IV. diagnostic viral. 4. Techniques diagnostiques. 1. Détection d anticorps. monomère. IgM. pentamère. dimère. IgA

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1 IV. Diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus Ls différnts approchs possibls dans l diagnostic viral, dirct t indirct, sront miux compriss par qulqus xmpls pratiqus détaillés. Nous décrivons ici qulqus tchniqus d détction d anticorps, d détction t d caractérisation ds virus (sous-typs, résistanc aux médicamnts antiviraux). 1. Détction d anticorps Lorsqu un animal ou un homm ntr n contact avc un antigèn étrangr, il réagit par un réaction immunologiqu spécifiqu. L H H(avy) L(ight) Ctt réaction comprnd dux volts : un réaction humoral avc la production d anticorps qui rconnaissnt l antigèn t un réaction cllulair avc augmntation d un population cllulair cytotoxiqu spécifiqu. Ctt réaction survint aussi lors du contact avc un virus par infction ou vaccination. Variabl Constant ss ss ss ss La production d anticorps spécifiqus put êtr détcté avc ds tchniqus rlativmnt simpls. Cs tsts sont ffctués généralmnt sur du sérum d où l nom d tsts sérologiqus. IV Structur d un molécul d immunoglobulin Ls anticorps sont ds protéins, nommés immunoglobulins ou gamma-globulins, divisés n différnts classs : ls immunoglobulins, M,, E. C sont surtout ls Ig (monomèrs) t ls IgM (pntamèrs) qui sront rchrchés dans l diagnostic ds maladis virals. Immunoglobulins L H H(avy) L(ight) Ig monomèr ss ss ss ss IgM pntamèr Ig dimèr IV Structur d un molécul d immunoglobulin 4. Tchniqus diagnostiqus 6

2 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Séropositivité : Présnc d'anticorps Ig incubation Infction Survnu ds anticorps Maladi Séroconvrsion : apparition d'anticorps sur dux sérums succssifs 2 Ig Infction incubation 1 Détction ds anticorps 1 2 Echantillons d sérum Maladi ugmntation d titr ou taux d'anticorps ntr ls dux sérums 2 1 Ig Infction incubation ugmntation ds anticorps 1 2 Echantillons d sérum Maladi Rchrch d'igm IgM Infction incubation +/- 3 mois Survnu ds anticorps Maladi 4. Tchniqus diagnostiqus 7

3 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Ig IgM incubation Infction Maladi IV pparition d anticorps après infction t lur détction L tst sérologiqu détctra : La présnc d anticorps ou séropositivité : cci sign l contact avc l virus mais n prmt pas d datr l momnt d l infction. Pour crtains virus qui prsistnt dans l organism cla indiqu égalmnt l état d portur (xmpl : l virus du SID ou VIH/HIV) L apparition d anticorps ntr dux sérums succssifs prélvés généralmnt à un intrvall d 10 à 21 jours. On parl d séroconvrsion. Cci indiqu qu un prmir contact a u liu autour du momnt du prmir prélèvmnt. Un augmntation d la concntration d anticorps ntr dux sérums. Ctt concntration s xprim n titr ou n unités tst utilisé. Un augmntation indiqu qu il y a u un stimulation du systèm immunitair : cll-ci put êtr du à un infction récnt ou à un réactivation viral symptomatiqu ou non. La présnc d anticorps d la class M (IgM), qui sont présnt pndant ls prmirs mois après un contact. La présnc d anticorps Ig d faibl avidité. L avidité ds anticorps augmnt au cours ds mois succédant à un infction aiguë. Un faibl avidité indiqu donc un infction récnt. 4. Tchniqus diagnostiqus 8

