate (SDS, détergent ionique fort) --> protéines dénaturées et chargées négativement --> sur gel de polyacrylamide : séparation en fonction de la taille - Grands PM PCR en temps réel ex : Herpes virus félin --> transfert sur membrane (application d un champ électrique) --> Anticorps primaire + Petits PM Lavage et Anticorps secondaire