Rapport annuel d'activité, année Laboratoire National de Référence. Encéphalopathies spongiformes transmissibles

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1 Rapport annuel d'activité, année 214 Laboratoire National de Référence Encéphalopathies spongiformes transmissibles Nom du responsable du LNR Thierry BARON Nom de l'unité où l'activité du LNR est mise en œuvre Maladies neuro-dégénératives Nom du laboratoire où l'activité du LNR est mise en œuvre ANSES- Laboratoire de Lyon Nombre de laboratoires agréés et/ou reconnus dans le réseau 5 Précisez la catégorisation du danger (en SA) sinon la justification de l'existence du mandat de LNR Dangers sanitaires De 1ere catégorie 1

2 Introduction Les faits marquants de l'année - dans le domaine de l appui scientifique et technique, le maintien de l accréditation par le COFRAC du laboratoire pour la réalisation des tests de Western blot utilisés pour i) les confirmations diagnostiques, ii) la discrimination de l ESB et de la tremblante chez les petits ruminants, et iii) le typage moléculaire des cas d ESB chez les bovins. - sur le plan des activités de recherche, i) la poursuite de travaux expérimentaux concernant l influence de l expression d un allèle de résistance ovin R171 sur le phénotype de la maladie chez des souris transgéniques «ovinisées» infectées par différentes souches de prion ; ceci fait suite aux travaux ayant montré des modifications phénotypiques majeures lors d infections de moutons QR171 par l ESB atypique de type L (Nicot et al., J. Infect. Dis., 214), ii) dans ce même modèle expérimental transgénique, des travaux ont été publiés montrant que seules l ESB et la tremblante classiques ont pu être transmis par voie orale à ces souris, parmi l ensemble des souches de prions examinées et déjà transmises par voie intacérébrale (notamment ESB de type L et tremblantes Nor98 et CH1641)(Arsac et al. PLoS ONE, 214) 1. Méthodes développées ou révisées Nombre de méthodes développées ou révisées proposées à l autorité compétente Donner le nom et une brève description de chacune de ces méthodes Les tests validés et certifiés pour la confirmation du diagnostic EST sont ceux cités dans le manuel de l OIE : l'examen histopathologique, l'immunohistochimie, et la technique du Western Blot. En tant que LNR EST, le laboratoire de l Anses-Lyon est agréé pour la confirmation du diagnostic des EST. Il pratique une technique de Western blot qu il a adapté à partir de la notice du kit Western Blot TeSeETM (Rev.E - 5/29). Ce kit développé et commercialisé par la société Bio-Rad est validé et certifié depuis mai 29 par l OIE (n d enregistrement 2915). Ce Western blot permet la détection de la protéine prion pathologique spécifique des EST, après traitement à la protéinase K en milieu détergent puis précipitation en milieu alcoolique. En plus de définir le statut des animaux suspectés d EST, cette technique permet également d identifier chez les petits ruminants les isolats de tremblante atypique/nor98. 2

3 Les échantillons provenant de bovins confirmés positifs pour l ESB font l objet d un typage moléculaire par le Western blot développé au laboratoire et validé au cours d un Essai Inter Laboratoire (EIL) de validation organisé par le LR-UE. IL est fondé sur la mise en évidence des caractéristiques moléculaires spécifiques. A partir de la PrPres extraite du tissu cérébral des bovins, une analyse des poids moléculaires des différentes bandes, des glycotypes et de la présence d une forme tronquée spécifiquement reconnue par les anticorps C- terminaux permet la classification en trois types moléculaires : type-h, type-l et type-c, ce dernier correspondant à la forme classique d ESB observée au cours de l épizootie liée à l alimentation des bovins par des farines de viandes et d os contaminées. Les échantillons provenant de petits ruminants qui ne sont pas identifiés comme tremblante atypique/nor98 font l objet d un typage moléculaire par le Western blot discriminant Anses. L objet de cette analyse est d identifier la présence éventuelle d une signature moléculaire similaire à celle de l ESB chez des petits ruminants. L analyse de typage basée sur une méthode de Western blot permet d étudier les caractéristiques du fragment résistant à la protéinase K de la protéine prion pathologique (PrPres), les données expérimentales montrant que le profil de la PrPres peut varier en fonction de la souche d agent infectieux ayant infecté l animal. La PrPres extraite de petits ruminants expérimentalement infectés par l ESB présente un bas poids moléculaire apparent de la forme non glycosylée de la protéine ainsi qu une immuno-réactivité faible avec l anticorps P4 contrairement à la PrPres d individus atteints de tremblante dont le poids moléculaire est généralement haut et l immuno-réactivité P4 forte. Ces deux critères sont utilisés dans le Western blot discriminant Anses : la mesure des poids moléculaires obtenus après immuno-détection par l anticorps Bar233 et l appréciation de l immuno-réactivité avec l anticorps P4. Nombre de méthodes développées ou révisées qui sont susceptibles d être prêtes pour être proposées à l autorité compétente au cours de l année N+1 2. Matériels biologiques ou chimiques, matériaux de référence et échantillons et souches d'intérêt Décrire ici les collections d'échantillons biologiques ou d'autre nature (environnement, aliment...) conservés par le LNR; indiquer les méthodes de conservation, la température, le nombre de "repositories", le nombre d'échantillons par souche, l'enregistrement associé...). Le LNR possède une échantillothèque dédiée au stockage du matériel biologique infecté par des EST issus de divers programmes/études et d espèces animales. La conservation du matériel biologique est assurée par des congélateurs -2 C/-4 C/-8 C contenant : - des hémisphères et troncs cérébraux de cas de tremblante de petits ruminants confirmés positifs ou infirmés, - des hémisphères et troncs cérébraux des cas d ESB confirmés positifs ou initialement 3