4 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Qulqus xmpls d tsts sérologiqus Ls tsts d agglutination Ils font appl à ds particuls microscopiqus (latx, gélatin ou globuls rougs) rcouvrts d un antigèn viral avc ss épitops, qui sront mélangés à un dilution d sérum. Ls anticorps sont capabls d lir dux épitops t établiront donc ds ponts ntrs ls particuls qui sront visibls comm un agglutination microscopiqu ou macroscopiqu. Un problèm pouvant survnir avc c gnr d tst st l fft «prozon» : lorsqu il y a un très grand quantité d anticorps, il y a déséquilibr ntr la quantité d anticorps t d antigèns t la réaction n s produit pas. Lorsqu, dans c cas, on dilu l sérum la réaction dvint positiv. Résultat positif Résultat négatif Efft prozon IV Tst d agglutination pparition d anticorps après infction t lur détction Définir l taux d anticorps par titration vc l tst d agglutination l princip d la titration st aisémnt compris. Il s agit d établir un séri d dilutions d sérums t d ffctur la réaction d détction avc chaqu dilution. La plus haut dilution offrant ncor un réaction positiv donnra l titr. Lorsqu à un dilution d 1/32 on détct ncor ls anticorps, mais plus à 1/64, on dit qu l titr d anticorps dans c sérum st d 32. Lorsqu ls particuls utilisés pour l tst d agglutination sont ds globuls rougs (avc lurs proprs protéins d surfac fortmnt glycosylés comm antigèns), on parl d hémagglutination. C tst st souvnt utilisé, non pas pour la détction d anticorps, mais pour la détction d particuls virals s liant aux acids sialiqus (comm l virus d la gripp). 0.5 ml d diluant dans chaqu tub IV Titration d un sérum pour la rchrch d anticorps 4. Tchniqus diagnostiqus 9

5 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus ELIS ou EI (Enzym Linkd ImmunoSorbnt ssay ou Enzym Immunossay) Cs tsts font appl à un conjugué couplant un nzym à un anticorps d détction. Cs tsts prmttnt un automatisation complèt ds tsts t d ctt façon d tstr d nombrux sérums. L princip st donné dans la figur IV L ELIS prmt aussi un évaluation du taux d anticorps, mais au liu d fair appl à un titration, il fait appl à un courb standard pour comparr ls valurs obtnus. Dans c cas l résultat sra xprimé n unités. Cs unités sront intrnationals (UI) si la comparaison s fait avc un standard intrnational ou arbitrairs (U) s il n y a pas d standardisation. Il xist d nombruss variants du tst ELIS, comm ls tsts d captur t ls tsts compétitifs. L princip put égalmnt êtr modifié pour la détction d antigèns. Ls tsts sérologiqus décrits dans ctt sction sont donc aussi utilisés pour l idntification d virus phytopathogèns à partir d un xtrait végétal. insi, chaqu anné, ds cntains d millirs d ELIS sont réalisés pour détctr ls virus potntillmnt présnts dans ls pomms d trr dstinés à la plantation, pour minimisr ls risqus d prts d rndmnt liés à cs virus. ntigèns dans un puits d un plaqu n polystyrèn + Sérum Incubation Si ds anticorps sont présnts, ils s fixnt sur l'antigèn Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Conjugué (anticorps antihumain couplé à un nzym) Incubation Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat pour l'nzym L substrat s color si l'nzym st présnt Lctur photométriqu IV Titration d un sérum pour la rchrch d anticorps 4. Tchniqus diagnostiqus 10

6 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Wstrn blot Lorsqu on confirm un résultat obtnu n sérologi d routin, on utilis parfois un tst dit Wstrn blot (W), qui st un modification du princip ELIS énoncé plus haut. Dans l tst W, ls protéins d un lysat viral sont séparés n élctrophorès sur gl d polyacrylamid (PE), nsuit transférés («blotting») vrs un fuill d nitrocllulos ou d nylon. Ctt fuill, découpé n lanièrs, prmttra d tstr ls sérums pour rchrchr ls anticorps contr ls différnts protéins avc un tchniqu dont l princip rssmbl à cll d l ELIS décrit plus haut. La réaction apparaît comm un band d dépôt à l ndroit où s trouv la protéin concrné. - + Lysat viral Protéins séparés SDS-PE "blotting" Transfrt ds antigèns séparés sur nitrocllulos Protéins lourds Découpag n bands Protéins légèrs IV Préparation ds bands d Wstrn blot L substrat s color t s dépos à l'ndroit d l'antigèn conjugué anticorps antigèn IV Détction d anticorps par Wstrn blot 4. Tchniqus diagnostiqus 11

7 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p31 p24 p17 p15 () () + - IV Résultat d détction d anticorps 4. Tchniqus diagnostiqus 12

