Stratégies du Diagnostic sérologique des infections VIH
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- Frédéric St-Laurent
- il y a 8 ans
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1 Stratégies du Diagnostic sérologique des infections VIH Fax (0) francois.simon@chu-rouen.fr
2 I. Les moyens du diagnostic sérologique VIH II. Les tests disponibles III. Les stratégies alternatives
3 I. Les moyens du diagnostic des infections VIH. Le diagnostic des infections à VIH repose chez l adulte sur la détection des anticorps dirigés contre les antigènes de ces virus. Le développement des techniques de biologie moléculaire ne permet pas pour l heure de remplacer les techniques sérologiques qui restent partout dans le monde les techniques de références pour le dépistage et la confirmation des infections VIH de l adulte. Seul le diagnostic précoce dans les premiers mois de vie chez l enfant né de mère séropositive nécessite la mise en évidence du virus, de ses composants ou de son génome. L' intérêt de la mise en place du diagnostic moléculaire pour la recherche HIV (et HCV) dans les dons du sang dans certains pays (France, USA..) doit encore être évaluée. Le rapport coût/bénéfice pour la détection des HIV non reconnus par la sérologie classique reste à prouver particulièrement si on le compare à celui des nouveaux test de dépistage utilisant la recherche des antigènes HIV et des anticorps anti HIV 1. Principes des tests de dépistage sérologique. Le dépistage des anticorps anti-vih1 et anti-vih2 s effectue le plus souvent par des tests dits ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) ou par des tests rapides utilisant comme antigènes des lysats viraux ou des protéines recombinantes ou synthétiques. Ces protéines correspondent aux épitopes immuno-dominants des 2 virus VIH1 du sous-type B (souche LAI, MN.) et VIH2 du sous-type A (souche ROD). Ces tests "mixtes" sont donc capables de dépister les anticorps anti-vih1 et anti-vih2. Depuis quelques années les test dépistant à la fois les antigènes et les anticorps permettent d'améliorer la sensibilité de la détection lors de la 'fenêtre de séroconversion' Plusieurs formats de tests sont disponibles : Les tests ELISA : Les tests EIA indirect : la fixation des anticorps du patient sur les antigènes du kit est révélée par une anti-globuline humaine anti-ig G marquée par une enzyme. Ce sont des tests robustes, peu sensibles aux variations des épitopes des variants VIH surtout si les antigènes sont constitués de lysat viral. Mais ils manquent de sensibilité lors de la primoinfection car ils sont incapables de détecter les isotypes d immunoglobulines non-g. Leur spécificité est médiocre, des immunoglobulines non spécifiques pouvant se fixer sur le support solide et être révélées par l'anti-globuline marquée. Les tests EIA "Sandwich" : La révélation de la réaction antigène du kit -anticorps
4 anti-vih du patient se fait non plus par une anti-globuline mais par un antigène marqué, se fixant sur les sites anticorps restés libres. Ce sont les tests les plus sensibles pour la détection des anticorps anti-vih du sous-type B lors de la séroconversion. La spécificité est également excellente. Ils sont les plus utilisés dans le cadre du dépistage des dons du sang. Ils peuvent être pris en défaut lors d infections par des variants majeurs comme les VIH-0 et manquent de sensibilité lors des séroconversions par les variants non-b. Les tests EIAs par immunocapture : les immunoglobulines du patient se lient par leur extrémité Fc à des antiglobulines anti-fc de la phase solide. La révélation de liaison se fait par des antigènes marqués, se fixant sur les sites Fab des anticorps restés libres. Ils permettent de détecter des immunoglobulines même en cas de forte dilution dans des milieux comme l urine ou la