4 suspects cliniques mais infirmés par les épreuves diagnostiques, - des organes prélevés sur des rongeurs (souris conventionnelles ou transgéniques, hamster) infectés expérimentalement par le panel des EST naturelles identifiées dans le cadre des activités de diagnostic, ainsi que des souches expérimentales de référence de prions (souches 263K, 22A, 79A, 87V, 31V, 22L, Chandler, 139A), - des tissus biologiques de guépards naturellement atteints d Encéphalopathie Spongiforme Féline (ESF), - des tissus biologiques expérimentaux tels que des moutons infectés expérimentalement par de l ESB, des microcèbes expérimentalement inoculés par l ESB atypique ou bien encore par de la tremblante classique ou atypique, - du matériel de référence EST (ESB d origine bovine et tremblante ovine) obtenu auprès de l IRMM (Institut des matériaux et mesures de références). L enregistrement du matériel biologique s effectue sous format informatique à partir d une base de données appelée «base access ESST» et par plusieurs tableaux Excel accessibles sous le réseau informatique. La salle échantillothèque possède un registre papier d entrée et de sortie du matériel biologique. Nombre de souches/échantillons reçu(e)s et mis(es) en collection dans l'année 52 Nombre de souches/échantillons maintenu(e)s au total Activités d'analyse 3.1 Analyses officielles de première intention Nombre d'analyses de première intention réalisées dans l'année (de biotypie, sérotypie, caractérisation moléculaire...) 3.2. Analyses officielles de confirmation Nombre d'analyses de seconde intention réalisées dans l'année (de biotypie, sérotypie, caractérisation moléculaire...) 91 4

5 Détaillez ici par type d'analyse de confirmation Confirmations diagnostiques : 6 (44 positifs et 16 non confirmés) Typage moléculaire : 28 chez les petits ruminants, tous issus de mesures de police sanitaire), 3 chez les bovins Taux de confirmations par type d'analyse (= nombre de résultats confirmés / nombre d'analyses officielles de seconde intention réalisées) Cas confirmés positifs par le test de confirmation de diagnostic EST : ESB classique : ESB atypique : 3 (1 type-h et 2 type-l) Tremblante non Nor98: 28 Tremblante Nor98 : 11 Cas infirmés par le test de confirmation de diagnostic EST : ESB : 4 Tremblante : 5 En 213, nous avions constaté une diminution très significative du nombre d isolat de tremblante atypique/nor98 possiblement en lien avec une différence de sensibilité diagnostique entre les différents lots d un test de dépistage. Pour l année 214, le nombre d isolats de tremblante atypique/nor98 détecté a encore diminué de 15% par rapport à l année 213, avec une absence totale de cas durant une période de plus de 5 mois (du 14/5/214 au 23/1/214). Le Western Blot TeSeE BIORAD utilisé pour les confirmations diagnostiques a permis d identifier la signature caractéristique de la tremblante de type Nor98 dans 11 isolats (6 ovins, 5 caprins), dont 1 ovin provenant des mesures de police sanitaire. Les 28 autres isolats ont été analysés par la méthode du Western Blot discriminant Anses pour la recherche de l ESB chez les petits ruminants. A ce jour, 3 isolats provenant d un même troupeau restent en cours d analyse. Parmi les 25 autres isolats 16 présentaient une signature moléculaire indistinguable de la tremblante classique et 9 échantillons ne présentaient pas une quantité suffisante de PrPres permettant une caractérisation moléculaire complète. Néanmoins, la plupart de ces isolats (7 sur 9) ont présenté une immuno-réactivité avec l anticorps P4 ce qui est compatible avec la signature tremblante classique Autres analyses Nombre estimé d'autres analyses (non officielles) réalisées dans l'année en lien avec le mandat de LNR 5