8 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Rchrch ds anticorps IgM Dans ls tsts ELIS, l conjugué put spécifiqumnt êtr dirigé contr un class particulièr d immunoglobulins, ls Ig ou ls IgM. Ls tsts rchrchant ls IgM posnt un crtain nombr d problèms, t d façon général ils rstnt moins fiabls qu ls tsts Ig. Dans un tst, suivant l format donné dans la figur IV ds résultats faussmnt négatifs ou positifs puvnt survnir. Ds résultats faussmnt négatifs survinnnt lorsqu il y a baucoup d Ig accompagnant ls IgM. Ls Ig vont saturr ls sits d réaction t n prmttront pas aux IgM d s fixr. IgM ntigèns dans un puits d un plaqu n polystyrèn + Sérum Si ds IgM sont présnts, ils s fixnt sur l'antigèn Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Conjugé (anticorps anti IgM couplé à un nzym) Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat pour l'nzym L substrat s color si l'nzym st présnt IV Tst immuno-nzymatiqu pour la rconnaissanc ds IgM 4. Tchniqus diagnostiqus 13

9 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus Intrférnc du factur rhumatoïd (FR) dans ls Elisa IgM Par aillurs, d nombrux facturs puvnt intrvnir pour crér ds résultats faussmnt positifs. L plus important st l factur rhumatoïd (FR) : il s agit d IgM réagissant d façon non spécifiqu avc ds Ig complxés ou liés à un antigèn. Lorsqu dans l tst ELIS ds Ig spécifiqus s sont liés à l antigèn t qu c complx st rconnu par l factur rhumatoïd présnt dans l sérum du patint, un réaction d rconnaissanc d IgM s fra lors d l ajout d conjugué, donnant faussmnt l imprssion qu ds IgM spécifiqus sont présnts. FR (IgM) Ig ntigèns dans un puits d un plaqu n polystyrèn + Sérum L factur rhumatoïd s fix sur l complx antigèn-anticorps Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Conjugé (anticorps anti IgM couplé à un nzym) Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat pour l'nzym L substrat s color malgré l'absnc d'igm spécifiqus IV Intrférnc du factur rhumatoïd dans ls Elisa IgM Il y a dux façon d évitr l fft du factur rhumatoïd t n mêm tmps d mpêchr l fft d un fort concntration d Ig spécifiqus : 4. Tchniqus diagnostiqus 14

10 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 1. jout d anti-ig : on dilu l sérum avc un diluant contnant ds anticorps anti-ig humains. Cci complx ls Ig (donc moins d Ig n solution) t fix l factur rhumatoïd. FR (IgM) nti Ig FR (IgM) FR (IgM) + Sérum + anti-ig L FR rconnaît l complx Ig Séparation du sérum (avc évntullmnt IgM spécifiqus) Surnagant placé dans un plaqu ELIS pour la détction ds IgM spécifiqus IV jout d anti-ig 2. Tst d captur : on utilis un ELIS d captur d IgM : ls IgM sont capturés par ds anticorps anti-igm fixés sur la phas solid. Ensuit on détct ls IgM avc l antigèn viral concrné conjugué à un nzym. Suls ls IgM spécifiqus réagissnt. Lavag pour éliminr + ntigèn couplé ls élémnts non à un nzym fixés + Sérum nti IgM Si ds IgM spécifiqus d l'antigèn sont présnts, ls antigèns sont captés Si ds IgM non spécifiqus (par x FR) sont présnts, pas d captag d l'antigèn Lavag pour éliminr ls élémnts non fixés + Substrat Réaction positiv Réaction négativ IV Tst d captur différnciant ls IgM spécifiqus t ls IgM non spécifiqus 4. Tchniqus diagnostiqus 15

