UMR 42. Centre Alpin de Recherche sur les Réseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques CARRTEL. Task Group on Aquatic Microbial Food Webs

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1 UMR 42 Centre Alpin de Recherche sur les Réseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques CARRTEL Task Group on Aquatic Microbial Food Webs Station d Hydrobiologie Lacustre de Thonon Solange DUHAMEL Mémoire de D.E.A. Océanologie Biologique et Environnement Marin Option Connaissance des Producteurs Primaires Université Pierre et Marie Curie, Paris 6 Etude quantitative et fonctionnelle des bactériophages du lac Léman : Comparaison de méthodes pour estimer la mortalité bactérienne due à la lyse virale et au broutage par les protozoaires flagellés Stage effectué sous la responsabilité scientifique de : Stéphan Jacquet (CR2) Equipe de Microbiologie Aquatique / UMR CARRTEL INRA Station d Hydrobiologie Lacustre 75, avenue de Corzent BP Thonon cx, France

2 REMERCIEMENTS Je remercie Jean-François Humbert, responsable de l équipe de Microbiologie Aquatique, pour avoir accepté ma présence dans son équipe. Je tiens à remercier Stéphan Jacquet pour m'avoir proposé un projet de stage absolument passionnant, et m'avoir accueilli avec une grande gentillesse. Je le remercie aussi pour le temps qu il m a consacré et pour les nombreux conseils extrêmement précieux qu'il m'a donnés. Enfin, je le remercie pour son soutien et pour la confiance sans réserve qu il a su me témoigner. Un grand merci à Sébastien Personnic et à Isabelle Domaizon pour les conseils et l aide qu ils ont pu m apporter dans le cadre de mes expériences sur le terrain. Je tiens à exprimer mes remerciements sincères à tous ceux qui m ont aidé au cours de ce stage. Je remercie particulièrement J.C. Hustache et P. Chifflet pour avoir pris le temps de me conduire sur les points de prélèvements du lac, la gentille Raymonde pour avoir fait ma vaisselle avec le sourire, les déesses de la biologie moléculaire, Petit Ours et Brigitte. Je remercie tous les membres de l équipe de Microbiologie Aquatique. Merci à C. Leboulanger pour sa ficelle magique. J'adresse également mes remerciements à mes compagnons de la MJC Nicolas et Laurent qui ont eu la patience de m attendre parfois très tard pour ne pas me laisser faire le chemin seule. Je remercie ma dynamique collègue de bureau, Bérengère, en espérant que l on se retrouvera l année prochaine. Un grand merci à Aurélie pour sa bonne humeur communicative et pour ses pouces. Mes plus chaleureux remerciements vont à mes amis, particulièrement Julie et Pascal, et à mon frère David sans qui je n aurais pas abouti à mon rêve «Un frère est un ami donné par la nature» [Gabriel Legouvé]. Je remercie profondément mes parents pour m'avoir toujours témoigné leur confiance et mon Mascou pour ses encouragements et son soutien..

3 SOMMAIRE REMERCIEMENTS GLOSSAIRE ABREVIATIONS INTRODUCTION Bref historique Propriétés générales des virus Transferts génétiques Rôles des virus dans les cycles biogéochimiques : agents de mortalité et de redistribution de la matière organique Contrôle des communautés bactériennes par les virus Contrôle de la diversité bactérienne Contrôle de la production bactérienne Objectifs de l étude et questions posées...6 MATERIELS ET METHODES Contexte Site d étude Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes Echantillonnage et conditionnement des échantillons Instruments et protocoles de mesure Mesures par cytométrie en flux Mesures par microscopie à épifluorescence Les expériences in situ Prélèvements et incubation DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis L expérience de dilution L expérience d enrichissement

4 RESULTATS Dynamique des communautés microbiennes Les données acquises en cytofluorimétrie Tests méthodologiques Comparaison des données acquises en cytométrie et en microscopie à épifluorescence Tests de conservation des échantillons Les expériences in situ La première expérience La dilution L enrichissement La seconde expérience...17 DISCUSSION Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes Les tests méthodologiques Les expériences in situ Impact des virus vs. protistes flagellés Avantages et limites des méthodes, perspectives 25 CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE ANNEXES RESUME

5 GLOSSAIRE Bactérie : Etre vivant unicellulaire, Procaryote, c est-à-dire dépourvu de noyau. Cyanobactérie : procaryote possédant des pigments assimilateurs lui permettant de réaliser la photosynthèse. Epilimnion : couche aquatique supérieure d'un lac située, au cours de la stagnation hivernale et estivale, au-dessus de la couche du saut thermique (métalimnion) ; dans cette dernière, la transition thermique s'effectue de façon brusque. Picocyanobactérie : cyanobactérie de taille comprise entre 0,2 et 2 μm. Pléomorphique : vient de Pléomorphe, pléomorphisme : terme issu du grec pléôn : plus abondant, et morphê : forme. Capacité que possède un organisme (essentiellement les bactéries) de revêtir des formes différentes dans certaines conditions ou sous des influences déterminées. Protozoaires : microorganismes formés d'une seule cellule, mobiles au moins à un stade de leur cycle. Ils se déplacent par des pseudopodes (amibes), des flagelles (Trypanosomes) ou des cils vibratiles (paramécies). Virus : minuscule parasite des cellules. Incapable de vivre seul, le virus pénètre dans la cellule et l'utilise pour se multiplier et ainsi contaminer d'autres cellules. Des maladies comme la grippe, la varicelle mais aussi le SIDA sont provoquées par des virus. Outre l'homme, les animaux, les plantes et même les bactéries peuvent être infectés par des virus. LISTE DES ABREVIATIONS C max concentration maximale <11 fraction d eau du lac filtrée sur une membrane de 11 μm de porosité <2 fraction d eau du lac filtrée sur une membrane de 2 μm de porosité <0,2 fraction d eau du lac filtrée sur une membrane de 0,2 μm de porosité <0,02 fraction d eau du lac filtrée sur une membrane de 0,02 μm de porosité +FV enceinte d enrichissement = «plus Fraction Virale» -FV témoin = «moins Fraction Virale» MO Matière Organique T0 temps zéro de l expérience : mise à incubation des bouteilles J0 à J9 jours des expériences in situ compris en le T0 et le 9 ème jour ADN Acide DésoxyriboNucléique ARN Acide Ribonucléique DGGE Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PCR Polymerase Chain Reaction FVIC Fréquence des Bactéries Visiblement Infectées VBR Ratio entre les abondances virales et bactériennes

6 INTRODUCTION Les virus sont des agents infectieux dont l organisation structurelle est simple et acellulaire. Ils possèdent un seul type d acide nucléique (ADN ou ARN), simple ou double brin et ils ne peuvent se multiplier indépendamment des cellules vivantes qu ils infectent, appelées hôtes. Les virus sont probablement des organismes régressés simplifiés et non des formes primitives de la vie (Prescott et al., 2003). Bien qu ils constituent les plus petites entités biologiques connues à ce jour, avec une taille variant entre 20 et 200 nm (majorité <60 µm), les virus sont aujourd hui reconnus comme étant un compartiment intrinsèque des écosystèmes aquatiques. Aussi bien en milieu marin qu en milieu lacustre, ils sont extrêmement abondants dans la colonne d eau. Les comptages directs montrent qu il y a environ 3 à 10 VLP («Virus-like particles») pour chaque cellule de l océan (Bergh et al., 1989 ; Fuhrman, 1999). On sait aujourd hui que les Bactéries et les Archaes sont les cellules les plus abondantes dans l eau de mer, et il est admis que la majeure partie de la communauté virale est composée de bactériophages, virus infectant les bactéries (Fuhrman, 1999 ; Wommack et Colwell, 2000 ; Weinbaueur, 2004). Sachant que les milieux aquatiques constituent la plus grande «biosphère» de notre planète, il est alors logique de penser que les phages marins et d eaux douces sont probablement les entités biologiques les plus abondantes de la Terre (Paul et al., 2002 ; Sime-Ngando et al., 2003). Mis bout à bout, et en considérant une taille moyenne de 50 nm, l ensemble des virus aquatiques constitue un «collier de perles» long de années lumière selon Weinbauer et Rassoulzadegan (2004). Toutefois, le rôle fonctionnel, la dynamique et la diversité des virus dans les écosystèmes aquatiques, en particulier dulçaquicoles, sont encore mal renseignés. 1. Bref historique «Vous pouvez vous demander comment de tels naïfs apprirent l existence des virus bactériens. Vraiment par accident, je vous l assure.» Max Delbrück. Jusqu à très récemment, l écologie virale aquatique était une science négligée (Figure 1). C est dans les années 70, avec Torella et Morita (1979) que l on démontre que les virus présents dans l eau de mer sont en plus fortes concentrations que ce que l on avait préalablement rapporté (>10 4 particules virales par millilitre). Par la suite, d autres chercheurs ont corroboré ces observations en mesurant des abondances virales de l ordre de 10 9 à particules virales par litre dans les eaux de mer ou de lac (Børsheim et al., 1990 ; Paul et al., 1991 ; Suttle et al., 1991). Dès lors, de fortes abondances virales ont été observées dans les eaux marines (Bergh et al., 1989 ; Proctor et Fuhrman, 1990), côtières (Suttle et al., 1990 ; Paul et al., 1991) et douces (Klut et 1

7 Stockner, 1990 ; Bergh et al., 1989) ; dans les sédiments marins (Paul et al., 1993) et d eaux douces (Maranger et Bird, 1996) et dans la glace de la mer polaire (Maranger et al., 1994). La fin des années 80 a donc marqué un regain d intérêt pour l étude de l écologie des virus aquatiques bactériens et phytoplanctoniques (Fuhrman, 1992 ; Fuhrman et Suttle, 1993). De nombreux chercheurs ont alors tenté d identifier et de travailler sur les différents rôles importants des virus dans la mortalité du bactérioplancton, des cyanobactéries, et du phytoplancton, dans les cycles biogéochimiques et le contrôle de la diversité microbienne planctonique (Fuhrman, 1999 ; Wilhelm et Suttle, 1999 ; Wommack et Colwell, 2000 ; Suttle, 2000 ; Sime-Ngando et al, 2003 ; Weinbauer et Rassoulzadegan, 2004 ; Weinbauer, 2004). 2. Propriétés générales des virus Les bactériophages sont le groupe de virus le plus important par le nombre de descriptions. Ils sont représentés chez les Archae et les Bactéries, ont colonisé tous les habitats connus dans la nature (Ackermann et Dubow, 1987), et peuvent être trouvés en nombre très élevé (Wommack et Colwell, 2000). Plus de 5100 virus de bactéries ont été examinés par microscopie électronique depuis 1959, révélant qu environ 96% des phages présentent une queue (contractile ou non) et que seulement 3,6% sont cubiques, filamenteux ou pléomorphiques (*) (Ackermann, 2001) Transferts génétiques Les virus peuvent jouer un rôle central dans le transfert de gènes entre microorganismes, au travers de deux processus : la transformation et la transduction. Dans le premier cas, le virus induit le transfert génétique de façon indirecte en provoquant la libération de l ADN de la cellule hôte lysée, pouvant être récupéré et utilisé par un autre microorganisme. Dans le second processus, plus direct, le virus empaquette une partie de l ADN de son hôte dans sa tête puis l injecte dans un autre hôte potentiel (Fuhrman, 2001). Bien que l étendue de ces mécanismes dans les systèmes naturels aquatiques ne soit pas encore bien connue, ils peuvent toutefois avoir un rôle important dans la génétique des populations, au travers de l homogénéisation des gènes dans une population hôte potentielle mais également sur son évolution à plus grande échelle de temps (Ackermann, 2001). Ce sont ces hypothèses qui ont conduit certains chercheurs à se pencher sur le sujet. Ainsi, Chiura démontre en 1997 la production spontanée de virus et le transfert de gènes par l intermédiaire de ces virus chez Escherichia coli AB1157 comme receveur. Il estime l efficacité moyenne de l ensemble des transferts de gènes comme étant comprise entre 2,62x10-3 et 3,58x10-5 par particule virale. Ces résultats indiquent que les virus produits par certaines bactéries pourraient être un élément important pour le transfert 2