salive. Cependant ils sont légèrement moins sensibles que les tests de troisième génération lors des séroconversions (4) mais leur spécificité est bonne. Les tests EIA par compétition utilisent la différence d'affinité pour un antigène entre les anticorps anti-vih du patient et un anticorps anti-vih marqué par une enzyme. Les test par compétition commercialisés utilisent uniquement des antigènes VIH-1 du groupe M. Ces tests sont hautement spécifiques. En cas de forte réactivité, l infection VIH-1 groupe M est certaine. Les infections par VIH-2 et VIH-O sont non ou mal détectées (5. 6) et cette spécificité peut être utilisé pour différencier le type de souche infectante. Les tests rapides : Ce sont le plus souvent des tests par filtration du sérum sur une membrane ou un support recouvert d'antigènes recombinants VIH1 et VIH2. Ils ne nécessitent aucun équipement et sont réalisées en moins de 30 minutes. La simplicité d'emploi leur assure une large diffusion dans les pays en voie de développement. D autres tests de réalisation simples sont les tests par agglutination de particules sensibilisées aux antigènes VIH. Ils sont généralement sensibles et de réalisation simple mais leur lecture peut être difficile. De réalisation unitaire, ils sont faciles d exécution. Pour l ensemble de ces tests, l absence de résultats quantifiés et enregistrés sur support papier sont des obstacles à la traçabilité des manipulations. 2. Les tests de confirmation La technique du Western Blot (WB) est une méthode de référence mais son interprétation peut être délicate. Le recours au WB pour une confirmation VIH n est pas systématique dans tous les pays, y compris dans les pays industrialisés. Elle est parfois informative permettant
5 d évoquer une séroconversion récente ou une infection par des variants. Le plus souvent en cas d infection VIH, le WB sera pleinement réactif et donnera peu d information complémentaire. Inversement, en cas de non infection, des réactivités non spécifiques sont fréquentes et d interprétation difficile. Aussi des alternatives au WB sont nécessaires pour éviter un recours systématique à cet examen coûteux. Le WB est une technique de transfert sur la nitrocellulose, après migration électrophorétique en gel de polyacrylamide, de protéines d'un lysat viral VIH-1 ou VIH-2. Sur la bandelette de WB, différentes protéines constitutives des virus seront reconnues par des anticorps spécifiques anti-vih1 ou VIH2. Les immunoblots utilisant des protéines de synthèse : ces tests de commercialisation récente et d un coût aussi élevé que celui du WB proposent différentes protéines recombinantes ou peptidiques sous forme de strip sur bandelette ou de spot sur support plastique. Ces tests ne sont qu une présentation sur un format différent des antigènes de synthèse utilisés lors des examens de dépistage et n apportent aucune information complémentaire. II. Les tests disponibles. Ce sont des tests disponibles et largement utilisés en France, ayant reçu l agrément de l Agence du médicament et dont les performances sont régulièrement évaluées. Leur mise à disposition auprès des laboratoires soutenus par la Coopération Française repose sur les critères suivants: - une sensibilité et une spécificité maximales en accord avec les recommandations de l ONUSIDA et L OMS, à savoir une sensibilité >99% et une spécificité > 95%. - capacité à detecter au mieux les anticorps dirigés contre les différents variants du VIH - pour les tests ELISA, être utilisables sur toutes les chaînes microplaque - pour les tests simples/rapides, différencier VIH-1 et VIH-2 - représenter tous les formats disponibles: ELISA indirecte, sandwich, immunocapture, compétition, tests unitaires, test de confirmation - et pouvoir être associés entre eux dans le but de développer des stratégies alternatives.