11 IV. Diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 2. Rchrch dirct du virus 2.1. Microscopi éléctroniqu L microscop élctroniqu st un outil qui prmt d visualisr ds objts xtrêmmnt ptits. Pour ctt raison, il a été utilisé abondammnt pour caractérisr t idntifir ls virus. Conçu au cours ds annés 1930, notammnt par Ernst Ruska qui obtindra un prix Nobl pour cla n 1986, l microscop élctroniqu à transmission «transmission lctron microscop» (TEM) génèr un faiscau d élctrons au départ d un cathod soumis à un voltag très élvé. C faiscau d élctrons st dirigé sur un échantillon qu il travrs pour n révélr l imag sur un écran fluorscnt, un plaqu photographiqu ou plus récmmnt sur un camra CCD qui put alors révélr l imag n tmps rél sur un monitur. D autrs microscops comm l microscop à balayag «Scanning Elctron Microscop» (SEM) ou l microscop d forc atomiqu «tomic Forc Microscop» (FM) prmttnt aussi d visualisr la structur ou ds détails d particuls virals. IV Microscop élctroniqu Si ll présnt un intérêt crtain pour la virologi, la microscopi élctroniqu st cpndant pu utilisé n rgard d l invstissmnt rquis t d la tchnicité élvé qu ll impliqu. Pour la mis n évidnc d virus, on travaill généralmnt avc ds grills d cuivr ou d zinc rcouvrts d un fin film d carbon t/ou d formvar. On dépos nsuit sur c film un préparation viral qu l on va colorr avc ds agnts comm l acétat d uranyl ou l acid phosphotungstiqu. Ls virus apparaissnt alors n contrast négatif comm ds structurs clairs sur un fond foncé. On parl d coloration négativ. La tchniqu prmt d idntifir l virus sur bas d sa structur t d sa taill. Son principal avantag st la rapidité d réalisation. On put la combinr avantagusmnt avc ls tchniqus immunologiqus : on parl alors d décoration immunologiqu (la particul viral st ntouré d immunoglobulins qui lui donnnt un aspct plus dns), d immunosorbnt lctron microscopy (ISEM) lorsqu l on adsorb ls particuls virals à l aid d immunoglobulins, un pu à la manièr d un ELIS. Dans crtains cas, on a utilisé ds particuls métalliqus sphériqus pour marqur spécifiqumnt crtains structurs virals (immunogold-lablling) IV Particuls virals (n microscopi élctroniqu) IV Idntification d structur viral par la tchniqu d la décoration immunologiqu IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 16

12 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 2.2. Cultur viral La cultur d clluls (cll cultur) prmt d maintnir n croissanc ds clluls n conditions contrôlés. C procédé a été largmnt utilisé pour l isolmnt t la maintnanc d souchs virals. in qu ctt approch soit souvnt lnt t qu ll rquirt un tchnicité élvé, ll a longtmps été considéré comm l standard pour ls laboratoirs d diagnostic d maladis virals humains ou animals (Lland and inocchio, 2007). Son principal avantag st d prmttr l isolmnt d un grand nombr d virus très différnts. L chrchur va chrchr à détctr, par xamn microscopiqu d clluls n cultur, ds indics d infction viral. L spctr ds ffts st assz larg t rquirt un xpérinc conséqunt. On put citr l gonflmnt ou l rétrécissmnt ds clluls, ls rgroupmnts ou la formation d syncytium pour allr dans crtains cas jusqu à la dstruction complèt. Cs changmnts sont applés ffts cytopathiqus (cytopathic ffcts CPE). Crtains détctions puvnt êtr réalisés ndéans ls prmièrs 24h comm souvnt pour l HSV (uman Hrps Simplx Virus), mais d autrs dmandnt un périod bin plus longu. Dans crtains cas, on va combinr l tst à un hémadsorption (HD) qui prmttra l idntification spécifiqu d virus qui xprimnt ds hémagglutinins. IV Efft cytopathiqu Flèchs noirs : clluls normals Flèchs griss : après infction, ds îlots d clluls commncnt à s arrondir Flèchs blanchs : ls clluls s détachnt t murnt Un détction dirct d antigèns viraux par fluorscnc put complètr adéquatmnt la tchnologi t raccourcir d façon important la duré d la cultur. Ls tchniqus d cultur cllulair ont baucoup évolué au cours ds drnièrs annés pour offrir d nouvaux formats d cultur t ds altrnativs intérssants n trm d diagnostic. D autrs tchniqus, comm l inoculation d œufs mbryonnés ou ncor d animaux d laboratoir, si lls n sont pas à proprmnt parlr ds tchniqus liés à la cultur d clluls, prmttnt la mis n évidnc d virus. Côté virus d plants, on a aussi utilisé ls culturs d clluls végétals (protoplasts) pour la multiplication t l étud d virus. Toutfois, la tchnicité élvé rquis n a limité l intérêt dans l cadr du diagnostic viral. IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 17