8 horizontal de gènes. De la même façon, Jiang et Paul mènent une étude en 1998 pour déterminer le potentiel du transfert de gènes par l intermédiaire des bactériophages dans l environnement marin. Les fréquences de transduction obtenues chez des bactéries isolées et l utilisation d un modèle numérique leur ont permis d obtenir des estimations de transduction supérieures à 1,3x10 14 évènements de transduction par an dans l estuaire de Tampa Bay (Floride). Ces résultats suggèrent que la transduction pourrait être un mécanisme important dans le transfert horizontal de gènes dans les milieux aquatiques. Plus récemment, Clokie et al. (2003) ont pu démontrer pour la première fois que les phages infectant la souche marine Synechococcus (Waterbury et al., 1979) pouvaient encapsider l ADN de leur hôte (environ 8% du génome complet) avec une fréquence totale de 10-4, fournissant de nouveau une évidence de l importance potentielle des phages dans le transfert horizontal de gènes Rôles des virus dans les cycles biogéochimiques : agents de mortalité et de redistribution de la matière organique Depuis deux siècles, la poussée démographique et le développement industriel et agricole (combustion des énergies fossiles, utilisation des sols...) ont provoqué un profond déséquilibre des cycles biogéochimiques globaux ainsi qu un réchauffement climatique (Hansen et al., 1998). La majorité des composés atmosphériques à impact radiatif (CO 2, CH 4, N 2 O, O 3, aérosols) a augmenté très significativement (Hansen et al., 2000 ; Peng et al., 2003). Cette évolution a un effet direct sur le climat mais également un double impact sur les écosystèmes marins et continentaux. D'une part, les changements climatiques sont susceptibles de modifier en profondeur à la fois la géochimie et la dynamique des grands réservoirs, d'autre part, certains composés exercent une influence directe de fertilisation ou d'inhibition des végétaux (Tilman et Lehman, 2001). Ainsi l'étude de l'état transitoire actuel des cycles biogéochimiques passe à la fois par le suivi de l'évolution temporelle de l'atmosphère, de l'océan, de la biosphère et par la compréhension de l'impact global de l'évolution du climat sur ces grands réservoirs. La communauté microbienne n a été prise en compte dans l étude des grands cycles biogéochimiques que tardivement. Il faut attendre Azam et al. (1983) pour qu apparaisse le concept de boucle microbienne et que le compartiment microbien soit reconnu comme clef dans le fonctionnement et la compréhension des processus biogéochimiques en milieu aquatique. La boucle microbienne est une voie de transfert du carbone (Figure 2) dans les écosystèmes aquatiques, basée sur l'utilisation par les bactéries de la matière organique allochtone et autochtone. Le carbone bactérien entre alors dans la chaîne trophique via le broutage des bactéries par le protozooplancton et éventuellement par certains composants du métazooplancton. Au travers de leur activité de lyse 3

9 cellulaire, les phages modulent le flux de carbone au travers de la chaîne alimentaire en attaquant les microbes autotrophes et hétérotrophes (Fuhrman, 1999). En effet, il est établi qu une large fraction du carbone total et des flux de nutriments dans les écosystèmes marins passe au travers des bactéries hétérotrophes via la matière organique dissoute. Lorsqu une cellule hôte est lysée, les virus en résultant ainsi que les débris cellulaires constituent des produits (protéines, acides nucléiques, et autres composants cellulaires) potentiellement utilisables par les bactéries et le phytoplancton comme éléments nutritifs (Gobler et al., 1997, Noble et al., 1999). La découverte de l abondance des populations virales dans les écosystèmes aquatiques a eu un impact immédiat sur la notion de boucle microbienne. Un modèle conceptuel des virus et de la lyse virale dans la chaîne alimentaire aquatique est fourni en Figure 3 et démontre que la lyse virale augmente le flux de la biomasse bactérienne vers le pool de la matière organique dissoute (Wommack et Colwell, 2000). La Figure 4 permet d apprécier le phénomène de «court-circuit» viral dans la chaîne alimentaire. Selon Wilhelm et Suttle (1999), les virus initient le passage du flux de carbone et de nutriments depuis les consommateurs (flèches noires sur la Figure 4), en détruisant les cellules hôtes et en libérant le contenu de ces cellules, vers le pool de matière organique dissoute de l océan (flèches grises sur la Figure 4). Cette matière organique est alors utilisée comme source de nourriture par les bactéries, lesquelles transfèrent une partie de ce matériel dans la chaîne alimentaire. Wilhelm et Suttle (1999) démontrent en utilisant un modèle très simple que 6 à 26% du carbone organique fixé par photosynthèse est recyclé en matière organique dissoute par la lyse virale, d où la notion de court-circuitage du transfert de la matière vers les maillons trophiques supérieurs. La lyse virale va fournir les éléments azotés, phosphorés et carbonatés essentiels sous forme de composés facilement assimilables par les microorganismes (Gobler et al., 1997). Par exemple, les acides nucléiques sont des produits de la lyse virale riches en phosphore. Paul et al. (1991) suggèrent qu entre 1 et 12% de l ADN total «dissous» dans l eau de mer se trouve dans les virus. Puisque le temps de renouvellement de l ADN dans l eau de mer est rapide, l ADN viral pourrait représenter un réservoir important de phosphore organique (Bratbak et al., 1994). 3. Contrôle des communautés bactériennes par les virus 3.1. Contrôle de la diversité bactérienne La diversité phénotypique et génotypique des populations de phages est liée à l interaction entre les phages et leurs hôtes (Cottrell et Suttle, 1995). Les auteurs se servent de cette propriété pour étudier l influence des bactériophages sur la diversité du bactérioplancton. Ainsi, le concept des espèces de virus proposé par Murphy et al. (1995) définit sept familles différentes de bactériophages basées sur des critères morphologiques. 4

10 D après le concept de «killing the winner» (Thingstad et Lignell, 1997), les virus peuvent garder le contrôle sur les populations ou espèces dominantes ; c'est-à-dire que lorsqu une population bactérienne devient dominante, celle-ci est lysée, permettant ainsi la co-existence de populations moins compétitives tout en maintenant la diversité bactérienne. Ce modèle a été validé par les résultats trouvés en isolant des systèmes phage hôte. Par exemple, Middelboe et al. (2001) ont montré que les phages se propagent en fonction de la densité en hôte et contrôlent l abondance en hôtes, changent la composition clonale de l hôte en forçant la formation de mécanismes de résistance. Ceci a aussi été suggéré ou démontré en milieu naturel au moment de la terminaison d efflorescences phytoplanctoniques (Taruani et al., 2000 ; Jacquet et al ; Tomaru et al., 2004) et en culture (Thyrhaug et al., 2003). Récemment, Weinbauer et Rassoulzadegan (2004) ont synthétisé des données supportant l hypothèse que les gènes viraux et l activité virale génèrent la variabilité génétique des procaryotes permettant ainsi leur fonctionnement écologique et leurs changements évolutifs. Un schéma résumant ces processus de diversification procaryotique via les virus est proposé en Figure Contrôle de la production bactérienne On a longtemps pensé que la production bactérienne aquatique était contrôlée en majeure partie par la prédation par le microzooplancton (Pace, 1988). Le nombre élevé de virus aquatiques et le fait que plus de 34% des bactéries marines pourraient contenir des phages matures (Proctor et Fuhrman, 1990), suggèrent que la lyse virale pourrait être un processus quantitativement important de l altération de la production bactérienne. L ensemble des résultats connus à ce jour révèle qu entre 10 et 50% de la production bactérienne journalière pourrait être éliminée par action virale (Wommack et Colwell, 2000). Certains auteurs ont même rapporté des pourcentages de 97% (Weinbauer et Hoffle, 1998). Toutefois, il n existe encore que très peu d études quantitatives concernant la contribution relative du contrôle viral sur les populations procaryotiques ou eucaryotiques par rapport à la prédation (Hennes et Simon, 1995 ; Mathias et al., 1995 ; Vrede et al., 2003). De plus, la plupart des sujets de recherche concernant les intéractions entre bactéries et bactériophages ont été réalisés en milieu marin. Il manque donc des informations cruciales pour la compréhension de la dynamique virale et du rôle des phages dans les systèmes d eaux douces (Jacquet et al., soumis). 5

11 4. Objectifs de l étude et questions posées Comme nous avons pu le constater plus haut, l écologie des virus en milieu lacustre est encore peu étudiée et manque d informations pour comprendre la dynamique et la diversité des peuplements microbiens à la base des réseaux trophiques pélagiques. L objectif de ce travail de recherche a été de s intéresser à cette problématique à travers l étude du rôle des bactériophages du lac Léman. Dans ce but, nous avons suivi la dynamique du peuplement microbien et réalisé des expériences in situ pour tenter d appréhender le rôle fonctionnel des virus sur la mortalité et la diversité bactérienne du lac Léman. Les questions auxquelles nous avons essayé de répondre sont les suivantes : Quelle est la dynamique de la communauté bactérienne et virale? Quel est l impact de la lyse virale sur la mortalité et la diversité de la communauté bactérienne comparativement à l impact de la prédation par les protozoaires * (flagellés)? Pour répondre à la première question, nous avons utilisé deux techniques de comptage : la cytométrie en flux et la microscopie à épifluorescence. Dans le cadre d études sur le contrôle bactérien par les virus en milieu lacustre, Jacquet et al. (soumis) ainsi que Fischer et Velimirov (2002) ont obtenu des conclusions différentes selon la méthode utilisée. Nous avons donc eu comme premier objectif de déterminer le protocole le mieux adapté à l étude de la communauté microbienne et de valider l exactitude des comptages de virus obtenu par cytométrie en flux (Marie et al., 1999 ; Chen et al., 2001 ; Jacquet et al., 2002 ; Brussaard 2004, Dorigo et al., en préparation). Nous avons également testé l effet de la conservation des échantillons dans l expectative d une analyse différée. Pour déterminer l impact des virus et des prédateurs sur le compartiment bactérien, nous avons comparé deux méthodes en condition de travail in situ : celle de l enrichissement en fraction virale de la communauté bactérienne seule ou avec prédateurs, et celle de la dilution de la communauté bactérienne seule ou avec prédateurs. En effet, la méthode de dilution (Landry et Hasset, 1982 ; Landry et al., 1995 ; Wilhelm et al, 2002 ; Evans et al., 2003 ; Jacquet et al., soumis) déjà utilisée en milieu lacustre présente des biais de part les étapes de filtration (Jacquet et al. (en révision)). La méthode d enrichissement, utilisée surtout pour l étude du bacterio ou phytoplancton marin (Proctor et al., 1992 ; Hennes et Simon, 1995 ; Noble et al., 1999 ; Hewson et al., 2001 ; Eissler et Quinones 2003) a également permis d étudier le rôle des virus et des brouteurs sur le compartiment microbien. La comparaison entre ces deux méthodes n ayant jamais été faite, il était par conséquent intéressant de voire si les résultats fournis iraient dans le même sens et de déterminer la méthode présentant le moins de biais. Ces expériences ont été réalisées à deux périodes distinctes (mars et mai 2004). 6