6 4. Activités de production et de contrôle de matériaux de référence et de réactifs biologiques Le LNR produit-il et fournit-il des réactifs? Non Le LNR fournit-il des matériaux de référence? Non Le LNR réalise-t-il des contrôles de réactifs commerciaux? Oui Cette activité est-elle une obligation découlant de textes réglementaires, normatifs ou infra-réglementaires (notes de service). Si oui, lesquels? Le contrôle des lots des kits utilisés pour le dépistage de l ESB en France est effectif depuis la fin 29. Ce contrôle est organisé par le LR-UE et délégué en fonction des tests dans différents Laboratoires Nationaux de Référence en Europe. Le contrôle du test Idexx a été confié à l Anses-Lyon. Quelles sont les modalités de contrôle (initiaux, répétitifs, lot par lot)? Depuis août 21 le contrôle des lots effectué par les Laboratoires Nationaux de Référence peut être effectué uniquement sur la base de l analyse du rapport des données du contrôle qualité fourni par le fabricant de lot. Afin d assurer la possibilité de réaliser des analyses sous accréditation COFRAC en cas de nécessité de vérification complémentaire au dossier, l Anses, laboratoire de Lyon fait appel au LDA 1, agréé pour le dépistage rapide de l ESB, accrédité et utilisant ce test en routine, pour la réalisation d une analyse sur un lot en comparaison avec un lot de référence. En pratique, un contrôle lot par lot continue néanmoins à être réalisé à l Anses Lyon, pour une meilleure appréciation du suivi des lots. Quel est le nombre de contrôles - ou de lots contrôlés - par an? (moyenne sur les 5 dernières années) 8 6

7 Analyse de l'évolution (augmentation, diminution) des tendances en termes d'activité sur les 5 dernières années De manière globale, depuis 5 ans, nous avons noté une diminution de l activité de confirmation diagnostique qui apparaît désormais stabilisée: - une stabilité du nombre d analyses de 29 à 211(16 en 29, 89 en 21 et 129 en 211), - une baisse du nombre d analyses en 212 (53 analyses) essentiellement liée à la poursuite de la diminution de prévalence de la tremblante classique et de l ESB ainsi qu à la diminution des problèmes de spécificité pour le kit de diagnostic ayant posé des problèmes en 21 et cette situation apparaît globalement stabilisée en 213 et en 214 (6 en 213 et 51 en 214) même si le nombre d isolats de tremblante atypique/nor98 détectés a notablement diminué ces deux dernières années (13 en 213 et 11 en 214) par comparaison aux années antérieures (31 en 29, 35 en 21, 27 en 211 et 33 en 212). 5. Activités d'expertise scientifique et technique 5.1. Demandes d expertise scientifique et technique du ministère (chargé de l agriculture, santé, etc ) ou d instances communautaires et internationales qui concernent votre domaine de compétence Nombre de rapports d'est rendus dans l'année 79 Détaillez ici les demandes d'est et les noms des mandataires Demandes : confirmation diagnostique et typage moléculaire des encéphalopathies spongiformes Mandataires: Direction Générale de l'alimentation Autres expertises Les membres de l'équipe du LNR peuvent avoir des activités d'expertise (internes: CES, GT ou externe: EFSA...) ou des activités auprès de commissions de normalisation (Afnor...). Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré. Comme prévu dans la procédure mise en place pour l examen des conditions de réaffectation de locaux ESST (courrier DGAL du 27 Janvier 24), nous avons examiné deux dossiers, décrivant les protocoles envisagés pour la réhabilitation de locaux ayant servi à la réalisation de tests rapides de dépistage de l ESB : - changement de destination de locaux dédiés à la réalisation des tests rapides de dépistage de l ESB - laboratoire départemental de l Orne, - modalités des travaux pour la réfection d un local P3 Prion - LAVD 76. 7