13 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 2.3. Détction dirct d antigèns La détction dirct ds protéins antigéniqus d origin viral prmt dans d nombrux cas d posr un diagnostic rapid. Dans crtains cas, ctt détction st rapid t facil, comm par xmpl pour la détction du virus rspiratoir syncytial (RSV) dans ds sécrétions rspiratoirs ou la détction d un antigénémi dans ls polymorphonucléairs nutrophils lors d un infction par l cytomgalovirus (CMV). IV Elisa - Vidéo Lorsqu l virus n st pas cultivabl, ctt approch d détction dirct st souvnt privilégié. C sra l cas par xmpl pour la détction d l antigèn d surfac du virus d l hépatit (ghs) présnt dans l sang ou ncor pour ls virus qui infctnt ls plants. Lorsqu l virus st cultivabl, l utilisation d la détction dirct prmt d accélérr l diagnostic t d obtnir un détction plus rapid. Ls tchniqus utilisés pour la détction dirct d antigèns sont ls mêms qu clls utilisés pour la détction d anticorps, déjà décrits. On va donc utilisr ds tchniqus d agglutination, d précipitation, ELIS (nzym-linkd immunosorbnt assay) ou d immunofluorscnc. Dans c drnir cas, on va utilisr ds anticorps anti-antigèn marqués avc un molécul fluorscnt, comm l isothiocyanat d fluorscéin. L xamn d la préparation à l aid d un microscop à épifluorscnc, qui émt un lumièr ultravioltt, prmt la détction d un coloration spécifiqu n surfac ds clluls xaminés. Il st aussi possibl d détctr ls protéins virals après élctrophorès sur gl d polyacrylamid t transfrt sur un mmbran d nitrocllulos : on parl alors d «Wstrn blot»(fiure: Wstrn blot VQ protéin d capsid). Ctt tchniqu prmt notammnt, outr la détction d la protéin viral, qu l on put détctr au moyn d anticorps, d mttr n évidnc son poids moléculair. Ctt tchniqu st égalmnt utilisé pour la rchrch d anticorps contr ds composants virals. gglutination ntigèn Elisa Immunofluorscnc dirct f + Conjugué (Ig couplé à un fluorscéin) qui s fix sur ls antigèns U.V. f IV Détction d antigèns IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 18

14 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 2.4. Détction d acids nucléiqus Il st possibl d détctr l DN ou l RN viral par hybridation. L princip à la bas d ctt tchniqu st tout simplmnt clui d la complémntarité ds doubls brins! Si l on soumt ls acids nucléiqus à un tmpératur élvé (94 C), ls brins s dissocint. Si lors du rfroidissmnt, un sond complémntair à un ds brins st présnt, ll s apparira alors au brin cibl. Ls sonds sont généralmnt marqués à l aid d marquurs radioactifs ou d un molécul comm la digoxigénin, facilmnt idntifiabl. ppliqué à la détction d l RN, on va parlr d «Northrn blot», t d «Southrn blot» lorsqu il s agit d détction d DN. Ctt tchniqu st utilisé pour la détction d crtains virus n anatomopathologi. Ell st d moins n moins utilisé dans l domain du diagnostic pur, mais consrv tout son intérêt pour l étud du fonctionnmnt viral au sin d la cllul. IV Thrmocyclur Mais dpuis un vingtain d annés, d nouvlls tchniqus ont véritablmnt révolutionné l domain du diagnostic. La réaction d polymérisation n chaîn («polymras chain raction» ou PCR) prmt d copir un séqunc nucléotidiqu connu un très grand nombr d fois c qui n facilit la détction, à l aid d amorcs spécifiqus t d un apparil applé thrmocyclur. 5' 3' 5' 3' C C T T C C C C T T C C C C T C C T C C C C T T C C C C T C C T Taq Polymras 3' 5' 5' Ct apparil st capabl d répétr rapidmnt un séri d cycls d chauff t d rfroidissmnts. L xcllnt connaissanc ds génoms viraux a facilité c dévloppmnt tchnologiqu. Dans l cas ds virus à RN, on réalisra d abord un transcription invrs (rvrs transcription) à l aid d un nzym applé transcriptas invrs (rvrs transcriptas), avant la réalisation d la PCR. On parlra alors d un RT-PCR. La tchniqu st maintnant largmnt utilisé n virologi t décliné n plusiurs vrsions, comm la PCR multiplx qui vis l amplification d plusiurs cibls au sin d la mêm réaction ou ncor la PCR niché (nstd PCR), qui prmt d augmntr ncor la snsibilité d la réaction n réalisant un PCR suivi d un duxièm PCR ciblant un portion intrn du prmir amplicon produit. La tchniqu PCR, si ll offr l avantag d un très grand snsibilité, n n présnt pas moins ds défauts! L prmir st la difficulté d quantifir l DN ciblé. C problèm a été contourné avc l dévloppmnt d PCR quantita- Dénaturation (95 C) 5' 3' 3' 5' Hybridation (50 C) 5' 3' 3' 5' Extnsion (72 C) 5' 3' 3' 5' IV Princip d la PCR IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 19