12 MATERIELS ET METHODES 1. Contexte Comme nous avons pu le constater dans l introduction, la dynamique et la diversité des communautés microbiennes en milieu lacustre sont encore mal renseignées. La première partie de ce travail de DEA trouve ici son premier intérêt. Les études menées sur ce sujet en milieu marin sont beaucoup plus nombreuses et sont souvent basées sur une technique de comptage unique. Nous nous sommes donc demandés quelle technique entre la cytométrie en flux et la microscopie à épifluorescence était la mieux adaptée à ce type d étude pour l énumération bactérienne (auto- et hétérotrophe) et virale. Pour comprendre la dynamique et la diversité de ces communautés, il est crucial de s intéresser aux processus pouvant expliquer la croissance, le maintien et le déclin de ces compartiments biologiques. Dans le cadre de ce DEA, nous nous sommes appliqués à étudier les intéractions de type proie - prédateur et hôte - parasite. En effet, il est aujourd hui admis que les virus et les prédateurs (flagellés et ciliés) interviennent significativement dans la mortalité des populations microbiennes en milieu pélagique. Toutefois, on ne sait encore rien du rôle potentiel des virus planctoniques dans la régulation des populations bactériennes et phytoplanctoniques du lac Léman et on ne connaît pas la part imputable aux virus par rapport aux prédateurs unicellulaires. De nouveau, ce travail bénéficie d un caractère exceptionnel puisqu en plus de l originalité de cette recherche, nous avons comparé deux techniques déjà utilisées mais dont on ne connaît pas l efficacité respective pour ce type d étude (voir plus loin). 2. Site d étude Les prélèvements pour le suivi de la dynamique des communautés microbiennes et pour les expériences in situ ont été effectués à la station de référence SHL2 du lac Léman qui correspond à la plus grande profondeur du réservoir (309 m). Le Léman est situé à l'extrémité ouest de la Suisse et au nord du département français de la Haute-Savoie. Il s agit du plus grand lac naturel d'europe occidentale (Tableau 1). Les eaux du lac Léman sont donc internationales, en raison de sa situation frontalière entre la France et la Suisse (Figure 6). La pression d'urbanisation y est importante et renforcée par la proximité de grandes villes telles que Genève ou Lausanne. La qualité des eaux du Léman est donc suivie depuis 1960 sous l égide de la CIPEL (Commission Internationale pour la Protection des Eaux du Léman contre la pollution, Ce suivi à permis de constater que le Léman a été oligotrophe avant 1960 et qu il est devenu eutrophe dans les années 7

13 70-80 avant de se stabiliser au statut actuel mésotrophe (voir l Annexe I : critères d eutrophisation selon l OCDE). 3. Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes 3.1. Echantillonnage et conditionnement des échantillons Les prélèvements ont été effectués au point SHL2 du lac Léman, dans le cadre du suivi orchestré par la CIPEL, à 11 profondeurs : 2,5 ; 7,5 ; 10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 30 ; 50 ; 100 ; 200 et 300 m. Dans un soucis de qualité, les prélèvements ont toujours été effectués par la même personne, selon un protocole précis. Des flacons Falcon de 50 ml labellisés (profondeur nom du lac nom de la personne) étaient soigneusement rincés deux fois avec l eau prélevée à la profondeur désignant leur contenu, puis étaient remplis à ras bord afin de minimiser les effets de turbulence engendrés par le transport dans les tubes. Les échantillons étaient alors gardés au frais dans une glacière avec packs de glace jusqu au retour au laboratoire. A l arrivée au laboratoire, les échantillons étaient conservés au frais à 4 C et étaient analysés dans les plus brefs délais (< 1 heure après dépôt au laboratoire). Afin de tester la validité des mesures après conservation pendant deux jours à 4 C, une mesure supplémentaire et identique à celle effectuée le jour du prélèvement, a été de reproduite deux jours plus tard (J+2). Dans les résultats, nous avons fait le choix de ne présenter la dynamique des communautés que pour les 50 premiers mètres. L exploitation des données à 100, 200 et 300 mètres sera faite ultérieurement Instruments et protocoles de mesure Deux instruments de mesure des abondances cellulaires et/ou particulaires ont été utilisés dans le cadre du suivi des communautés : la cytométrie en flux et la microscopie à épifluorescence Mesures par cytométrie en flux La cytométrie en flux (CFM) est utilisée en routine pour l analyse des microorganismes marins depuis une vingtaine d années et est désormais considérée comme une technique de référence en océanographie. D abord utilisée pour discriminer et énumérer les populations phytoplanctoniques (Olson et al., 1985), la CFM a été ensuite appliquée à l analyse des communautés bactériennes hétérotrophes (Monger et Landry, 1993 ; Li et al., 1995 ; Marie et al., 1996 ; Marie et al., 1999). C est Marie et al. qui, en 1999, mettent au point une méthode d énumération des virus marins par cytométrie en flux grâce à l utilisation d un nouveau colorant des acides nucléiques : le SYBR Green-I (SYBR-I). Cette technique permet l analyse de chaque cellule en suspension dans un liquide. C est donc une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de ces particules sur la 8

14 base de critères optiques émis par chacune d entre elles après avoir été excitées par un source lumineuse fournie par un rayonnement laser. Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs : aux propriétés optiques intrinsèques des particules qui correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à sa structure interne, ou à l autofluorescence de certaines cellules comme les végétaux (typiquement les pigments du phytoplancton)... aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires (ADN, ARN, activités enzymatiques, ). Ces signaux séparés par des filtres optiques et/ou le jeu de différents miroirs sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur. Nous avons utilisé un cytomètre FACSCalibur (Becton Dickinson) équipé d un laser fournissant 15 mw à 488 nm avec ses filtres standard. Le protocole expérimental était spécifique aux types de cellules que nous désirions étudier (phytoplancton autotrophe, bactéries hétérotrophes et virus). Pour l ensemble des analyses, les échantillons ont été filtrés sur 60 μm afin d éliminer les cellules de trop grande taille pouvant obstruer le système fluidique du cytomètre. Pour les autotrophes, l analyse a été effectuée sans addition de fixateur ni de colorant. Seul 0,5 μl d une solution de billes calibrées (Fluoresbrite Carboxy YG 10 Micron Microsphere [2,57% Solids- Latex], Polysciences) a été ajouté à 1 ml de l échantillon filtré. Les virus et les bactéries ont été fixés avec 10 μl d une solution de glutaraldehyde à 25 % filtrée sur 0,2 μm pour 1 ml d échantillon filtré, pendant 10 minutes à température ambiante et à l obscurité. Après ce temps, les bactéries ont été colorées pendant 15 minutes selon le protocole suivant : 2,5 μl de SYBR-I (1/100 de la solution obtenue par un fournisseur et filtré sur 0,2 μm) + 0,5 μl de solution de billes μl d eau prélevée à 300 m filtrée sur 0,2 puis 0,02 μm + 5 μl de l échantillon fixé. Enfin, les virus étaient colorés de la façon suivante : 2,5 μl de SYBR-I (1/100) μl de TE (Tris EDTA, ph = 8) préalablement filtré sur 0,2 puis 0,02 μm + 2,5 μl de l échantillon fixé, pendant 5 minutes puis chauffage à 75 C pendant 10 minutes (pour plus de détails, voire Marie et al., 1999 ou Brussaard, 2004). L analyse des résultats a été effectuée avec le logiciel CYTOWIN (Vaulot, 1989 : disponible sur le site : après transfert des fichiers générés par le cytomètre vers un ordinateur PC. Des exemples de cytogrammes obtenus au moyen de ce logiciel sont présentés en Figure 7. En se basant sur différents critères de taille et de fluorescence des cellules, on identifie les différentes populations microbiennes : picocyanobactéries (Synechococcus spp.), bactéries hétérotrophes et virus. 9

15 Mesures par microscopie à épifluorescence La microscopie à épifluorescence a été adaptée à l énumération des particules virales dans les années 90 et a été améliorée grâce à l utilisation du marqueur des acides nucléiques SYBR Green I par Noble et Fuhrman (1998). C est à partir du protocole proposé par ces auteurs que nous nous avons réalisé nos analyses. Une série de tests de comparaison de l efficacité de différents marqueurs de l ADN a été conduite par Personnic (2003) dans le cadre de son DEA. Les résultats de ce travail ont révélé que le SYBR Gold (Molecular Probes) constitue un marqueur plus sensible que les autres et de durée de fluorescence plus longue, permettant ainsi une observation plus aisée au microscope. C est la raison pour laquelle les cellules bactériennes et virales ont été marquées au SYBR Gold. Les bactéries et les virus ont d abord été fixés au formalin, un liant des protéines des membranes cellulaires et des protéines de la capside des virus (Noble, 2001) : 1,5 ml d échantillon pour 40 μl de formalin à 37 % filtré sur 0,02 μm, puis maintenus 30 minutes à 4 C. Pendant ce temps, une solution d antifading était préparée (100 mg P-phenylenediamine + 1,5 ml d eau milliq μl de PBS μl de glycerol) et filtrée sur 0,2 μm avant conservation à 4 C. La solution de colorant (2,5 μl de SYBR Gold 1/10 de la concentration stock + 97,5 μl d eau) était déposée sous la forme d une gouttelette sur boite de petri et conservée à 4 C à l obscurité. 1 ml des échantillons fixés était alors filtré sur une membrane de porosité 0,02 μm (Filtre Whatman Anodisc 25). Ce filtre était alors déposé sur la goutte de solution de colorant et conservé 15 à 20 minutes à l obscurité. Pour le montage entre lame et lamelle, le filtre était déposé sur une lame et une goutte d antifading était placée sous la lamelle après séchage du filtre. Les picocyanobactéries n étaient pas fixées. Nous les avons préparé selon la méthode développée par Wetzel et Likens (2000). 250 à 300 ml d échantillon étaient filtrés à travers un filtre de porosité 3 μm (filtre Whatman GF/D) afin d éliminer les cellules de taille supérieure au picoplancton. Le filtrat obtenu était filtré sur une membrane en polycarbonate noir de 0,2 μm de porosité (filtre Whatman Cyclopore Track Etched Membrane). Ce filtre, une fois séché, était placé sur une goutte d huile à immersion (Cargille) et sur une lame. Une goutte d huile à immersion était rajoutée entre le filtre et la lamelle. Les comptages ont été effectués à l aide d un microscope à épifluorescence (Leitz Wetzlar, Dialux 20), muni d un filtre A (Ultraviolet : 400 nm, LP 430, bande passante : ) pour le comptage des bactéries et des virus et d un filtre I2/3 (Bleu : 510 nm, LP 515, bande passante : ) pour le comptage des cyanobactéries. La Figure 8 illustre les picocyanobactéries, les bactéries et les virus observés en microscopie à épifluorescence. 10

16 4. Les expériences in situ Pour ces expériences, les abondances cellulaires et particulaires ont été obtenus uniquement par cytométrie en flux. En plus des comptages, des mesures de diversité bactérienne ont été conduites par la technique de biologie moléculaire DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). Les mesures par cytométrie en flux ont été effectuées toutes les 24 h pendant 7 jours alors que les expériences de DGGE ont été réalisées à J0, J3 et J7. Selon un article de Schwalbach et al. (2004), les effets des virus sur les communautés microbiennes sont souvent de faible intensité en deçà de 5 jours. Ainsi, lors de la première expérience, nous avons choisi de mener l expérience sur 9 jours afin d observer le maximum d effets. Ayant observé l effet de confinement dans ce cas, nous avons réduit le suivi de la deuxième expérience à 7 jours Prélèvements et incubation Les prélèvements ont été effectués à deux périodes de l année marquées par des différences de stratification des eaux du lac, au point SHL1 (Figure 6). Le premier prélèvement a été effectué le mardi 30 mars et le second le lundi 10 mai. L échantillon correspondait à un profil intégré de l épilimnion (*) (0-10 m) où les conditions de lumière et de température sont proches de celles du lieu d incubation. Les différents traitements, une fois répliqués, ont été mis à incuber dans le port (à environ 2 m de profondeur) DGGE : Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Il y a une dizaine d années, une méthode de biologie moléculaire, la PCR * (Polymerase Chain Reaction) suivie par une électrophorèse sur gel à gradient dénaturant (PCR-DGGE), a été proposée pour l étude de la diversité des populations bactériennes dans des échantillons environnementaux (Muyzer et al., 1993). Dans cette méthode, l ADN microbien total est extrait, puis les gènes d ARN r 16S bactérien sont emplifiés par PCR à l aide d amorces eubactériennes universelles (Heuer et Smalla, 1997). Les produits de PCR de même longueur mais de séquence nucléotidique différente peuvent être séparés selon leurs propriétés de fusion par DGGE (Muyzer et al., 1993 ; Heuer et Smalla, 1997). En dépit de nombreux efforts, les produits de PCR n ayant révélé aucune amplification, aucun résultat de DGGE ne sera présenté. Les expériences seront reconduites ultérieurement. 11

