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1 Jeudi 14 Novembre RANDHAWA Sunny L2 TSSIBS Docteur DESPLAT-JEGO Sophie 6 pages Immunoanalyse Plan: A. Définition de l'immunoanalyse I. Critères de choix II. Caractéristiques communes B. Exemples de techniques I. Immunoprécipitation phase liquide II. Immunoprécipitation en milieu gélifié III. Agglutination IV. Western Blot V. Le test ELISA A. Définition de l'immunoanalyse C'est l'ensemble des techniques biologiques utilisant la mise en évidence de complexes immuns Ag-Ac pour la détection d'un antigène ou d'un anticorps (techniques servant la biologie clinique et la recherche fondamentale) => assez vaste. I.) Critères de choix (en fonction de ce que l'on va doser) Sensibilité : capacité de la technique à détecter plus ou moins une petite quantité de la molécule à doser), Praticabilité et durée de la technique (certaines sont très longues et durent des heures ou des jours), Techniques qualitatives ou quantitatives, Manuelles (de moins en moins le cas car plus coûteuses) ou automatisées, Maison ou commerciales (standardisées, comparables), En phase liquide ou solide. II.) Caractéristiques communes Nécessité d'une source d'antigène (nature et qualité de l'antigène+++) ou d'anticorps. Mise en contact de cette source avec l'échantillon à tester (dilué car très riche en protéines donnant un «bruit de fond») : sérum dans 99% des cas, LCR. Formation de complexes Antigène-Anticorps. Révélation/visualisation des complexes Antigène/Anticorps : par des enzymes comme dans la technique ELISA, par fluorochrome, à l œil nu),. +/- Quantification si standards de calibration. 1/6

2 Diagnostic et suivi sérologiques (infections, maladies autoimmunes) Dosages d'hormones ou de médicaments Groupage sanguin Dépistage d'une Ig monoclonale... Immunodosage sans marqueur : - Agglutination - Précipitation - (Neutralisation) - (Immunochromatographie) Immunodosage avec marqueur : - ELISA - Immunofluorescence - Western Blot - (Radio Immunologie) - (Cytométrie en flux, Technologie Luminex). Les chiffres ci-dessous sont donnés à titre indicatif. Techniques Sensibilité (μg/ml ou g/l) 0, ,001 ELISA ou radio-immunologie Agglutination Immunofluorescence 0,1 Immunonéphélémétrie laser 0,5 Précipitation (Ouchterlony, Mancini) ,01-0,1 B. Exemples de techniques: I.) Immunoprécipitation phase liquide : immunonéphélémétrie C'est une technique automatisée utilisant un faisceau laser et une colonne de liquide dans laquel on va mettre en contact l'anticorps et l'antigène => réaction en phase liquide. Le rayon laser appliqué sur la solution indique la quantité de complexes car il a la propriété de se diffracter différemment en présence des complexes Ag-Ac. Il faut des conditions optimales de mesure des complexes Ag/Ac, et donc bien adapter la méthode avant de l'utiliser (équivalence Ag/Ac..) => Attention à la dispersion non immunologique de la lumière (particules, lipides..) et à l excès d'ag ou d'ac, d'où l'intérêt de la phase pré-analytique. Cette technique permet notamment de doser les Ig dans le sérum,ou le LCR. 2/6

3 II.) Immunoprécipitation en milieu gélifié Immunodiffusion radiale: technique de Mancini : 1. Gélose coulée dans une boîte, avec Ac d intérêt mélangé en concentration connue. 2. Dépôt des Ag (sérums) à doser dans les puits. 3. Diffusion sur plusieurs jours dans la gélose 4. Diamètre de l'anneau de précipitation^2 => proportionnel à la quantité d'ag. Immunodiffusion double : technique d'ouchterlony Présence de gélose => dépôt au centre d'une solution de l'antigène de référence, puis dans les puits autour on dépose le sérum des différents patients. Il s'agit d'une méthode qualitative et comparative. => Diffusion de l'ag (puits) et de l'ac (sérum dans le puits) pendant 24h. Précipitation sous forme d'un arc si rencontre entre l'ag et l'ac => arc d'identité. Si il n'y a pas d'identité, les arcs se coupent. On fait migrer ici l'anticorps et l'antigène = diffusion double. 3/6

4 Immunofluorescence indirecte: C'est une technique automatisée sauf la lecture qui se fait au microscope. Présence de lames de microscopies (par exemple à 8 puits) portant des tissus ou cellules dans chaque puits : l'ag est donc sur la lame sous sa conformation in situ. On introduit donc le sérum de malade dilué => Lavages => Révélation des complexes immuns par un anticorps anti-immunoglobulines humaines lié à un fluorochrome => Lavages => Révélation de la fluorescence par une lumière UV (par le biais d'un microscope à fluorescence). Il s'agit d'une méthode qualitative qui peut être semi-quantitative en manipulant le degré de dilution d'un sérum positif. Exemple : Recherche d'auto anticorps détectés par immunofluorescence indirecte : Anticorps anti-nucléaires : 2 patients positifs => 2 aspects différents : homogène, et moucheté indiquant des antigènes différents donc des maladies différentes. 4/6

5 III.) Agglutination C'est une technique d'immunoanalyse encore beaucoup utilisée pour les groupes sanguins ou encore dans la détection de facteurs rhumatoïdes par exemple. L'agglutination ne marche qu'avec des anticorps qui agglutinent. Par définition cela marche bien avec ceux qui forment des réseaux => IgM anti-fc des IgG : facteur rhumatoïde : utilisation de globules rouges ou de billes de latex recouvertes d'anticorps Fc des IgG => si présence des anticorps IgM anti-fc des IgG dans le sérum du patient => agglutination visible a l œil nu. IV.) Western Blot C'est une technique très manuelle donc de moins en moins utilisé Cellules entières en culture ou tissu (en suspension) : présence de multiple protéines (Ag) Extraction des protéines par migration, électrophorèse sur gel en polyacrylamide Transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose Découpage de bandelettes Saturation Incubation des Sérums (Anticorps?) Révélation des complexes Ag/Ac sur la membrane (par un système enzymatique le plus souvent). 5/6

6 V.) Le test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) C'est une méthode très utilisée, automatisable entièrement, haut débit (micro-plaques de 96 puits) : L'antigène purifié ou recombinant est combiné au sérum du malade (Anticorps??) Lavages Ac anti-ig humaines lié à une enzyme Lavages Substrat de l'enzyme Lavages Réaction colorée Spectrophotomètre. La densité optique mesurée peut être corrélée à une quantité d'anticorps grâce à une courbe d'étalonnage => rend la technique quantitative. En résumé... En immunoanalyse médicale, plus un test biologique est sensible, moins il est spécifique et inversement. On ne peut pas avoir de test idéal. Applications en routine: - Dosage de protéines non Ig : hormonologie, protéines de l'inflammation - Dosage d'ig : Ig monoclonales, déficits immunitaires, maladies auto-immunes (auto-ac), sérologies infectieuses et post-vaccinales. Causes d'erreurs en immunoanalyse : préanalytiques (échantillons,..), analytiques (dilution,etc..), post analytiques (interprétation du test,..). Nombreuses techniques possibles : Pièges (rôle du biologiste+++), Limites (sensibilité..), Avantages/inconvénients, Prix de revient. 6/6

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