6 III. Les stratégies alternatives pour la confirmation des infections VIH On regroupe sous le terme de stratégies alternatives l ensemble de combinaisons de tests qui permettent dans une situation épidémiologique et clinique donnée de porter le diagnostic d infection ou de non infection par VIH. Ces stratégies reposent sur la détection des anticorps et ont pour objectifs d obtenir des valeurs prédictives positives ou négatives égales à celle de la stratégie classique utilisant le Western Blot comme moyen de confirmation. Trois stratégies sont proposées par l Organisation Mondiale de la Santé pour détecter les anticorps dans les échantillons de sérum ou de plasma (Extraits du Relevé Epidémiologique Hebdomadaire du 21 Mars 1997). Le choix d une stratégie repose sur: - l objectif du dépistage - la sensibilité et la spécificité des tests - la prévalence VIH dans la population testée Stratégie I Les échantillons sont testés par ELISA ou par une méthode simple/rapide. En cas de réaction positive, le sérum est considéré comme positif pour les anticorps anti-vih. S il n y a pas de réaction, le sérum est considéré comme négatif. Aux fins de la sécurité transfusionnelle, il convient de choisir le test le plus sensible. Si le résultat est positif, le don de sang doit être éliminé selon les mesures de précaution universelles. Pour diagnostiquer et rendre un résultat à un donneur ou à un patient il faudra utiliser les stratégies II ou III Stratégie II Tous les échantillons de sérum/plasma sont d abord soumis à un ELISA ou à un test simple/rapide. - Un sérum qui ne réagit pas à la première épreuve (test A) est considéré comme négatif - Un sérum qui réagit au premier test (test A) est retesté avec un deuxième test (test B) ELISA ou un test simple/rapide, basé sur une préparation antigénique différente et/ou un principe différent (par exemple, méthode indirecte et méthode par compétition). - Un sérum qui réagit avec les 2 tests A et B est considéré comme positif pour les anticorps anti-vih.
7 - Tout sérum qui réagit à la première épreuve (test A positif) mais pas à la deuxième (test B négatif) doit être retesté par ces mêmes trousses. Si les résultats concordent après répétition (les 2 tests A et B sont positifs ou les deux tests A et B sont négatifs) le sérum est considéré soit positif, soit négatif. Si les résultats des 2 épreuves A et B demeurent discordants, le sérum est considéré comme indéterminé. Stratégie III Lorsqu il s agit de tester des populations où la prévalence du VIH est peu élevée, même en utilisant un test dont la spécificité est élevée, la valeur prédictive positive sera faible. En conséquence, un test supplémentaire s impose : c est la stratégie III. Comme avec la stratégie II, tous les sérums sont d abord testés par ELISA ou un test simple/rapide (test A), et un sérum trouvé positif au premier test est retesté avec un test différent (test B). Un sérum qui ne réagit pas au premier test est considéré comme négatif pour les anticorps anti-vih. Un sérum qui réagit au premier test mais ne réagit pas au deuxième doit être retesté au moyen de ces 2 réactifs. Cependant, la stratégie III fait appel à un troisième test (test C) si le sérum réagit au deuxième test ou lors de la répétition de la première épreuve. Les 3 tests employés dans cette stratégie doivent être fondés sur des préparations antigéniques différentes et/ou reposer sur des principes différents. Un sérum qui réagit avec les 3 tests est considéré comme positif pour les anticorps anti-vih. Un sérum dont le résultat demeure discordant à la deuxième épreuve, ou qui réagit au premier et au second test mais ne réagit pas au troisième est considéré comme indéterminé. Un sérum qui réagit au premier test, mais ne réagit ni au deuxième ni au troisième test est considéré comme douteux quand il s agit de personnes ayant été exposées au risque d infection par le VIH au cours des 3 derniers mois et négatif quand il s agit de personnes n ayant pas