17 4.3. L expérience de dilution Dans les expériences standards de dilution, le taux de croissance net des bactéries (k) est considéré comme étant le produit de la croissance instantanée (μ) et de la mortalité (m) des bactéries due au broutage (m g ) par les prédateurs zooplanctoniques (Figure 9). Il est supposé que μ est constant selon le niveau de dilution (D) alors que m g est considéré comme «densitédépendant». Dans ce cas, le facteur de mortalité imputable aux virus est ignoré. Dans les expériences standard de dilution, le diluant est généralement filtré sur une membrane < 0,2 μm au travers de laquelle les virus peuvent passer. Puisque les taux d infection virale sont «densitédépendants», il peut être supposé que la mortalité due aux virus sur les bactéries (m v ) est constante selon D et que par conséquent, l estimation de μ inclue le composant de mortalité par les virus. Une estimation directe de la mortalité des bactéries imputable aux virus peut être obtenue en faisant la différence entre k et D dans des incubations diluées avec un diluant sans virus et avec virus (m v = (m v + m g ) m g ). Après avoir pré-filtré l eau du lac sur une maille de et 0,2 μm, deux gammes de dilution ( %) on été réalisées sur l eau du lac filtré sur 11 μm (noté par la suite <11) : la première était diluée avec de l eau ultra pure obtenue par ultrafiltration tangentielle et la seconde était diluée avec de l eau filtrée sur 2 μm (notée par la suite <2) dans le cas de la première expérience et sur 0,2 μm (notée par la suite <0,2) dans le cas de la deuxième expérience (Figure 10). La dilution avec de l eau filtrée sur 2 μm a été une erreur de notre part. Elle aurait du être réalisée avec de l eau filtrée sur 0,2 μm. Aucun résultat ne sera donc exploité dans le cadre de ce traitement. Pour chaque niveau de dilution, les échantillons ont été placés dans des bouteilles de 250 ml en polycarbonate (Nalgene, Bioblock), préalablement rincées trois fois à l acide. La filtration sur une maille de 11 μm a permis de conserver les virus, les bactéries et les prédateurs flagellés de l eau naturelle prélevée. Par contre, la filtration sur 0,2 μm a permis d éliminer les prédateurs flagellés et les bactéries tout en conservant les virus et la filtration sur 2 μm n a permis d éliminer que les flagellés. Dans le cadre de la première expérience, chaque traitement a été suivi en duplicat alors que dans le cadre de la seconde, chaque traitement a été suivi en triplicat (sauf les témoins (0% d eau <11) en duplicat) L expérience d enrichissement Pour la première expérience d enrichissement, deux traitements ont été mis en place (Figure 11) : un duplicat de l eau du lac filtrée sur 11 μm et un duplicat de l eau du lac filtrée sur 2 μm enrichis en fraction virale (+FV). Un témoin de chaque traitement a été mis en place en duplicat. Les témoins ont consisté au même traitement passé à l autoclave (-FV). De la même façon que pour 12

18 l expérience de dilution, des bouteilles de 250 ml en polycarbonate ont été utilisées. Chaque bouteille a été remplie (475 ml) d eau prélevée in situ, préalablement filtrée sur 11 ou 2 μm, puis complétée soit par un volume de 12,5 ml d eau enrichie en virus que l on nommera par la suite enceinte d enrichissement, soit par un volume de 12,5 ml de la même eau enrichie ayant subie un passage à l autoclave. L enrichissement théorique par bouteille est de 5. Les volumes d eau enrichis en matière organique et en virus ont été obtenus en filtrant sur 0,2 μm et en concentrant l eau du milieu naturel au moyen d une pompe péristaltique et d un système approprié d ultrafiltration tangentielle (Proctor et Fuhrman, 1992). Les caractéristiques de l autoclavage sont les suivantes : 45 minutes pour environ 75 ml d eau enrichie, résultant en théorie en la perte du potentiel infectieux des particules virales (Noble et al., 1999). Le facteur d enrichissement obtenu lors de la première expérience ayant été beaucoup plus faible que celui escompté, nous avons décidé de changer le protocole en vue d améliorer la concentration virale. Pour la deuxième expérience d enrichissement, seul le traitement «eau du lac filtrée sur 2 μm, enrichie en virus (+ FV)» a été mis en place (toujours en duplicat). Deux bouteilles de 1L ont été remplies (960 ml) d eau prélevée in situ, préalablement filtrée sur 2 μm, puis complétées par un volume de 40 ml d eau enrichie en virus (+FV). Le facteur d enrichissement théorique par bouteille, connaissant le facteur réel obtenu lors de la première expérience, est de 4. Les témoins (en duplicat) n ont pas été enrichis en MO comme pour la première expérience car d après Proctor et Fuhrman (1992), il n y a pas de différence entre un témoin enrichi ou non en MO. 13

19 RESULTATS 1. Dynamique des communautés microbiennes 1.1. Les données acquises en cytofluorimétrie Le suivi de la distribution des communautés microbiennes (picocyanobactéries dominées par Synechococcus spp., petits eucaryotes, bactéries hétérotrophes et virus) a été réalisé à partir des 11 prélèvements effectués entre le 4 février et le 24 mai 2004 (Figure 12). Il existe une succession marquée entre les différentes communautés. Le premier groupe pour lequel les concentrations augmentent de manière significative est celui des petits eucaryotes. Ces derniers présentent deux pics vers le 15 avril et le 10 mai, atteignant jusqu à 14x10 3 cell.ml -1 entre 0 et 15m. Les bactéries hétérotrophes dominent en avril avec un pic à la fin du mois, et sont suivies par les cyanobactéries dont la biomasse culmine entre mi avril et fin mai avec un pic en début mai. Alors que les fortes concentrations des communautés bactériennes (4 à 6x10 6 cell.ml -1 ) s étendent sur les 25 premiers mètres, celles des picocyanobactéries (10 à 14x10 3 cell.ml -1 ) ne s étendent que sur les 15 à 20 premiers mètres. Les virus présentent des concentrations plus élevées (4 à 5x10 7 part.ml -1 ) entre la surface et les 50 premiers mètres vers le 15 avril et explosent de début à fin mai (4 à 7x10 7 part.ml - 1 ), atteignant des concentrations maximales de l ordre de 8x10 7 particules.ml -1 en surface. La Figure 12 permet également de repérer les deux jours de prélèvements pour les expériences in situ. Le premier prélèvement est caractérisé par des abondances relativement faibles des 4 communautés microbiennes (2x10 3, 3x10 3, 3x10 6, 3x10 7 cell.ml -1 pour les picocyanobactéries, eucaryotes, bactéries hétérotrophes et virus respectivement) alors que le second est marqué par de plus fortes concentrations en picocyanobactéries (12 à 14x10 3 cell.ml -1 ), eucaryotes (12 à 14x10 3 cell. ml -1 ) et virus (6 à 7x10 7 part.ml -1 ) et par des concentrations moyennes pour les bactéries hétérotrophes (4x10 6 cell.ml -1 ) Tests méthodologiques Comparaison des données acquises en cytométrie et en microscopie à épifluorescence En plus de l analyse par cytométrie en flux, des comptages ont été réalisés par microscopie à épifluorescence sur 8 des 11 prélèvements. La comparaison de ces données est présentée en Figure 13. Si l on s intéresse aux picocyanobactéries, la pente de la droite de régression entre les données de cytométrie et d épifluorescence est de 0,37 avec un coefficient de corrélation de 0,89. Cette corrélation étant statistiquement significative au seuil de 5% selon la distribution de Bravais - Pearson (r α/2 = 0,42), nous pouvons en déduire que les comptages en microscopie à épifluorescence 14

20 (EFM) et en cytométrie (CFM) vont dans le même sens. La cytométrie étant beaucoup plus fiable (comptage direct et total très précis dans le cas des picocyanobactéries), il est possible de conclure que la EFM entraîne une sous estimation des abondances en picocyanobactéries d environ 63%. Pour les bactéries hétérotrophes, la pente de la droite de régression est de 0,28 avec un coefficient de corrélation de 0,69. Cette corrélation étant statistiquement significative au seuil 5% (r α/2 = 0,30), nous pouvons en déduire que les comptages en microscopie à épifluorescence et en cytométrie sont également comparables. La EFM entraînerait donc une sous estimation des abondances en bactéries hétérotrophes d environ 72% par rapport aux données obtenues en cytométrie, résultat cohérent avec le précédent et les résultats obtenus par Personnic (2003). Enfin, la même comparaison pour les particules virales montre un coefficient de corrélation de 0,16 qui est statistiquement non significatif au seuil 5% (r α/2 = 0,30). Les comptages en microscopie des particules virales sont assez constants quelle que soit la date et la profondeur, avec des concentrations de l ordre de 2x10 7 particules.ml -1 alors que les comptages en cytométrie varient entre 1x10 7 et 9x10 7 particules.ml -1. Ces quelques constatations nous laissent penser que les comptages en cytométrie sont beaucoup plus fiables Tests de conservation des échantillons Afin de tester les effets d un mode de conservation simple des échantillons pour une analyse différée dans le temps, les communautés ont été dénombrées le jour de l échantillonnage (J) et deux jours après conservation à 4 C (J+2). Les résultats sont présentés en Figure 14. Pour chacune des trois communautés considérées, la régression est statistiquement significative au regard des coefficients de corrélations obtenus, tous supérieurs à la valeur critique définie par la table de Bravais - Pearson (r α/2 = 0,38 ; α = 5%). La pente de la droite de régression entre les valeurs obtenues à J et à J+2 est de 1,16 pour les picocyanobactéries, de 1,12 pour les bactéries hétérotrophes et de 0,36 pour les virus. Afin de déterminer si la différence observée entre les dénombrements à J et à J+2 est significative, un test T de Wilcoxon a été appliqué sur les 31 échantillons. Les résultats indiquent que la différence entre les comptages à J et J+2 est non significative au seuil 5% pour les picocyanobactéries et les bactéries hétérotrophes (p-valeur = 0,6851 et 0,1028 respectivement) alors qu elle est significative pour les virus (p-valeur = 0,0115). La conservation des virus 2 jours à 4 C se traduit donc par une perte importante des communautés virales et ne semble pas constituer un moyen de préservation adéquate. 15

21 2. Les expériences in situ 2.1. La première expérience La dilution Les résultats qui suivent concernent l eau du lac initialement prélevée et filtrée à travers 11 μm ne contenant donc que virus, bactéries et flagellés. Dans un premier temps, nous avons vérifié que la gamme de dilution à l eau ultra pure entraînait bien un gradient de concentration en virus. La Figure 15 illustre en effet que la fraction non diluée contient environ 4 fois plus de virus que la fraction à 20%. Dans un second temps nous avons suivi les variations d abondances des trois communautés étudiées dans cette première expérience (Figure 16). Les picocyanobactéries montrent une augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu au 7 ème jour pour la fraction non diluée et les fractions diluées à 40 et 70%. Le taux de croissance net sur cette période varie entre 0,24 j -1 pour la fraction la plus diluée (20% d <11) et 0,20 j -1 pour la fraction d eau totale. Audelà, on observe une chute brutale des concentrations en picocyanobactéries, à l exception de la fraction diluée à 20% (Fig 16A). Les bactéries hétérotrophes présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu au 4 ème jour dans la fraction totale et jusqu au 5 ème jour pour les fractions diluées. Le taux de croissance net sur cette période varie entre 0,58 j -1 pour la fraction la plus diluée (20% d <11) et 0,32 j -1 pour la fraction totale. Au-delà de ces 5 jours, les bactéries hétérotrophes présentent une rapide diminution de leurs concentrations cellulaires. Les virus présentent une légère augmentation de leurs concentrations jusqu au 5 ème jour puis montrent une brutale augmentation entre le 5 ème et le 6 ème jour pour les fractions totale et diluées à 70 et 20%. Seule la fraction diluée à 40% ne présente pas ce pic mais montre une légère croissance continue sur l ensemble de la durée de l expérience. Le suivi des communautés virales en cytométrie en flux a révélé l apparition d une population que l on nommera par la suite VLP3 («Virus-Like-Particules 3»). Ses caractéristiques de fluorescence et de taille ont permis de la discriminer des autres populations (Annexe II). Les courbes de croissance de cette population sont présentées sur la Figure 17. La population VLP3 émerge entre le 4 ème et le 6 ème jour de l expérience passant d environ 3x10 4 part.ml -1 à 3x10 6 part.ml -1, puis sa concentration reste quasi-constante jusqu à la fin du suivi (au 9 ème jour). Dans un troisième temps, nous avons suivi les variations du taux de mortalité imputable aux virus et aux prédateurs. Ces résultats sont présentés en Figure 18. Les taux de mortalité imputables aux virus et aux brouteurs flagellés ont été déterminés selon la méthode d Evans et al. (2003). La corrélation obtenue pour les picocyanobactéries (r = 0,76 ; r α/2 = 0,27) et pour les bactéries hétérotrophes (r = 0,99 ; r α/2 = 0,31) est significative au seuil de 5%. Nous obtenons un taux de mortalité moyen journalier imputable aux virus et aux flagellés de 4,2%.j -1 chez les 16

