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1 Systèmes confocaux rapides Tristan Piolot Plateforme de recherche «Imagerie des processus dynamiques en Biologie Cellulaire et Biologie du Développement» IFR 117 Institut Jacques Monod Tel: Mail:

2 L image d un point n est pas un point Confocal mono-photon Confocal bi-photon Video-microscopie +déconvolution Ajout d un pinhole Excitation pulsée Traitement mathématique

3 L image d un point n est pas un point A α Tâche d Airy Optique géométrique optique ondulatoire Huygens: approche par ondelette Chaque point d une onde peut envoyer une ondelette Toutes les ondelettes provenant de la même onde sont mutuellement cohérentes ->interférences

4 Le Pinhole Adjustment de la taille du pinhole au diamètre de la tâche d Airy Résolution latérale : d xy = 0.46λ/NA (0.61 λ/na) Résolution axiale : d z = 1.4nλ/NA 2 ( 2 λ/na 2)

5 Microscopie confocale Illumination pinhole sample Detection pinhole Condenser lens Objective lens detector Principe du confocal, Minsky 1957

6 Microscopie plein-champs et microscopie confocale Plein champs Confocal

7 Influence du pinhole sur la résolution

8 Système de scanning.. Une image confocale est faite point après point (un seul point = monofocal) Laser Scan driver Scanner

9 Quelques avantages et inconvénients des système confocal monofocal monophoton conventionnel Résolution : élevée (pinhole) Vitesse: lente (monofocal) Photoblanchiment: important (pinhole, monophoton) Perte de lumière et photoblanchiment : important (pinhole, monophoton)

10 Le Disque Nipkow - Petran 1968 Pinholes Le balayage laser X-Y est assuré par le deplacement des pinhole (disque tournant). Scanner Multi-point Une camera CCD assure l acquisition de l image confocale. La source d exitation est un laser Le trajet optique simplifié diminue les pertes de lumières

11 Principe de Disque de Nipkow Et du scanner double disque 1-2% 70%

12 Tête confocale Spinning Disque Collecteur Faisceau Laser Microlentilles Caméra CCD Disque de Pinholes Miroir Dichroïque Pinhole Lentilles Objectif Echantillon

13 Spinning disk, confocal monophoton multifocal Jens Januschke Equipe Antoine Guichet Rab6-GFP 5 image / seconde

14 Spinning disk, confocal monophoton multifocal tac-gfp Jean-René Huynh Equipe Lepesant IJM 1 stack/30seconde

15 Spinning : confocal monophoton multifoocal Quelques avantages et inconvénients Résolution : élevée (pinhole, ouverture pinhole fixe, diaphonie) Vitesse: rapide (multifocal) Photoblanchiment et perte de lumière : assez important (pinhole, monophoton, espacement, trajet optique simple)

16 Système Disque DSU (Scanning Unit) (Olympus ) le pattern porté par le disque tournant est constitué de fentes. La source d excitation est une lampe L effet confocal est obtenu par une fente et pas un pinhole

17 DSU: Quelques avantages et inconvénients des système Résolution : moyenne (fente) Vitesse: rapide (multi-fente!) Photoblanchiment et perte de lumière : peu importants (fente, trajet optique simple)

18 LSM 5 Live (Zeiss) Le pinhole est remplacé par une ou plusieurs fentes, de tailles variables : L acquisition s effectue avec une ligne-ccd, comportant 512 pixels :

19 LSM 5 live : Quelques avantages et inconvénients Résolution : moyenne (fente) Vitesse: rapide (balayage dans une seule dimension.. ) Photoblanchiment et perte de lumière : peu importants (fente)

20 Confocal multi-photon Principe de l excitation multi-photonique 1 - photon 2 - photons Absorption proportionnelle à l intensité Absorption proportionnelle au carré de l intensité Laser pulsé Ti:Sa femtoseconde λexc = nm Impulsions ~ 80 fs à 80 MHz

21 Multiphotons et imagerie en profondeur Cellule mitrale du bulbe olfactif d un rat anesthésié D après Charpak et col., PNAS, 2001 Marqueur : Ca++ - Green nm, z max : 450 µm

22 Multiphotons et préservation de l échantillon IR peu absorbé dans les tissus biologiques La région imagée correspond à la région éclairée Peu de photoblanchiment hors du plan focal Moins de photoblanchiment en x,y Dans certains cas, problèmes d échauffement de l échantillon!!

23 Comparaison photoblanchiment sur confocaux monophoton et multiphotons, acquisition de 100 piles de 10 images 120 Photoblanchiment de l'egfp en monophoton et multiphotons Dynamique (niveau de gris) nombre de piles confocal monophoton confocal multiphotons Proportion de photoblanchiment observée sur l image 5 de la piles 100 monophoton : 60% multiphoton : 12%

24 Microscopie multi-photons : Quelques avantages et inconvénients En multiphotons: Possibilité d aller en profondeur dans l échantillon Peu de photoblanchiment Mais : Difficulté de mise en œuvre Risque d échauffement de l échantillon Séparation des fluorophores plus difficile

25 TriMscop Multiphoton-multipoints M M M M N faisceaux 1 ou 2 lignes Fenêtre de balayage Un faisceau M M M Multiplicateur de faisceau En sortie sans le scanner En sortie avec le scanner Source Marc Tramier, IJM Excitation : laser pulsé (multi-photons) Une camera CCD assure l acquisition de l image confocale. Excitation multi-photonique par balayage d une ligne de 64 faisceau

26 Idéal pour le suivi temporel avec peu de photoblanchiment!! Tau-GFP en cellules ND7 Multiphotons multifocal (TriMscop) Marc Tramier, Christiane Durieux, Maïté Coppey, IJM)

27 TriMscop: confocal multifocal multi-photons Quelques avantages et inconvénients des système Résolution : bonne (multi-photon, diaphonie) Vitesse: rapide (multi-focal) Photoblanchiment et perte de lumière : peu importants (pas de pinhole, multiphoton)

28 Sytème Leica Sp2-RS ou SP5 RS Scanners résonnants jusqu à 8000 hertz et Hz en bidirectionnel 100 images secondes Format: 512 x 265, bidirectional scan, zoom 1.5, 4 frames per second, twofold line average:

29 Leica SP2-RS ou SP5-RS: Confocal monofocal mono ou multiphotons Quelques avantages et inconvénients des système Résolution : bonne (pinhole ou multi-photon,) Vitesse: rapide (scanner resonnant) Photoblanchiment et perte de lumière en mono photon: importants (pinhole, temps de rémanence faible..) en multi-photon: peu important (pas de pinhole)

30 ILLUMINATION STRUCTUREE: Principe: Projection de l image d une grille pendant l illumination de l objet Acquisition de 3 images correspondant à 3 positions de la grille Algorithme: élimination de la lumière hors plan focal. Epifluorescence ApoTome

31 Illumination structurée Avantages : entretien peu coûteux! résultat direct (pas de déconvolution) Simple d utilisation Idéal pour criblage Inconvénients : Photoblanchiment très important Lenteur des acquisitions Incompatibilité avec observations dynamiques

32 Préservation échantillon résolution rapidité Multi-couleurs Échantillon épais Microscope confocal monofocal monophoton Microscope confocal monofocal biphoton Vidéo-microscopie Microscope confocal multifocal monophoton (Spinning) Microscope confocal multifocal biphoton (TriMscope) Illumination structurée

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