LIGNES DIRECTRICES SUR LES AUTOANALYSEURS COLORIMETRIQUES EN ŒNOLOGIE

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1 ORGANISATION INTERNATIONAL DE LA VIGNE ET DU VIN LIGNES DIRECTRICES SUR LES AUTOANALYSEURS COLORIMETRIQUES EN ŒNOLOGIE Résolution OIV-OENO , adoptée par l Assemblée Générale de l OIV le 25 juin 2010 à Tbilissi OIV /40

2 ORGANISATION INTERNATIONAL DE LA VIGNE ET DU VIN LIGNES DIRECTRICES SUR LES ANALYSEURS AUTOMATIQUES EN OENOLOGIE Les premiers développements de l analyse automatique en œnologie sont apparus au début des années Ils ont été réalisés à partir d analyseurs à flux continu, utilisés jusqu alors essentiellement en biologie médicale. Les principaux paramètres accessibles étaient alors l acidité volatile, les sucres réducteurs, le dioxyde de soufre libre et total. Plus tard, des techniques enzymatiques ont été acquises, autorisant, en particulier, le dosage du glucose et du fructose et des acides malique et lactique. En 1980 des analyseurs proches infra-rouge (PIR) ont permis une mesure rapide du titre alcoométrique volumique dans les vins et des sucres dans les môuts. Les premiers analyseurs séquentiels, eux aussi issus de l analyse médicale, sont apparus au début des années Ils permirent rapidement l accès à de nombreuses déterminations à base de réactions chimiques (composés phénoliques totaux, dioxyde de soufre libre et total, acide tartrique, acide acétique, ou enzymatiques (glucose et fructose, acide malique et lactique, acide citrique, ) Plus tard, à la fin des années 1990, la technique infrarouge à transformée de Fournier (IRTF) est venue compléter les automates à disposition des laboratoires d œnologie. Toutes ces techniques automatiques sont actuellement très largement répandues dans le monde entier. Elles ont permis une diminution très significative du coût de l analyse œnologique qui s est traduite par la possibilité, non pas de diminuer celui-ci pour les utilisateurs mais leur permettre d accéder, pour un coût donné, à beaucoup plus de paramètres et donc d informations. Cette situation a permis d accompagner, par l analyse toutes les étapes de la vie du vin d une manière beaucoup plus efficace. L analyse automatique s est aussi rapidement avérée fiable et répétable, à condition de mettre en œuvre des techniques de contrôle qualité interne (CQI) adaptées. Une caractéristique fondamentale de toutes les techniques automatiques est qu elles sont strictement comparatives. Les analyseurs automatiques doivent, en effet, faire l objet de calibrages initiaux avec des étalons de valeur connue. Ces calibrages peuvent être permanents, semi-permanents, journaliers ou même associés à chaque série d échantillons. La qualité des résultats obtenus est ainsi directement dépendante de celle des étalons de calibrage mis en œuvre. Ces étalons peuvent être des vins ou des moûts présentant des valeurs connues pour les paramètres recherchés. Ils peuvent aussi être des solutions synthétiques. Les méthodes automatiques restent, le plus souvent, des méthodes internes dont chaque laboratoire doit pouvoir s assurer de la qualité des résultats par différentes approches : - validation initiale de la méthode - qualité des étalons de calibrage et de contrôle utilisés - participation très régulière à des chaînes de comparaison interlaboratoires - comparaison régulière des résultats avec ceux obtenus par les méthodes de référence, etc La très large utilisation des techniques automatiques dans le monde du vin rend leur rôle technologique, commercial et de contrôle, incontestable et fondamental pour l économie et les échanges viti-vinicole. Cela justifie la publication de ce guide qui ne constitue pas un document de référence mais seulement d information. Il a pour seuls buts : - de décrire le principe des techniques mises en œuvre, la pratique de leur application et les limites de leur utilisation ; - de détailler les méthodes appliquées les plus courantes, sachant que celles-ci sont souvent adaptées partiellement par les laboratoires en fonction de l appareil utilisé ou des matrices mises en œuvre. La liste proposée n est en aucun cas limitative et d autres applications sont possibles. De nouveaux développements sont régulièrement proposés. OIV /40