22 picocyanobactéries sur 7 jours (entre T0 et J7) contre 30,9%.j -1 hétérotrophes sur 5 jours (entre T0 et J5). chez les bactéries L enrichissement Le facteur d enrichissement obtenu n a été que de 1,6 dans la fraction <11 et de 1,8 dans la fraction <2, au lieu de la valeur x5 théoriquement escomptée. Les courbes de croissance des communautés microbiennes étudiées sont présentées en Figure 19. En ce qui concerne la fraction <11, les picocyanobactéries et les bactéries présentent des dynamiques comparables à celles obtenues dans le cadre de l expérience de dilution. Les bactéries hétérotrophes présentent néanmoins une baisse de leurs concentrations cellulaire le 6 ème jour au lieu du 4 ème ou 5 ème jour en dilution. Les concentrations cellulaires des picocyanobactéries dans les fractions enrichies en virus sont inférieures à celles des témoins et les concentrations cellulaires de la fraction <2 sont inférieures à celles de la fraction <11. Le taux de croissance net journalier des picocyanobactéries dans le traitement <11+FV est de 0,17 j -1 contre 0,23 j -1 dans le témoin (<11-FV). Ce même taux de croissance dans le traitement <2+FV est de 0,16 j -1 contre 0,18 j -1 dans le témoin (<2-FV). Les concentrations cellulaires des bactéries hétérotrophes présentent des résultats opposés à ceux observés chez les picocyanobactéries. En effet, leurs concentrations cellulaires dans les fractions enrichies en virus sont supérieures aux témoins et les concentrations cellulaires de la fraction <2 sont supérieures à celles de la fraction <11. Le taux de croissance net journalier des bactéries hétérotrophes dans le traitement <11+FV est de 0,28 j -1 contre 0,27 j -1 dans le témoin (<11-FV). Ce même taux de croissance dans le traitement <2+FV est de 0,39 j -1 contre 0,36 j -1 dans le témoin (<2- FV). Des corrélations entre les concentrations cellulaires des picocyanobactéries, des bactéries hétérotrophes et des virus dans la fraction enrichie en virus (+FV) en fonction de celles du témoin uniquement enrichi en MO (-FV) ont été réalisées pour l <11 et l'<2 et sont présentées en Annexe III. Pour les picocyanobactéries et les bactéries hétérotrophes, bien que les corrélations soient significatives au regard des coefficients de corrélation supérieurs au r α/2 de 0,71 au seuil 5%, le test U de Mann et Whitney révèle qu il n y a pas de différence significative entre les échantillons (α = 5%). En revanche, ce même test appliqué au virus dénombrés dans les enceintes d enrichissement montre qu ils sont significativement en nombre supérieur à ceux dénombrés dans les témoins La seconde expérience Le but de la seconde expérience, outre le fait de se placer à un autre moment de l année et d observer possiblement un impact différent, a été d améliorer et affiner la qualité des résultats précédents. Pour l expérience de dilution, la fraction <11 a été diluée avec de l eau ultra pure et de l eau filtrée sur <0,2 μm pour tenter de dissocier l effet des virus de celui des 17

23 protozoaires. Nous avons aussi travaillé avec des triplicats. Pour l expérience d enrichissement, nous avons décidé de ne travailler que sur la fraction <2 afin d essayer d améliorer le facteur de concentration. Malheureusement, aucun résultat probant n a été obtenu, faute attribuable à la méthodologie employée. Nous n en parlerons donc pas et ne développerons dans la suite que les résultats de l expérience de dilution. Sur la Figure 20 sont représentés les gradients de concentration en virus suite à la dilution de l échantillon avec l eau ultra pure (Fig 20 A) et l eau filtrée sur 0,2 μm (Fig 20 B). La figure A montre que qu il y a 5 fois plus de virus dans la fraction totale que dans celle diluée 5 fois, comme escompté. La figure B montre qu il y a 0,7 fois plus de virus dans la fraction totale que dans celle diluée 5 fois. Ce gradient de concentration virale, n est pas significatif, comme escompté. Dans le cadre de cette seconde expérience, le suivi des eucaryotes a été aussi pris en considération, notamment en raison de l émergence des VLP3 obtenus au cours de la 1 ère expérience. Avec la dilution à l eau ultra pure (Figure 21), les picocyanobactéries présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu au 5 ème jour pour les fractions <11 totale et diluées à 40 et 70% et jusqu au 6 ème jour pour la fraction 20%. Le taux de croissance net sur cette période varie entre 0,35 j -1 pour la fraction diluée à 20% et 0,46 j -1 pour la fraction totale. Les eucaryotes montrent des concentrations cellulaires croissantes dans le temps, quelque soit la dilution. Les concentrations des fractions 0,2 à 0,7 doublent en sept jours. Les virus quant à eux présentent des concentrations quasi constantes tout au long de l expérience. Les bactéries présentent des dynamiques différentes. En effet, jusqu au 4 ème jour les concentrations cellulaires croissent pour toutes les dilutions puis diminuent. Le taux de croissance net sur cette période varie entre 0,64 j -1 pour la fraction diluée à 20% et 0,24 j -1 pour la fraction totale. De plus, moins la fraction est diluée et plus les concentrations sont élevées alors qu à partir du 4 ème jour cette tendance s inverse. Avec la dilution avec de l eau filtrée sur 0,2 μm (Figure 22), les picocyanobactéries présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu au 5 ème jour pour les fractions <11 totale et diluée à 70% et jusqu au 6 ème jour pour les fractions 20 et 40%. Le taux de croissance net entre les 6 premiers jours varie entre 0,27 j -1 pour la fraction diluée à 20% et 0,30 j -1 pour la fraction totale. Les eucaryotes présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires sur la durée de l expérience. Les concentrations enregistrées dans les fractions totale et 40% doublent alors que la concentration dans la fraction 20% triple en sept jours. Les virus montrent des concentrations qui augmentent sur la durée de l expérience (on note une différence de l ordre de 10 7 particules/ml entre le T0 et le 7 ème jour). Les bactéries des traitements 70 et 100% présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires entre le début et le premier jour de l expérience 2 puis une quasi constance jusqu au 4 ème jour avant de diminuer fortement jusqu à la fin du suivi (les 18

24 concentrations du 4 ème jour sont divisées par 2 environ). Les bactéries des fractions 0,4 et 0,2 présentent une faible augmentation de leurs concentrations cellulaires jusqu au 6 ème jour avant de diminuer ; le 2 ème jour faisant exception puisque les concentration sont plus faibles qu au 1 er et 3 ème jour. Le taux de croissance net entre les 5 premiers jours varient entre 0,51 j -1 pour la fraction diluée à 20% et 0,22 j -1 pour la fraction totale. Les résultats concernant les calculs des taux de mortalité des bactéries (entre T0 et J4) et picocyanobactéries (entre T0 et J5) sont présentés en Figure 23. Les corrélations entre les taux de croissance nets journaliers et les facteurs de dilution obtenues pour les picocyanobactéries (r = 0,93 et r = 0,64 ; r α/2 = 0,27) et pour les bactéries hétérotrophes (r = 0,77 et r = 0,89 ; r α/2 = 0,27) sont significatives au seuil de 5%. Les résultats obtenus pour les picocyanobactéries ne permettent pas de calculer de taux de mortalité. En effet, les pentes des droites de régression sont positives. Nous obtenons néanmoins un taux de mortalité moyen journalier imputable aux virus et aux flagellés de 41,5 %.j -1 et un taux de mortalité imputable aux flagellés de 32 %.j -1 chez les bactéries hétérotrophes sur 6 jours (T0 à J6). Nous en déduisons un taux de mortalité imputable aux virus de 9,5 %. Tout comme dans la première expérience in situ, nous avons détecté la présence de la population virale nommée VLP3. Cette population est présente en concentrations non négligeables (> part.ml -1 dans la fraction 100% d <11) dès le début de l expérience 2, contrairement à ce que l on avait pu constater lors de la première expérience (~10 4 part.ml -1 ). Les concentrations de ces particules virales sont multipliées par 2,2 entre le 5 ème et dernier jour de la manip, passant de 7,5x10 5 à 1,8x10 6 part.ml -1 dans la fraction d eau totale. Ces concentrations passent même de 1x10 5 à 1,1x10 6 part. ml -1 dans la fraction 20% d <11. Bien que cette population soit présente dès le début de la seconde expérience, ses concentrations n atteignent pas celles observées dans la première (C max = 1, part.ml -1 contre dans la 1 ère manip). Les corrélations entre les concentrations des VLP3 et des autres communautés étudiées (picocyanobactéries et bactéries hétérotrophes) n avaient rien révélé de significatif dans le cadre de la 1 ère expérience de dilution. La signature de cette population semblant se rapprocher de ce qui a déjà était décrit comme étant celle d un virus à eucaryote (voir discussion), nous avons décidé d étudier la population eucaryotique dans le cadre de la seconde expérience. Les résultats des corrélations linéaires obtenues entre les abondances des VLP3 et des eucaryotes sont présentés en Figure 24. Les corrélations obtenues dans le cas de la dilution à l eau ultra pure (Fig 24 A) et dans le cas de la dilution à l <0,2 (Fig 24 B), sont significatives au seuil 5% (r α/2 = 0,38) ; les pentes sont respectivement de 54 et 50. On compte donc environ 54 VLP3 par eucaryote dans l expérience de dilution à l eau ultra pure et 50 VLP3 par eucaryote dans l expérience de dilution à l <0,2. 19

25 DISCUSSION 1. Le suivi de la dynamique des communautés microbiennes Aucune donnée concernant la dynamique des communautés microbiennes du lac Léman n a été publiée à ce jour. Seules celles acquises par Personnic dans le cadre de son DEA (2003) permettent d avoir un point de comparaison. La succession des communautés enregistrée entre février et mai 2004 est comparable à celle de En effet, après l augmentation des abondances des picoeucaryotes, les bactéries puis les picocyanobactéries voient leur biomasse augmenter avant celle des virus. Les picocyanobactéries présentent les variations classiquement observées en milieu lacustre sur la période d étude comprise entre février et mai (Weisse, 1993 ; Callieri et Stockner, 2002 ; Bettarel et al., 2003). En effet, après la période hivernale caractérisée par des concentrations relativement faibles, on observe une prolifération printanière classique entre 0 et 20 mètres, favorisée par l augmentation des températures, l accroissement de la luminosité et la présence de nutriments dans les eaux de surface. La communauté bactérienne présente également une expansion du nombre de cellules au printemps typiquement observée en milieu lacustre comme en milieu marin (Li, 1998 ; Bettarel et al., 2003). On aurait pu s attendre à observer l accroissement de biomasse bactérienne après celle des picocyanobactéries puisque la théorie suppose que les bactéries profitent du développement phytoplanctonique pour récupérer la matière organique libérée par les cellules autotrophes. On peut donc supposer que dans le lac Léman, les bactéries hétérotrophes tirent avantage d un autre apport en matière organique. Cet apport est probablement lié aux petits eucaryotes puisqu ils présentent deux pics de concentration dont un antérieur à celui des bactéries. La communauté virale révèle également une nette augmentation de ses concentrations au printemps. Les abondances virales augmentent nettement suite à la prolifération des bactéries hétérotrophes. En théorie, les virus présentent une augmentation de leurs concentrations cellulaires suite à l augmentation des abondances de leurs hôtes. L augmentation précoce des virus en avril par rapport à celle des bactéries a déjà été mesurée par Wommack et al. (1992) dans la baie de Chesapeake en milieu marin et avait également été observé en octobre. Il serait donc intéressant de poursuivre le suivi de la dynamique des communautés microbiennes du lac Léman durant la période automnale, d autant que cette augmentation attendue a en effet été observée sur le lac du Bourget, voisin (Personnic et al., non publié). Le rapport entre les abondances virales et bactériennes (VBR) a également été analysé car ce paramètre peut être utile pour la construction de théories concernant les effets de l infection virale sur les communautés d hôtes bactériens. Toutefois, Wommack et Colwell (2000) soulignent qu il 20