8 5.3. Dossiers de demande d'agrément Nombre de dossiers de demande d'agrément étudiés dans l'année 5.4. Activités de conseil aux professionnels Détaillez ici ces activités et estimez le temps qui y est consacré Néant 6. Animation du réseau de laboratoires officiels 6.1. Organisation d'eila Précisez ici le nombre d'eila organisés par le LNR au cours de l année N Nom (s) et nombre(s) d'eila que vous prévoyez d'organiser au cours de l année N+1 1 Précisez le nombre d'eil (hors EILA - dont EILV en lien avec méthodes en cours de validation telles que précisées dans le paragraphe 1) organisés par le LNR au cours de l année N Précisez le nombre d'eil (hors EILA) que vous prévoyez d'organiser au cours de l année N Formation, organisation d'ateliers, accueil de stagiaires Nombre de journées d'échange et de restitution rassemblant les laboratoires agréés du réseau, organisées dans l'année 8

9 Nombre de sessions de formation des personnels des laboratoires agréés aux méthodes utilisées pour les contrôles officiels, organisées dans l'année 6.3. EILA auxquels le LNR a participé dans l'année Détaillez les EILA auxquels le LNR a participé dans l'année, dans le cadre : National; UE (EILA organisé par le LRUE); International Le laboratoire participe aux EILA EST organisés par le LR-UE. Les résultats ont été satisfaisants pour les différentes sessions : - EILA ESB par le test de confirmation, - EILA ESB par le test rapide HerdChek-IDEXX, - EILA test diagnostic par histologie et immunohistochimie. - EILA test discrimination de l ESB et de la tremblante chez les petits ruminants, - EILA tests de discrimination des différentes formes d ESB chez les bovins, - EILA tremblante par le test de confirmation, - EILA tremblante par le test rapide HerdChek-IDEXX, 7. Participation aux activités de surveillance 7.1 PS/PC Existe-t-il un ou plusieurs PS/PC élaboré(s) par l'autorité sanitaire dans le champ du LNR? Oui 7.2 Activités de surveillance hors PS/PC Dispositif(s) hors PS/PC Indiquer si le LNR est intégré à un (ou des) dispositif(s) de surveillance (hors PS/PC)? Non 8. Activités de recherche en lien avec l activité de référence 8.1. Recherches méthodologiques pour la référence Détaillez ici les recherches méthodologiques que vous avez réalisées dans l'année : objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à projets... Néant 9

10 8.2. Recherches associées pour la référence Détaillez ici les recherches associées auxquelles vous avez participé dans l'année (participations à des études cliniques, études d'incidences, modèles d'infections expérimentales, études toxicologiques, essais vaccinaux...): objectifs, partenariats, apports du LNR, projets retenus dans le cadre d'appels à projets... Le LNR a une activité de recherche concernant la discrimination biologique et moléculaire des souches de prion, ayant en particulier largement contribué à l identification des formes «atypiques» de maladies à prion chez les bovins et chez les petits ruminants entre 22 et 24. Cette activité s est poursuivie autour de la question des risques potentiels représentés par les formes atypiques d ESB pour la santé humaine et animale. Les activités en cours concernent en particulier : - l influence de l expression d un allèle prion ovin associé à une résistance génétique (R171) conférant une résistance à la tremblante ou à l ESB classiques; dans le contexte de l existence des programmes de sélection génétique visant à augmenter la proportion des moutons porteurs de l allèle R171 sur le terrain, cette orientation résulte des observations au moins dans une situation particulière (ESB de type L), de profondes modifications phénotypiques de la maladie expérimentale lors d expression de l allèle R171, sous l aspect moléculaire (Nicot et al., J. Infect. Dis., 214), Ce thème a fait l objet d un projet sélectionné dans le cadre d un appel d offres compétitif de la fondation Alliance Biosecure. - l étude expérimentale des possibilités d émergence de la souche d ESB classique (C) à partir des deux formes atypiques d ESB (H et L), - la caractérisation des cas de tremblante ovine présentant des similitudes moléculaires avec l ESB (cas dits «CH1641-like»). 9. Relations avec le CNR Existence d'un CNR Oui Intitulé du CNR CENTRE NATIONAL DE REFERENCE AGENTS TRANSMISSIBLES NON CONVENTIONNELS (ATNC) Organisme porteur du CNR INSERM (UMRS 975) 1