été exposées à ce risque. Conduite à tenir: Si un cas de séropositivité est diagnostiqué, il faut obligatoirement reprélever un nouvel échantillon de sang chez toutes les personnes séropositives sur le premier prélèvement de sang. Un contrôle est réalisé selon la stratégie indiquée sur ce nouveau prélèvement. Si le résultat est indéterminé, une recherche dans le sérum de personnes symptomatiques présentant des signes correspondant aux critères cliniques de l OMS, le sérum n a normalement pas besoin d être retesté. Pour le diagnostic d infection à VIH chez les personnes asymptomatiques, ayant un résultat indéterminé au test, un nouveau prélèvement
8 de sang sera effectué au moins 2 semaines après le premier prélèvement et fera l objet d un contrôle suivant la stratégie appropriée. Si ce deuxième échantillon donne également des résultats indéterminés, il faut réaliser un Western-Blot VIH-1 voire VIH-2. Si ce dernier résultat est également indéterminé, un suivi peut s avérer nécessaire (3, 6, 12 mois). Si les résultats demeurent indéterminés après 1 année, la personne est considérée comme séronégative pour le VIH. Indications des stratégies I, II et III (table 1) : La stratégie I ne peut être utilisée que pour confirmer le diagnostic clinique chez des personnes dont le cas correspond aux critères cliniques de l OMS du stade III ou IV de l infection à VIH, et lorsque la prévalence du VIH dans l échantillon de population (par exemple des patients tuberculeux dans une salle d hôpital) dépasse 30%. Pour les populations où la prévalence est moins élevée, on utilisera la stratégie II pour poser un diagnostic chez des personnes présentant les signes cliniques susmentionnés. En ce qui concerne le choix des tests de recherche des anticorps anti-vih pour les stratégies II et III, le premier test doit avoir la sensibilité la plus élevée, alors que les deuxième et troisième tests auront une spécificité plus élevée que le premier. La stratégie III doit être appliquée pour les patients asymptomatiques dans les groupes de prévalence inférieure à 10% :
9 Objectif: Sécurité transfusionnelle Prévalence Stratégie I Surveillance épidémiologique > 10% < 10% I II Symptomes VIH > 30% < 30% I II Diagnostic Asymptomatique > 10% < 10% II III Table 1 : indication des stratégies alternatives
10 Stratégie I - Surveillance des dons du Sang - Diagnostic pour patient symptomatique (signes cliniques évocateurs VIH ) et prévalence > 30% - Surveillance épidémiologique quand la prévalence attendue est > 10% = un seul test de dépistage Test A (Elisa ou test rapide) positif négatif déclarer le sérum VIH positif déclarer le sérum VIH négatif Figure 1. Représentation schématique de la stratégie I alternative de sérodiagnostic de l infection à virus de l immunodéficience humaine (VIH) n exigeant pas le recours au test Western Blot destinée au dépistage des dons du sang et à réaliser un diagnostic clinique chez des sujets symptomatiques (prévalence de l infection attendue >30%).
11 Stratégie II - surveillance épidémiologique si la prévalence est < 10% - Diagnostic pour patient symptomatique (signe clinique évocateurs d infection VIH) et prévalence < 30% - Diagnostic pour patient asymptomatique et prévalence > 10% = application séquentielle de deux tests de dépistage Test A (Elisa ou test rapide) positif négatif déclarer le sérum VIHtest B positif déclarer le sérum VIH+ négatif Répéter test A et B A positif A positif A négatif B positif B négatif B négatif déclarer le sérum VIH+ déclarer le sérum déclarer le sérum VIH- VIH indéterminé Figure 2. Représentation schématique de la stratégie II alternative de sérodiagnostic de l infection à virus de l immunodéficience humaine (VIH) n exigeant pas le recours au test Western Blot destinée à la sérosurveillance dans une population où la prévalence attendue est inférieure à 10%, au diagnostic clinique de sujets symptomatiques (prévalence attendue 30%) et asymptomatiques (prévalence attendue >10%).