26 est important de considérer que ce rapport peut être influencé par une multitude de facteurs contrôlant la production et la perte de virus et de bactéries et qu il faut l interpréter avec précaution. D après ces mêmes auteurs, les valeurs de VBR sont faibles pour les environnements peu productifs car pauvres en nutriments. Aussi, après avoir consulté les valeurs de suivi des nutriments dans le cadre de la CIPEL (données non montrées), il apparaît que la concentration des nutriments est la plus faible lors de la période des blooms de virus, de picocyanobactéries et de bactéries hétérotrophes. Nos résultats indiquent que la période correspondant aux plus faibles concentrations en sels nutritifs coïncide avec les plus faibles valeurs de VBR obtenues. 2. Les tests méthodologiques La comparaison de méthodes effectuée entre les données de cytométrie et de microscopie à épifluorescence semble montrer que la seconde sous estime de manière importante les résultats liés au comptage. En effet, on sous estime à plus de 60% les abondances en picocyanobactéries et en bactéries hétérotrophes. La technique de comptage des bactéries et virus en cytométrie ayant fait ses preuves (Marie et al., 1999 ; Brussard et al, 2000 ; Brussaard et al., 2004), on peut penser que ce biais est imputable à la microscopie et plus précisément à la préparation de l échantillon et son observation. En effet, la microscopie repose sur des comptages effectués par l homme et non par la machine. On estime les abondances bactériennes et virales sur des échantillons filtrés. Ces étapes de filtration peuvent entraîner une perte de cellules par passage au travers de la maille filtrante mais aussi par rupture des cellules suite aux pressions mécaniques. Les échantillons sont également traités au SYBR Gold qui est un colorant de l ADN dont l intensité de fluorescence diminue avec le temps d observation (Chen et al., 2001). Il est donc certain qu une partie des particules n est pas comptée. De plus l ensemble des cellules et particules présentes sur le filtre n est pas totalement énuméré puisque seulement 5 champs sont observés et les abondances cellulaires et particulaires sont extrapolées à l ensemble du filtre. Le biais majeur concerne les comptages de virus. En effet, aucune corrélation n a pu être établie entre les données fournies par les deux méthodes. Il semblerait qu en microscopie les comptages, bien que fournissant des nombres de l ordre de grandeur de ceux obtenus en cytométrie (~ 10 7 ), ne permettent pas d observer les variations en fonction de la profondeur et du temps détectées comme en cytométrie. Enfin, le protocole suivi pour la coloration des particules virales dans le cadre des comptages en épifluorescence ne comporte pas d étape de chauffage des échantillons à 75 C comme dans le protocole de cytométrie. Or, on peut penser, comme le suggèrent Marie et al. (1999), que les virus des échantillons frais pourraient avoir une structure rendant les acides nucléiques non immédiatement accessibles au colorant. Ainsi, la chaleur dénaturerait la capside virale, permettant au colorant une meilleur pénétration. Ceci pourrait 21

27 expliquer pourquoi seule une partie des virus a été comptée en microscopie à épifluorescence alors que la cytométrie a fournie des résultats plus proches de la réalité. Cette hypothèse sera bientôt vérifiée à partir de la comparaison entre différentes méthodes de comptage incluant la microscopie électronique à transmission. Le test de conservation des échantillons a révélé qu il était possible d analyser les picocyanobactéries et bactéries hétérotrophes après 2 jours de conservation à 4 C sans risquer de biaiser les résultats et sans avoir à fixer les échantillons. Ce résultat est intéressant étant donné la surcharge d analyses à faire en laboratoire à certaines périodes et compte tenu des pertes que peuvent engendrer la fixation. Jacquet et al. (1998) avaient déjà montré que 10h de conservation à 4 C n avaient pas d influence sur les paramètres observés en cytométrie pour les souches Prochlorococcus (MED4) et Synechococcus (WH 8103). Sur 48h, les cellules ont eu le temps de se diviser mais il semble donc que les basses températures inhibent la division cellulaire si bien que les concentrations restent les mêmes. Par contre, il ne semble pas possible de différer l analyse à deux jours pour les virus dont la perte est très importante. Dans l avenir, il sera intéressant de tester ce mode de préservation sur les communautés eucaryotiques, réputées sensibles, mais également d utiliser différents fixateurs et modes de conservation pour des préservations plus longues (4 C, - 22 C, -80 C, azote liquide). 3. Les expériences in situ 3.1. Impact des virus vs. protistes flagellés Dans leur article sur les estimations de la contribution de la lyse virale et du broutage par le microzooplancton sur la mortalité de populations du picoeucaryote Micromonas sp., Evans et al. (2003) concluent qu il est nécessaire de mener de nouvelles expériences sur de nouvelles communautés. C est ce à quoi répond une partie de ce travail de DEA. Lors de l expérience réalisée en avril, le taux de mortalité imputable conjointement aux virus et aux flagellés a été de 4,2% pour les picocyanobactéries. Ce résultat est en accord avec ceux trouvés dans la littérature. Bien que nous ne fassions pas la part entre la mortalité imputable aux virus et aux flagellés, il semble que généralement l impact des virus sur les cyanobactéries du genre Synechococcus est relativement faible (<10%, Suttle, 2000). L impact des flagellés peut aussi être faible, les picocyanobactéries étant plutôt la proie de prédateurs plus grands comme les ciliés ou le métazooplancton (Weisse et al., 1993). Nous n avons pas obtenu de résultast chez les picocyanobactéries pour la même expérience réalisée en mai. Cette lacune semble indiquer que la méthode n est pas bien adaptée à l étude des communautés picocyaobactériennes, comme déjà souligné par de Jacquet et al. (soumis). 22

28 Le taux de mortalité imputable aux virus et aux flagellés sur les communautés bactériennes a été de 30,8% en avril contre 41,5 % en mai. Il semblerait donc que la mortalité des bactéries augmente avec l accroissement des températures printanières. Il est admis que la température peut être un important facteur dans le contrôle des abondances virales et qu elle contrôle les taux de croissance bactériens et a un effet positif significatif sur la production bactérienne (White et al., 1991 ; Jiang et Paul, 1994). Ainsi, on peut supposer que l augmentation des abondances bactériennes en mai ait favorisée la probabilité de contact entre les virus et leurs hôtes bactériens, conduisant in fine à l augmentation des taux de mortalité enregistrés en mai. De plus, les populations bactériennes ont présenté un «bloom» quelques jours avant la seconde expérience in situ, offrant donc très certainement une plus grande diversité bactérienne à des virus qui avaient moins d hôtes potentiels en avril. Ces hypothèses seront confirmées ou infirmées grâce aux données de DGGE qui seront obtenues cet été. La part de mortalité imputable aux virus n a pu être calculée que pour les bactéries hétérotrophes de la seconde expérience (9,5%). Ces résultats sont en accord avec ceux trouvés dans la littérature. D après Wommack et Colwell (2000), la gravité de la lyse virale in situ peut être différente selon le groupe planctonique considéré. Nos résultats sont en accord avec ceux trouvé par Suttle (1994) qui conclue qu entre 10 et 20% des populations de bactéries hétérotrophes sont perdues par jour à cause de l infection virale alors qu un nombre considérablement plus faible de cyanobactéries (<3% j -1 ) sont tuées par lyse virale. La part de mortalité imputable aux flagellés calculée pour la seconde expérience (32%) est également en accord avec les données fournies dans la littérature. En effet, celle-ci peut varier ente 0,1 et 71,5% (Annexe V). La succession des pics de bactéries hétérotrophes et des virus observée dans le cadre du suivi de la dynamique des populations microbiennes du lac Léman supporte l idée que les bactériophages provoquent la lyse et par conséquent les changements des abondances bactériennes. Les expériences de dilution confirment cette hypothèse. En effet, en considérant que la majorité des virus comptés en cytométrie sont des bactériophages, on observe des VBR compris entre 2 et 10 dans la première expérience de dilution à l eau ultra pure et compris entre 0,02 et 0,3 dans la seconde. D après la littérature, ces ratios sont généralement compris entre 3 et 10 mais peuvent être plus élevés pour les environnements riches en nutriments (Wommack et Colwell, 2000 ; Annexe IV). On considère que des valeurs de VBR <10 sont révélatrices de faibles niveaux de mortalité bactérienne imputable aux virus, alors que des valeurs >10 sont caractéristiques des conditions favorables à la lyse virale (Wilcox et Fuhrman, 1994). Par conséquent, dans le cadre de nos expériences, les valeurs des ratios indiquent que les virus contribuent à une faible part de la mortalité des bactéries du lac Léman aux périodes étudiées. 23

29 Il semble que la part de mortalité imputable aux virus soit liée au statut trophique du lac. En effet, en Annexe IV sont synthétisées les données concernant les abondances virales ainsi que les données relatives à l impact viral sur la mortalité bactérienne dans différents lacs se distinguant par leur statut trophique. Il apparaît clairement que plus le lac est eutrophisé et plus le VIBM, c'est-àdire la part de mortalité bactérienne imputable aux virus, est élevée. De la même façon sont synthétisés en Annexe V les données concernant l impact des brouteurs sur la mortalité bactérienne de différents lacs différant par leur statut trophique. La part de mortalité bactérienne imputable aux brouteurs ne semble pas liée au statut trophique. En effet, les valeurs mesurées pour un lac varient fortement (6-71,5% de perte due au broutage dans le lac d Annecy). A défaut d intervenir de manière importante ou visible dans la mortalité du bactérioplancton, il est possible que les virus aient plus un rôle dans le contrôle de la biodiversité. C est en partie ce que nous voulions vérifier au travers des expériences d enrichissement, travail qui sera poursuivi au cours de l été. Les expériences d enrichissement ont révélé que bien que les facteurs d enrichissement obtenus soient plus faibles que ceux escomptés, il y a significativement plus de virus dans les bouteilles enrichies que dans les témoins mais cette augmentation ne provoque pas de variation significative des quantités de picocyanobactéries et de bactéries par rapport aux témoins. Alors que l on observe une augmentation des abondances bactériennes avant une chute sur les deux derniers jours de l expérience, les concentrations virales présentent une faible augmentation de leurs concentrations. On aurait du s attendre à une forte augmentation des concentrations virales suite à la chute de celles des bactéries. En effet, après avoir infecté son hôte, le virus se multiplie et est libéré en grande quantité dans le milieu. Dans les enceintes d enrichissement, les bactéries et/ou le phytoplancton pourraient être responsable de la production d enzymes qui dégradent les protéines virales et les acides nucléiques. Il a été montré que le picoplancton est capable d excréter une substance muqueuse qui les protège indirectement de l infection virale (Murray, 1995) et il est également possible que l enrichissement viral déclenche la production bactérienne d exoenzymes nécessaire au métabolisme de dégradation des composants viraux. Enfin, il est également possible qu une large part des virus ajoutés dans les enceintes d enrichissement n aient pas trouvé d hôte à leur convenance. On peut supposer que le nombre de cellules hôtes dans les enceintes d incubation soit en assez grand nombre pour éliminer une partie des virus. Le but des expériences d enrichissement qui seront reconduites sera donc d améliorer le facteur d enrichissement suffisamment pour pouvoir calculer des taux de mortalité. Avec des résultats significatifs, nous pourrions alors comparer les deux méthodes et faire le choix de celle la mieux adaptée à ce type d étude. Il est relativement difficile de comparer nos résultats avec la littérature puisque seules 3 études ont utilisé la même approche de dilution sur les communautés naturelles (Evans et al., 2003 ; 24