15 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus tivs La quantification d la fluorscnc associé à un sond Taqman ou à un agnt colorant comm l SYR grn prmt d quantifir l DN ciblé dans la réaction, n suivant l élaboration ds produits d amplification au fur t à msur d la réaction, sans dvoir ouvrir l tub réactionnl : il s agit d un PCR quantitativ n tmps rél. 5' 3' 3' 5' Un duxièm problèm rncontré avc ctt tchnologi st sa très grand snsibilité : un simpl contamination d l échantillon à tstr put conduir à ds faux positifs. Ctt limitation impliqu la mis n plac d msurs stricts par l laboratoir d manièr à limitr au maximum cs risqus. Par aillurs ls produits d amplification, fort richs n amplicons, sont un sourc important d contamination, si on n sépar pas clairmnt ls zons d préparation ds zons d amplification dans l laboratoir. C risqu n xist par n cas d PCR n tmps rél où l tub d amplification rst frmé. Troisièm problèm : ls virus ont un génom xtrêmmnt variabl. Lorsqu la séqunc nucléotidiqu rchrché n st plus xactmnt idntiqu à cll ciblé par la PCR, cla put ntraînr ds résultats faussmnt négatifs. Plusiurs solutions tchniqus minimisnt c problèm : choix judiciux ds amorcs dans un zon très stabl du génom, utilisation d amorcs dégénérés, c.à.d. où à un mêm position plusiurs nucléotids sont possibls. La PCR t ls tchniqus d hybridation prmttnt d quantifir ls acids nucléiqus viraux, t donc ls virus uxmêms! On parl alors d charg viral. Ell st souvnt détrminé par PCR ou RT-PCR. L étud d la charg viral prmt d suivr avc précision l dévloppmnt d un infction, d proposr ds indications d traitmnt t d n suivr ls ffts. Par xmpl, la charg viral st actullmnt souvnt utilisé comm outil d suivi dans ls infctions par l virus d l hépatit, d l hépatit C, d l immunodéficinc acquis (VIH ou HIV) ou l cytomégalovirus. D la mêm manièr, on chrch à quantifir ls virus pathogèns ds végétaux au sin d culturs d protoplasts, pour comprndr lur fonctionnmnt au sin d la cllul végétal. IV Cycls succssifs 5' 3' 3' 5' IV Xièm cycl IV diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 20

16 IV. Diagnostic viral 4. Tchniqus diagnostiqus 3. Caractérisation du virus 3.1. Classification précis du virus Lors du diagnostic d un infction viral, on put s arrêtr à la morphologi général, tll qu obsrvé par microscopi élctroniqu (x. : capsid icosaédriqu sans nvlopp d nm), à la famill viral (x. : Picornavirida ou Hrpsvirida), à la sous-famill (x. : α-hrpsvirina) ou à l spèc (x. : virus d l hépatit C). Divrss raisons puvnt poussr à idntifir l virus d façon plus précis t il xist différnts classifications pour distingur à l intériur ds spècs virals : Sérotyps : ils s distingunt l un d l autr par lurs antigèns, qu on put distingur à l aid d anticorps spécifiqus, d où l nom d sérotyp. Cs sérotyps sont parfois rgroupés dans ds sérogroups.(x. : ls ntérovirus sont classiqumnt rconnus comm sérotyps, comm par xmpl cho 30) énotyps : ils s distingunt l un d l autr par la similitud d lur séqunc nucléotidiqu. Nous avons vu sous «variation génétiqu» qu ls virus s modifint continullmnt. Il st ainsi possibl d ls séparr d après ds rgroupmnts phylogénétiqus. Cs génotyps puvnt avoir un importanc capital dans la pathologi (x. : Ls papillomavirus puvnt appartnir à ds génotyps différnts, parmi lsquls ont put distingur ds typs bénins t malins. Cs drnirs (surtout génotyps 16 t 18) sont associés par xmpl au cancr du col d l utérus) ou dans l traitmnt (x. : ls infctions par ls génotyps 2 t 3 du virus d l hépatit C répondnt miux t plus rapidmnt au traitmnt qu ls infctions par l génotyp 1). Elctrophérotyps : ctt distinction st typiqumnt utilisé pour ls rotavirus. C sont ds virus contnant un génom RN sgmnté n 11 sgmnts. En faisant migrr l RN viral par élctrophorès, on obtint un patron d bands rprésntant ls différnts sgmnts. On obsrvra un différnc dès qu l poids t la charg ds sgmnts diffèrnt. C tst fut fort utilisé jusqu il y a qulqus annés pour suivr la dissémination ds virus dans la population. ctullmnt, on fait plus souvnt appl à l analys phylogénétiqu. Pathotyps : pour ls virus ds végétaux t ds animaux non-humains, l spctr d hôt, la capacité à infctr un plant particulièr ou ncor l xprssion d un phénotyp particulir lors d l infction sont ds critèrs d distinction facils t intérssants. On parl alors d pathotyps. L analys phylogénétiqu ds séquncs nucléotidiqus ds virus prmt d construir ds arbrs dont ls branchs rlint ls séquncs ls plus similairs. Cs analyss prmttnt d rtracr l origin commun d crtains virus, 4. Tchniqus diagnostiqus 21