12 Stratégie III - Diagnostic pour patient asymptomatique et prévalence < 10% = application séquentielle de trois tests de dépistage Test A positif négatif déclarer le sérum VIH- Test B positif négatif Répéter test A et test B A positif A positif A négatif B positif B négatif B négatif déclarer le sérum VIHtest C A positif A positif A positif A positif B positif B positif B négatif Bnégatif C positif Cnégatif C positif C négatif déclarer le sérum VIH+ déclarer le sérum comportement à comportement à VIH indéterminé haut risque : faible risque : déclarer le sérum déclarer le sérum VIH indéterminé VIH négatif Figure 3. Représentation schématique de la stratégie III alternative de sérodiagnostic de l infection à virus de l immunodéficience humaine (VIH) n exigeant pas le recours au test Western Blot destinée au diagnostic clinique de sujets asymptomatiques.
13 Algorithme de différenciation des infections par VIH-1 et VIH-2 Nous avons élaboré notre stratégie de différenciation autour de 3 tests : un test de dépistage, un test monospécifique de VIH-1 (Wellcozyme Rec HIV-1) et un test monospécifique de VIH-2 (ICE VIH-2) A/ Si le dépistage (ELISA ou test rapide) est positif : En cas de suspicion d infection par VIH-1 ce qui constitue la majorité des cas, on utilisera un test spécifique qui présente une bonne spécificité à l'égard des anticorps anti-vih-1 et qui donne peu ou pas de réactions croisées avec les anticorps anti-vih-2. Il s'agit du test ELISA VIH-1 par compétition (Wellcozyme Rec HIV-1) ; les antigènes utilisés sont des protéines recombinantes. Cette technique par compétition très spécifique permet d'affirmer sur un nouveau prélèvement une infection VIH-1 avec la même valeur prédictive que le WB à condition d'exiger un ratio Valeur Seuil / Densité Optique > 5. Dans notre expérience de diagnostic de 7500 cas de séropositivité VIH-1 à l'hôpital Bichat-Claude Bernard, nous n'avons jamais eu de faux positif en utilisant ces critères. Ce test est donc très utile dans les stratégies alternatives comme deuxième test (test B ou C dans les figures 2 et 3). Si l'eia VIH-1 compétition est négatif ou faiblement positif (Valeur Seuil/ Densité Optique < 5), une infection par VIH-2, une séroconversion, un variant VIH-1 ou une réaction non spécifique sur le test mixte sont à envisager. B/ En cas de suspicion d'une infection par VIH-2 Nous recommandons l'usage d'un test spécifique pour les anticorps anti-vih-2, permettant d'exclure les réactions croisées très fréquentes lors des séropositivités VIH-1. Le test ICE monospécifique VIH-2 est très spécifique et peut être utilisé dans les stratégies alternatives pour confirmer l infection par VIH-2. Nous avons évalué la spécificité avec 150 sérums HIV-1, tous négatifs et la sensibilité avec 150 sérums VIH-2 positifs, tous fortement réactifs. Certains sérums VIH-2, particulièrement ceux du sous-type B de VIH-2, fréquent en Côte d Ivoire, peuvent cependant être faiblement réactifs par la trousse ICE VIH-2. C/ Si la technique ELISA n est pas disponible La différenciation est possible par les tests rapides qui ont des spots VIH-1 et VIH-2 séparés. Mais les réactions croisées de sérums VIH-1 positifs sont fréquentes sur le spot VIH-2 et inversement et il ne faut pas conclure hâtivement à une double infection.
14 En pratique, deux situations sont possibles: Première situation : Dépistage (ELISA ou test rapide) positif et test VIH-1 compétition positif : VS/DO> 5 Le diagnostic d'infection VIH-1 est quasi formel. La positivité de ce test compétition sur un nouveau prélèvement avec un Valeur Seuil/ Densité Optique > 5 à valeur de confirmation d infection par VIH-1. Dans le cas particulier de sujets originaires d Afrique de l'ouest, on doit également évoquer une double infection VIH-1+VIH-2. On pratiquera donc le test ICE VIH-2 Si celui-ci est négatif, on arrêtera les investigations. Si le test ICE VIH-2 est positif, une double infection est possible. Deuxième situation : Le test mixte EIA ou rapide est positif avec un test compétition négatif ou faiblement réactif (Valeur Seuil/ Densité Optique < 5. La discordance entre la forte positivité en test mixte et la négativité ou la faible positivité du test par compétition évoque très fortement une infection par VIH-2. Le test ICE VIH-2 confirmera l infection par VIH-2. Si Le test ICE VIH-2 est négatif il faut envisager les autres possibilités : séroconversion, réactions non spécifique et infection par un variant VIH comme VIH-1 groupe O. Seuls les laboratoires de référence pourront alors intervenir.