30 Wilehlm et al., 2002 ; Jacquet et al., soumis). De plus, aucune étude n a suivi la mortalité des picocyanobactéries en plus de celle des bactéries hétérotrophes ou n a utilisé les 2 méthodes en parallèle. La population virale nommée VLP3 détectée lors des 2 expériences in situ est présente en faible abondance pendant les 5 premiers jours de la première alors qu elle apparaît en forte abondance dès le début de la seconde. L émergence de ces virus entre le 4 ème et 5 ème jour de la première expérience mène à supposer que ces virus ont infectés leurs hôtes entre le 1 ère et 5 ème jour. Cette population virale a la même signature que celle observée dans des études concernant l infection virale chez des eucaryotes phytoplanctoniques. Jacquet et al. (2002) révèlent, sur la base de la signature cytofluorimétrique, la présence d une population virale qui infecte l eucaryote photosynthétique Emiliana huxleyi. De la même façon, Brussard et al., (1999), décrivent les caractéristiques de la signature cytofluorimétrique d une population virale qui infecte le Prymnesiophyceae Phaeocystis pouchetii. Les données des corrélations obtenues entre les VLP3 et les petits eucaryotes photosynthétiques semblent indiquer que cette population virale infecte les populations eucaryotiques avec 50 VLP3 pour 1 eucaryote. Il est donc fort probable que ces VLP3 soient des virus à eucaryote. L émergence de ce virus n était pas spécialement attendu au moment de l élaboration de ce projet, si bien que nous n avons pas concentré nos recherches au-delà (voir les perspectives) Avantages et limites des méthodes, perspectives L inconvénient majeur rencontré dans les expériences in situ a été l expérience d enrichissement. En effet, le facteur d enrichissement escompté pour les deux expériences n a pas été atteint. Ce problème est la conséquence d un manque de matériel spécifique à l étape d ultra concentration. Etant muni d une seule pompe péristaltique, cette étape nous demandait environ 3 heures pour 5 litres d eau du lac préfiltrée sur 0,2 μm. Les volumes importants que nous avions à ultra filtrer ne nous permettaient pas d augmenter les quantités. Le facteur temps n a pas été le seul problème puisque d après nos calculs, nous aurions du obtenir le concentrât nécessaire. La seconde limite est la cassette d ultra filtration, dans un futur proche, il est prévu d acquérir du matériel plus performant mais aussi d utiliser un autre protocole de concentration virale : l ultra centrifugation. Bien que la technique de dilution semble présenter moins de biais de filtration que l enrichissement puisqu il n y a pas d étape d ultra concentration, cette technique repose également sur des étapes de filtration en série. Aussi, on sait bien que ces différentes étapes ne sont pas dépourvues de biais : à chaque niveau, des organismes que l on pense éliminer, peuvent passer au travers de la maille filtrante. Aussi, des échantillons de chaque étape de dilution ont été conservés et 25

31 comptés en cytométrie en flux ou fixés dans le but de vérifier l absence ou la présence des protistes (en cours). La difficulté majeure de ce travail est de raisonner sur des communautés. En effet, les travaux précurseurs se sont intéressés à des populations précises et non à des assemblages. La complexité de ces associations microbiennes ainsi que l hétérogénéité spatiale de leurs distributions font que les résultats sont à considérer avec une extrême précaution. Nous ne sommes donc qu aux prémices de ce type d étude qui demande à être reconduite plusieurs fois à différents moments de l année pour valider les résultats. Sur l ensemble des traitements mis en place dans le cadre des deux expériences de dilution et d enrichissement, soit 78 échantillons, nous avons pratiqué des expérience de biologie moléculaire afin d étudier les variations de diversité bactérienne. Nous avions choisi de pratiquer la technique de DGGE, maîtrisée en routine au Laboratoire de Microbiologie Aquatique de Thonon. Malheureusement, aucun résultat n a été obtenu à ce jour. En effet, il semble que la quantité d ADN par échantillon ait été trop faible pour pouvoir obtenir une amplification par PCR. Différents tests ont donc été mis en place afin d amplifier l ADN contenu dans nos échantillons mais pour l instant sans résultat. Nous avons donc pour objectif de poursuivre ces tests afin de pouvoir amplifier suffisamment l ADN bactérien et réaliser les expériences de DGGE. Les études supplémentaires imaginables dans le cadre des expériences in situ pourraient être d effectuer un suivi de l activité bactérienne par la méthode d incorporation de la thymidine tritiée et de l infectivité virale par observation en microscopie électronique à transmission (envisageable dans le cadre de la collaboration existant avec le Laboratoire de Biologie des Protistes de Clermont- Ferrand). En effet, ces données donnent déjà des résultats très intéressants dans le cadre d expériences similaires à cette étude. Il semble qu en milieu lacustre la fréquence des bactéries visiblement infectées (FVIC) soit supérieur dans les environnements moins productifs (Bettarel et al., 2004) alors qu en milieu marin les valeurs de FVIC augmentent avec la productivité (Steward, 1996 ; Weinbauer et al., 2003) ou il n y a pas d évidence de relation entre FVIC et productivité (Noble et Fuhrman, 2000). Les sels nutritifs peuvent devenir limitants dans les enceintes d incubation. Il serait donc intéressant de faire un suivi des variations des concentrations en sels nutritifs dans les différentes bouteilles au cours du temps mais cela suppose de travailler avec des volumes importants, ce qui est très difficile avec ce type de schéma expérimental. Enfin, il serait intéressant d isoler, caractériser et travailler sur les implications écologiques de la population virale nommée VLP3. 26

32 CONCLUSION En plus de montrer une nouvelle fois l efficacité de la cytométrie en flux pour suivre la dynamique des populations microbiennes aquatiques, cette étude a révélé que les eaux de surface du lac Léman subissent des variations importantes en terme d abondances des populations picophytoplanctoniques, bactériennes et virales. Après une période hivernale caractérisée par des concentrations microbiennes relativement faibles, ces communautés présentent des «blooms» printaniers successifs. Afin de mieux comprendre certains processus qui régissent la dynamique microbienne, nous avons étudié le rôle fonctionnel des virus et des protistes flagellés en tant qu agents de mortalité bactérienne. Les premiers résultats montrent que les flagellés induisent la plus grande part de la mortalité des bactéries hétérotrophes (>30%) bien que celle imputable aux virus est loin d être négligeable (9,5%). Cette étude nécessiterait d être reconduite pour plusieurs raisons. En supposant que les expériences d enrichissement fournissent des résultats, une comparaison entre celles-ci et la méthode de dilution pourra être effectuée, ce qui permettra de dire laquelle est la plus appropriée et pourquoi. Nous pourrions envisager de compléter les analyses effectuées sur les échantillons par des mesures de production bactérienne pour déterminer plus précisément les effets de la lyse virale et du broutage sur les cycles de la matière au sein de la boucle microbienne ou encore par des mesures de taux d infection virale par microscopie électronique à transmission. Enfin, bien que les expériences de DGGE n ont pas encore fourni de résultats, il est probable que nous obtiendrons des informations cruciales à la compréhension des résultats déjà acquis. Les perspectives sont donc nombreuses et prometteuses. 27

33 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Ackermann, H.W., Frequency of morphological phage descriptions in the year Archives of Virology 146, Ackermann, H.W., Dubow, M.S., Viruses of prokaryotes, vol I, general properties of bacteriophages. CRC Press, Boca Raton, pp Azam, F.T., Fenchel, J.G., Field, J.S., Gray, L.A., Meyer, R., Thingstad, F., The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology - Progress Series 10, Bergh, Ø., Børsheim, K.Y., Bratbak, G., Heldal, M., High abundances of viruses found in aquatic environments. Nature 340, Bettarel Y., Sime-Ngando T., Amblard C., Carrias J.F., Portelli C., Virioplankton and microbial communities in aquatic systems : a seasonal study in two lakes of differing trophy. Freshwater Biology 48, Bettarel, Y., Sime-Ngando, T., Amblard, C., Dolan, J., Viral Activity in Two Contrasting Lake Ecosystems. Applied and Environmental Microbiology 70, Børsheim, G., Bratbak, G., Heldal, M., Enumeration and biomass estimation of planktonic bacteria and viruses by transmission electron microscopy. Applied and Environmental Microbiology 56, Bratbak, G., Heldal, M., Norland, S., Thingstad, T.F., Viruses as partners in spring bloom microbial trophodynamics. Applied and Environmental Microbiology 56, Brussaard, C.P.D., Optimization of procedures for counting viruses by flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology 70, Brussaard, C.P.D., Marie, D., Bratbak, G., Flow cytometric detection of viruses. Journal of Virology Methods 85, Ackermann HW, Frequency of morphological phage descriptions in the year Archives of Virology, 146 : Brussaard, C.P.D., Thyrhaug, R., Marie, D., Bratbak, R., Flow cytometric analyses of viral infection in two marine phytoplankton species, Micromonas pusilla (Prasinophyceae) and Phaeocystis pouchetii (Prymnesiophyceae). Journal of phycology 35, Callieri C., Stockner J.G., Freshwater autotrophic picoplankton : a review. Journal of Limnology 61, Chen, F., Lu, J., Binder, B.J., Liu, Y., Hodson, R.E., Application of Digital Image Analysis and Flow Cytometry To Enumerate Marine Viruses Stained with SYBR Gold. Applied and Environmental Microbiology 67, Chiura, H.X., Generalized gene transfer by virus-like particles from marine bacteria. Aquatic Microbial Ecology 13, Clokie, M.R.J., Millard, A.D., Wilson, W.H., Mann, N.H., Encapsidation of host DNA by bacteriophages infecting marine Synechococus strains. FEMS Microbiology Ecology 46, Cottrell, M.T., Suttle, C.A., Genetic diversity of algal viruses which lyse the photosynthetic picoflagellate Micromonas pusilla. Applied and Environmental Microbiology 61, Eissler, Y., Quinones, A.R., The effsct of viral concentrate addition on the respiration rate of Chaetoceros gracilis cultures and microplankton from a shallow bay (Coliumo, Chile). Journal of Plankton Research 25, Evans, C., Archer, S.D., Jacquet, S., Wilson, W.H., Direct estimates of the contribution of viral lysis and microzooplankton grazing to the decline of a Micromonas spp. population. Aquatic Microbial Ecology 30, Fisher, U.R., Velimirov, B., High control of bacterial production by viruses in a eutrophic oxbow lake. Aquatic Microbial Ecology 27, Fuhrman, J.A. and Suttle, C.A., Viruses in marine planktonic systems. Oceanography 6,

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37 Weisse, T., Dynamics of autotrophic picoplankton in marine and freshwater ecosystems. Advances in Microbial Ecology 13, Wetzel, Likens, Limnological analyses, 3 rd edition, Springer verlag, NY, 429 p, pp White, P.A., Kalff, J., Rasmussen, J.B., Gasol, J.M., The effect of temperature and algal biomass on bacterial production and specific growth rate in freshwater and marine habitats. Microbial Ecology 21, Wilcox, R.M., Fuhrman, J.A., Bacterial viruses in coastal seawater : lytic rather than lysogenic production. Marine Ecology Progress Series 114, Wilhelm, S.W., Suttle, C.A., Viruses and nutrient cycles in the sea. Biosciences 49, Wilhelm, S.W;, Brigden, S.M., Suttle, C.A., A dilution technique for the direct measurement of viral production : a comparison in startified and tidally mixed coastal waters. Microbial Ecology 43, Wommack, K.E., Colwell, R.R., Virioplankton : viruses in aquatic ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews 64, Wommack, K.E., Hill, R.T, Martin, K., Russek-Cohen, E., Colwell R.R., Distribution of viruses in the Chesapeake Bay. Applied and Environmental Microbiology 58,

38 ANNEXE I Tableau des valeurs fournies par l OCDE (Organisation for Economic Co-operation and Development) pour évaluer le niveau trophique d un lac. D après le rapport de l O.C.D.E., Eutrophisation des Eaux. Méthodes de Surveillance, d Évaluation et de Lutte. OCDE, Paris. Catégorie trophique P tot (μg.l -1 ) Chl a (μg.l -1 ) Moyenne Chl a (μg.l -1 ) Maximum Secchi (m) Moyenne Secchi (m) Minimum Ultra-oligotrophie 4 1 2, Oligotrophie 10 2, Mésotrophie , ,5 Eutrophie ,5 1,5 0,7 Hypereutrophie ,5 0,7

39 ANNEXE II Exemples de cytogrammes obtenus lors de la première expérience terrain entre le jour 1 (J1) et le jour 9 (J9) : en bleu la population de virus VLP1, en rose la population de virus VLP2 et en rouge la population de virus VLP3. FSC et SSC correspondent à des critères de taille, FL1 et FL3 correspondent à des critères de fluorescence. J1 J9