17 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus c qui st particulièrmnt util quand on rchrch ds chaîns d transmission, par xmpl à l intériur d un institution d soins d santé Résistanc aux antiviraux L introduction d médicamnts antiviraux a ntraîné l adaptation ds virus avc l apparition d résistancs aux produits antiviraux. Cas particulir ds virus d plants s Pour n savoir + [ nalys phénotypiqu : Par ctt analys, on rchrchra la résistanc d un virus s répliquant in vitro pour un médicamnt donné. On put travaillr avc un virus isolé à partir du patint t qu on a propagé n cultur cllulair. On put aussi amplifir la région du génom viral qui cod la cibl du médicamnt (par xmpl, la transcriptas invrs du virus du SID) t l insérr dans un virus d référnc dont on tst nsuit la snsibilité à la molécul antiviral. Ls dux tchniqus présntnt ds avantags t ds inconvénints, mais l inconvénint majur ds dux st qu c sont ds tchniqus longus t laboriuss. nalys génotypiqu : La région d intérêt du génom viral st amplifié t séquncé. On déduit alors, d ctt séqunc nucléotidiqu, la séqunc n acids aminés d la protéin codé par ctt région. Un crtain nombr d mutations clés sont connus qui confèrnt un résistanc au virus. Souvnt, ls mutations sont multipls t il st nécssair d utilisr ds algorithms plus ou moins compliqués t régulièrmnt mis à jour pour intrprétr c qu on voit. (Qulqus sits d mis à jour d algorithms : l NRS français ; Stanford databas t Rga : ) caus d l xistnc du phénomèn d quasi-spèc t la possibilité d un différnc ntr l virus produit (t donc détcté) t l virus latnt, l génotypag a ss limits. Un précaution important st d ffctur c gnr d analys pndant l traitmnt par c médicamnt. insi la population viral xaminé st composé d virus soumis à la prssion sélctiv du traitmnt. 4. Tchniqus diagnostiqus 22

18 IV. Diagnostic viral > 4. Tchniqus diagnostiqus 3.3. Charg viral Ls virus causant un virémi puvnt êtr quantifiés dans l sérum ou l plasma afin d suivr l fficacité d un traitmnt. On appll la concntration viral, la charg viral. Différnts tchniqus ont été proposés pour quantifir l virus du SID, l virus d l hépatit t l virus d l hépatit C. ctullmnt, c st surtout la PCR n tmps rél qui st utilisé. Il xist ds systèms automatisés prmttant d tstr d grands nombrs d échantillons. Ls résultats puvnt êtr xprimés n copis/ml ou n UI/ml, lorsqu l dosag s fait par rapport à un standard intrnational. Ls variations d 0,3 à 0,5 log10 sont généralmnt considérés comm significativs. u nivau d la plant, ds tchniqus similairs sont utilisés pour l dosag ds virus au départ d l RN ou d l DN viral, via un xtrait total ds acids nucléiqus d un échantillon d plant. Il st ainsi capital d connaîtr la charg viral pour pouvoir comparr différnts génotyps d plants quant à lur résistanc à l infction viral. D autrs tchniqus, comm la détction par hybridation in situ ou détction immunologiqu, prmttnt d localisr l infction viral t d miux connaîtr sa distribution. 4. Tchniqus diagnostiqus 23