11 EQUIPE MALADIES A PRIONS - MALADIE D'ALZHEIMER CENTRE DE RECHERCHE DE L'INSTITUT DU CERVEAU ET DE LA MOËLLE EPINIERE (ICM) INSERM UMR CNRS UMR 7225, UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE - PARIS 6 ICM HOPITAL PITIE SALPETRIERE 47 BOULEVARD DE L'HOPITAL 7513 PARIS Collaboration dans le cadre de la surveillance, détailler: Néant Collaboration dans le cadre de projets de recherche, détailler: Une collaboration a été développée en 214 concernant la validation d'une méthode de diagnostic par RT-QUIC, qui a été évaluée sur des prélèvements humains collectés par le CNR et sur des prélèvements d'esb classique et atypiques identifiés par l'anses- Laboratoire de Lyon, ainsi, que sur des échantillons issus de la transmission expérimentale de ce différentes formes d'esb à des souris conventionnelles et transgéniques Autres collaborations, détailler: Néant 1. Autres mandats Le LNR détient-il d'autres mandats de référence dans le même domaine de compétences Non Annexes Listes des publications et communications: Publications de l'année destinées aux professionnels (Les publications qui figureront dans le rapport doivent être sous presse ou publiées.) Cazeau, G., J.-B. Perrin, V. Loywyck, B. Bouffartigue and D. Calavas (214) Surveillance des encéphalopathies spongiformes des petits ruminants en 213: seulement trois foyers de tremblante classique détectés. Bulletin épidémiologique, santé animale et alimentation, 64/Spécial MRE - Bilan 213,

12 Sala, C., J.-B. Perrin, A.-G. Biacabe and D. Calavas (214) Encéphalopathie spongiforme bovine en 213: poursuite de l'allègement de la surveillance dans un contexte de maîtrise de la forme classique. Bulletin épidémiologique, santé animale et alimentation, 64/Spécial MRE - Bilan 213, Sala, C. (214) L'encéphalopathie spongiforme bovine en France: évolution et état des lieux. Bulletin des Groupements Techniques Vétérinaires, 74, 12. Publications scientifiques internationales de l'année (Les publications qui figureront dans le rapport doivent être sous presse ou publiées.) Arsac, J.-N. and T. Baron (214) Distinct Transmissibility Features of TSE Sources Derived from Ruminant Prion Diseases by the Oral Route in a Transgenic Mouse Model (TgOvPrP4) Overexpressing the Ovine Prion Protein. PLoS One, 9, e (IF: 3.5) Langeveld, J., J. Jacobs, J. Erkens, T. Baron, O. Andréoletti, T. Yokoyama, L. van Keulen, F. van Zijderveld, A. Davidse, J. Hope, Y. Tang and A. Bossers (214) Sheep prions with molecular properties intermediate between classical scrapie, BSE and CH1641-scrapie. Prion, 8, (IF: 1.9) Levavasseur, E., N. Privat, J.-C. E. Martin, S. Simoneau, T. Baron, B. Flan, J.-M. Torres and S. Haik (214) Molecular modeling of prion transmission to humans. Viruses, 6, (I.F: 3,2) Nicot, S., A. Bencsik, S. Migliore, D. Canal, M. Leboidre, U. Agrimi, R. Nonno and T. Baron (214) L-BSE in Genetically Susceptible and Resistant Sheep: Changes in Prion Strain or Phenotypic Plasticity of the Disease-Associated prion Protein? The Journal of Infectious Diseases, 29, (IF: 5.8) Communications internationales de l'année (Les publications qui figureront dans le rapport doivent être sous presse ou publiées.) Bencsik, A., M. Leboidre, L. Lakhdar and T. Baron (214) Neurotropism property of classival versus atypical TSE agents studied using comparative stereotaxic injections within four different sites of entry. In Congrès Prion 214, Trieste, Italie, 27-3 mai, Poster. Nicot, S., A. Bencsik, J. Vulin, S. Miglione, D. Canal, M. Leboidre, U. Agrimi, R. Nonno and T. Baron (214) L-BSE in genetically susceptible and resistant sheep: changes in prion strain or phenotypic plasticity of ther disease-associated prion protein? In Congrès Prion 214, Trieste, Italie, 27-3 mai, Poster. 12