40 ANNEXE III Relations entre les concentrations cellulaires de chaque communauté pour l échantillon enrichi (+FV) en virus et l échantillon non enrichi (-FV) constituant le témoin. Picocyanobactéries pour l'<11 A Picocyanobactéries pour l'<2 D 2,4E+04 y = 1,2886x ,3 R 2 = 0,9889 2,4E+04 y = 1,2693x ,9 R 2 = 0,9625 Témoin 1,6E+04 8,0E+03 Témoin 1,6E+04 8,0E+03 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 8,0E+03 1,6E+04 2,4E+04 0,0E+00 8,0E+03 1,6E+04 Enrichi Enrichi Bactéries hétérotrophes pour l'<11 B Bactéries hétérotrophes pour l'<2 E 1,5E+07 y = 0,8538x R 2 = 0,9928 1,5E+07 y = 0,8781x R 2 = 0,9906 Témoin 1,0E+07 5,0E+06 Témoin 1,0E+07 5,0E+06 0,0E+00 0,0E+00 0,0E+00 8,0E+06 1,6E+07 0,0E+00 8,0E+06 1,6E+07 Enrichi Enrichi Virus pour l'<11 C Virus pour l'<2 F 1,0E+08 y = 0,6367x + 1E+06 R 2 = 0,9537 8,30E+07 y = 0,8112x - 9E+06 R 2 = 0,533 Témoin 6,0E+07 Témoin 4,30E+07 2,0E+07 3,00E+06 2,0E+07 6,0E+07 1,0E+08 3,0E+06 4,3E+07 8,3E+07 Enrichi Enrichi

41 ANNEXE IV Abondances virales, VBR (Ratio Virus:Bacterie), BS (Burst Size ou nombre de particules virales libérées par lyse de cellules hôtes), FVIC (Fraction of Visibly Infected Cells), FIC (Fraction of Infected Cells) and VIBM (Virus-Induced Bacterial Mortality) dans quelques lacs européens. O: Oligotrophique, M: Mesotrophique and E: Eutrophique. nd: non déterminé. Lac et localisation Gossenköllesee, Autriche Rédo, Pyrenées centrales Constance, Allemagne Plussee, Allemagne Statut trophique Abondance (x 10 6 Part.mL - 1 ) O < <5 VBR BS FVIC ou FIC (%) VIBM (%) Référence Höfer & Sommaruga (2001) Pina et al. (1998) O Pina et al. (1998) M Hennes & Simon (1995) E 0.3-> Bergh et al. (1989) Demuth et al. (1993) Weinbauer & Hoffle (1998) h -1 Heldal & Bratbak (1991) Kalandsvannet, Norvège Pavin, France O-M Bettarel et al. (2003, 2004) Aydat, France E Bettarel et al. (2003, 2004) Reservoire Sep, France Alte Donau, Autriche Reservoire Rimov, Republique Tchèque Gäddtjärn Fisklösen (Norvège) O-M Pradeep Ram et al. (unpublished) E Fisher & Velmirov (2002) M-E d -1 Simek et al. (2001) d -1 Weinbauer et al. (2003) O O (23) (25) Bourget, France M Vrede et al. (2003) Jacquet et al. (soumis)

42 ANNEXE V Taux d ingestion, impact du broutage per capita des flagéllés hétérotrophiques et mixotrophiques et broutage par les flagéllés induisant des pertes bactériennes dans des lacs différant par leur statut trophique. O: Oligotrophique, M: Mesotrophique et E: Eutrophique. Flagellés Heterotrophiques Taux de Taux broutage Per d ingestion Bacterie Ind -1 h -1 capita (large variation selon le taxon) 1-45 Bacterie L -1 h -1 % de perte due au broutage BSS : Bacterial Standing Stock BP : Bacterial Production Max : 36x10 6 BSS % : Methode a FMS Max : 30.7x10 6 BP % : FMS Max : 6.1x10 6 BP % : FMS BSS % : BP % : FMS BSS % : 8 28 (bacterivores <20µm) Max : 1.5x10 6 FLB FMS BP % : FLB BP % : FLB Max : 18.9x10 6 FMS BSS % : Max : 20% BP % : Max : 77% 2-53 FMS Site Lac du Bourget France Lac Pavin Statut trophique Référence M Jacquet et al. (soumis) France O-M Bettarel et al. (2003) Lac d Annecy Domaizon et al. France O (2003) Lac Constance Cleven & Weisse Allemagne M-E (2001) Réservoire Rimov République Tchèque Réservoire Sep France Alte Dauno Autriche Plussee Allemagne Lac Erie USA Lac Pavin E O-M E E M Simek & Kojeka (1999) Simek et al. (1997) Thouvenot et al. (1999) Wieltschnig et al. (1999) Weinbauer & Höfle (1998) Hwang & Heath (1997) France O-M Carrias et al. (1996) Lac Oglethorpe USA E Sanders et al. (1989) Flagellés Mixotrophiques Max : 63x10 6 BSS % : FMS Max : 68x10 6 BSS % : FMS FLB Max : 2.6x10 6 FMS Max : 4.5x10 6 FMS 2-53 FMS a : FLB : Fluorescent Labelled Bacteria FMS : Fluorescent Micro-Spheres Lac du Bourget France Lac Annecy France Bassin artificiel England Reservoire Sep France Lac Pavin M O E O-M Jacquet et al. (this study) Domaizon et al. (2003) Hitchmann & Jones (2000) Thouvenot et al. (1999) France O-M Carrias et al. (1996) Lac Oglethorpe USA E Sanders et al. (1989)

43 UMR 42 Centre Alpin de Recherche sur les Réseaux Trophiques des Ecosystèmes Limniques CARRTEL Task Group on Aquatic Microbial Food Webs Station d Hydrobiologie Lacustre de Thonon Solange DUHAMEL Résumé de mémoire de D.E.A. Océanologie Biologique et Environnement Marin Option Connaissance des Producteurs Primaires Université Pierre et Marie Curie, Paris 6 Stage effectué sous la responsabilité scientifique de : Stéphan Jacquet (CR2) Etude quantitative et fonctionnelle des bactériophages du lac Léman : Comparaison de méthodes pour estimer la mortalité bactérienne due à la lyse virale et au broutage par les protozoaires flagellés L énumération et le rôle écologique des virus en milieu lacustre ont été très peu étudiés si bien que les informations manquent pour comprendre la dynamique et la diversité des peuplements microbiens à la base des réseaux trophiques pélagiques. Cette constatation est particulièrement vraie pour le lac Léman pour lequel aucune donnée n existait à ce jour. Le but de ce travail a donc été d étudier la succession des peuplements microbiens du lac Léman au travers des techniques de cytométrie en flux et de microscopie à épifluorescence et de tenter d apprécier la mortalité des bactéries par l action virale. La comparaison des méthodes a révélé l efficacité de la cytométrie en flux pour le comptage des microorganismes et a montré que la microscopie sous-estimait de façon significative les concentrations des bactéries auto- et hétérotrophes et des virus. Le suivi de la distribution des populations microbiennes du lac Léman a révélé une succession marquée des communautés entre février et mai 2004 ainsi que l apparition de pics d abondance printaniers, à commencer par les picoeucaryotes puis les bactéries hétérotrophes, suivi par les picocyanobactéries et enfin les virus. Des expériences in situ ont été élaborées pour tenter d appréhender l impact de la lyse virale sur la mortalité et la diversité de la communauté bactérienne comparativement à l impact de la prédation par les protistes flagellés. Les premiers résultats indiquent que les flagellés et les virus seraient responsables de seulement 4% de la mortalité des picocyanobactéries mais de 31 à 42% de celle des bactéries hétérotrophes. En mai, les virus expliqueraient 10% de la mortalité des bactéries contre 32% pour les flagellés. Nos essais d estimation de la diversité bactérienne n ont rien donné à ce jour mais ils seront renouvelés prochainement. Mots clefs : virus, enrichissement, dilution, cytométrie en flux, lac.

44 Figure 1 : Chronologie des évènements majeurs ayant marqué l histoire de l écologie virale en milieu aquatique 1 ère synthèse sur les cyanopha ges (Padan & Shilo) ère description des particules virales planctoniques (Spencer) 1 ère estimation d abondances virales planctoniques (10 4 particules.ml -1 ) (Torrela & Morita) Concept de la boucle microbienne (Azam et al.) Preuve que l abondance en virus dépasse généralement 10 6 particules.ml -1 (Bergh et al.) Mise en évidence du contrôle des blooms alguaux par les virus (Bratback et al.) Méthode de production virale lytique (Bratback et al.) ère revue sur les virus dans le système planctonique marin (Fuhrman & Suttle) 50% de la mortalité bactérienne est imputable aux virus (Fuhrman & Noble) Mise en place d un protocole pour l étude des virus en épifluorescence (Noble & Fuhrman) Adaptation de la cytométrie à l étude des virus (Marie et al.) ère revue sur le contrôle des virus dans les cycles de la matière (Wilhelm et Suttle) 1 ère revue sur l écologie des virus aquatiques (Fuhrman) ère revue sur l écologie des phages (Weinbauer et al.) Etude de l impact des virus par méthode de dilution (Evans et al.) Preuve de l encapsidation de l ADN hôte par les bactériophages de Synechococcus (Clockie et al.) 1 ère revue sur l analyse en cytométrie des virus aquatiques (Brussaard et al.)

45 Figure 2 : Exemple d utilisation de modèles de flux de carbone pour illustrer le cycle du carbone passant par la boucle microbienne (cas du Golfe du Saint-Laurent). Source :

46 Nutriments minéraux Respiration Photosynthèse Respiration Brouteurs Broutage Excrétion Broutage Phytoplancton : Microalques, cyanobactéries Exudats phytoplanctoniques Matière Organique Dissoute et Particulaire Lyse virale et production de virus Production bactérienne Bactéries hétérotrophes, picophytoplancton picocyanobactéries Lyse virale et production de virus Virioplancton Lyse virale et production de virus Figure 3 : Les virus et la boucle microbienne : schéma du réseau microbien mettant en évidence du rôle potentiel de l infection et de la lyse virale dans la production de matière organique dissoute et particulaire dans les écosystèmes aquatiques. Macrozooplancton Virus Microzooplancton Virus Matière Organique Dissoute Bactéries hétérotrophes Virus Phytoplancton Figure 4 : Schéma du «court-circuit» viral dans la chaîne alimentaire marine. Le pourcentage de production de carbone issu de la lyse virale sur les bactéries hétérotrophes varie entre 8% et 42% au large et entre 6,8% et 25% à la côte. D après Wilhelm et Suttle (1999). Virus

47 Lyse : «Killing the winner» : les virus gardent le contrôle sur les dominants compétitifs, ce qui permet la co-existence des espèces procaryotiques Lyse : «Lysis product release» : les virus libèrent une source de matière organique par lyse cellulaire, qui est utilisée différemment par les espèces procaryotiques et apportent des enzymes affectant les espèces de différentes façons Diversité des procaryotes Lysogénie : «Phage conversion» : développement de l immunité contre des phages homologues chez les procayotes, transfert de traits morphologiques et métaboliques Transduction : transfert de traits morphologiques et métaboliques des hôtes Gènes viraux et activité virale augmentent la diversité procaryotique. Cette diversité est une source de sélection et une source de fonctions écologiques Figure 5 : Schéma résumant les effets potentiels que peuvent avoir les virus sur la diversité des procayotes. D après Weinbauer et Rassoulzadegan (2004).

48 Tableau 1 : Principales caractéristiques du lac Léman. D après le rapport CIPEL A Superficie du plan d'eau 582 km 2 Superficie pour la Suisse 348 km 2 (60%) Superficie pour la France 234 km 2 (40%) Périmètre du lac Altitude moyenne Profondeur maximum 167 km 372 m 309 m Volume total d'eau m 3 Largeur maximum Longueur dans l'axe Temps moyen de renouvellement des eaux 13,8 km 72,3 km 12 ans B Nord Ouest Est Sud Figure 6 : a) Situation géographique du lac Léman en Europe occidentale. b) Schéma du lac Léman précisant la localisation des stations de prélèvement SHL1 et SHL2 (point de référence du suivi de la qualité des eaux).