15 Differenciation des infections VIH-1 et VIH-2 Dépistage VIH-1/VIH-2 ELISA ou test rapide positif sur nouveau prélévement test monospécifique VIH-1 par compétition Wellcozyme Rec HIV-1 VS/DO > 5 VS/DO < 5 test monospécifique VIH-2 par immunocapture ICE HIV-2 Infection par VIH-1 DO/VS > 1 DO/VS < 1 Infection par VIH-2 Seroconversion? faux positif au dépistage? Infection par variant? DO : densité optique de l échantillon VS : valeur seuil déterminé par le fabriquant Figure 4 : stratégie de différenciation des infections VIH-1 et VIH-2 par technique ELISA
16 CONDITIONS DE SECURITE AU LABORATOIRE Port gants-blouse (lunettes - masque?) Lavage des mains après élimination des gants Javel pour effluents (sérum - lavage) Décomplémentation des sérums 56 C pendant 1/2 heure Pas de contact des substrats avec la peau Nettoyage des paillasses à l eau de Javel puis alcool à 75 Utilisation de 2 sortes de poubelles : une pour cartons d emballage, papiers..) une pour déchets contaminés pour incinération Elimination des pipettes après une nuit en eau de Javel (containers spéciaux). Se laver les mains avant de quitter le labo. Toute plaie doit être protégée (pansement) Blessures avec sang - nettoyage à l eau et au savon - rinçage - Alcool à 70 pendant 3 minutes ou eau de Javel diluée au 1/10 Projection yeux laver abondamment à l eau ou au sérum physiologique Déclaration des accidents du travail sur le registre et suivis sérologiques: faire une sérologie dès l accident puis contrôler à 3 semaines et à 3 mois. La mise à disposition de médicament anti-rétroviraux pour les personnels de laboratoires en cas de risque important doit être réfléchie en fonction des disponibilités locales
17 OPTIMISATION DES CONDITIONS OPERATOIRES AVANT UTILISATION DES KITS : Laisser s'équilibrer les réactifs d'un KIT 10 à 30 minutes à température ambiante (se conformer aux recommandations du fabricant). Vérifier que le kit n'a pas atteint la date de péremption Ne jamais mélanger les réactifs de lots différents Respecter les dilutions et temps d'incubation Vérifier le volume de "dispense" et l'utilisation correcte des micropipettes. Vérifier le calibrage de ces pipettes. S'assurer que la verrerie a bien été rincée à l'eau distillée avant utilisation puis séchée Ne pas utiliser le même récipient pour la préparation du conjugué et celle du substrat Pas de contact du substrat avec des parties métalliques Préparation extemporanément des réactifs (conjugué et substrat) Pas de rinçage uniquement à l'eau du robinet toujours rincer à l'eau distillée ATTENTION aux vapeurs d'hypochlorite au moment des révélations Rinçage des appareils de lavage avant et après utilisation Éviter les projections d'acide au moment de la lecture sur spectrophotomètre endommage les cellules de lecture Protection des appareils (lecteurs) de la poussière S'assurer de la remise des kits et réactifs au réfrigérateur après manipulation Noter les numéros des kits pour réclamations (au niveau du fabricant) ou pour comparaisons (avec d'autres collègues) Développer ses propres contrôles de qualités internes au laboratoire et participer aux contrôles de qualités externes nationaux et internationaux.
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