3 LIGNES DIRECTRICES SUR LES AUTOANALYSEURS COLORIMETRIQUES EN ŒNOLOGIE Avertissement : Ce guide ne constitue pas un document de référence mais seulement d information. Les méthodes figurant dans ces lignes directrices ne peuvent pas être considérées comme des méthodes de référence au même titre que celles figurant au Recueil des méthodes internationales d analyse des vins et des moûts de l OIV ou au recueil des méthodes internationales d analyse des boissons spiritueuses d origine vitivinicole de l OIV. Seules les méthodes publiées dans le Recueil des méthodes internationales d analyse des vins et des moûts de l OIV ou dans le recueil des méthodes internationales d analyse des boissons spiritueuses d origine vitivinicole de l OIV ont un caractère officiel et sont applicables pour le contrôle et le règlement de différends. Ces analyseurs automatisent les différentes étapes d une analyse chimique ou enzymatique et utilisent une détection colorimétrique. Il existe deux grandes familles utilisées en œnologie : Les analyseurs à flux continu ; Les analyseurs séquentiels. 1 LES ANALYSEURS A FLUX CONTINU Les premiers travaux sur l automatisation de l analyse chimique en œnologie par flux continu ont été réalisés par MORFAUX, SARRIS et al. entre 1969 et Ce n est cependant qu à partir de 1974 que cette technique gagne les laboratoires d œnologie de terrain avec la mise au point de méthodes fiables et répétables. Composition et principe d une chaîne d analyse automatique à flux continu Une chaîne d analyse automatique à flux continu est composée de modules séparés assurant chacun une fonction bien précise (figure 1). 1.1 Le distributeur d échantillon Il comprend un plateau pouvant contenir généralement 20 à 60 godets d échantillons d un volume compris entre 1 et 3 ml. Un bras pivotant muni d une aiguille vient prélever les échantillons les uns après les autres. Entre chaque échantillon, l aiguille plonge dans un liquide de rinçage. L aiguille est reliée au reste du circuit analytique par un tube en PVC. Tour à tour le liquide de rinçage, un échantillon, 3/40

4 puis à nouveau le liquide de rinçage et un nouvel échantillon sont aspirés à travers l aiguille vers le circuit analytique. La cadence de l analyse est ainsi réglée au niveau du distributeur d échantillon. Si l aiguille prélève un échantillon pendant une minute puis le liquide de rinçage pendant une minute, la cadence sera de 30 échantillons à l heure. Il est possible de régler à volonté cette cadence de même que le rapport du temps de rinçage et du temps de prélèvement de l échantillon qui n est pas forcément de 1 comme dans l exemple ci-dessus mais de 2, 1/2, 1/3, 1/4, etc. 1.2 Une pompe péristaltique C est le cœur de la chaîne d analyse automatique. Tous les mouvements de liquide dans le circuit analytique sont réglés par la pompe. Elle comprend en général de 20 à 30 canaux. Chacun est constitué par un tube, généralement en PVC, qui est écrasé contre un support par une série de rouleaux. L avancement de ces rouleaux fait circuler le liquide à l intérieur du tube de pompe. Le débit de chacun des tubes est fonction de son diamètre intérieur. Ainsi, en utilisant des tubes de diamètres différents (0.005 à cm) et bien que la vitesse d avancement des rouleaux de la pompe soit rigoureusement constante, il existe une gamme très large de débits. Cela permet de régler de façon précise les débits d admission de l échantillon et des différents réactifs dans le circuit analytique. 1.3 Une cassette analytique Elle comprend tous les éléments du circuit analytique. C est à son niveau que l échantillon peut être soumis à différents traitements en fonction de l analyse à réaliser : - dilution ; - dialyse ; - addition de réactif ; - mélange ; - distillation ; - passage au bain- d eau thermostatée (température et durée variable). Une partie du circuit peut être thermorégulée. Tous les flux liquides circulant dans le circuit analytique sont, dès la sortie de la pompe, segmentés régulièrement par les bulles d air tous les 1 ou 2 centimètres. Ces bulles d air, grâce aux forces de tension superficielle, interdisent la diffusion d un composé en solution d une section de colonne liquide prise entre deux bulles vers celle qui la précède ou celle qui la suit. En outre, la bulle d air ressuie la paroi du tube de verre ou de PVC dans lequel elle circule. De cette façon, toute contamination d un échantillon à l autre et toute dilution d un échantillon par le liquide de rinçage qui le précède et qui le suit sont éliminés. Ce principe fondamental de la séparation des liquides par une bulle d air est utilisé dès le distributeur d échantillon. En effet, au niveau de l aiguille de prélèvement l aspiration est constante ; lorsque l aiguille passe du bain de rinçage au godet d échantillon, une petite quantité d air est prélevée, donnant naissance à une bulle qui dans le tube de prélèvement, sépare le liquide de rinçage de l échantillon. Une deuxième génération de matériel à flux continu, utilisant la technique du micro-flux, permettant de se dispenser de la segmentation, a été proposée. Ce type de matériel, en raison de problèmes d encrassements difficiles à résoudre, est resté cependant peu diffusé. Les principes analytiques restent les mêmes que pour les appareils à segmentation. 1.4 Un détecteur La détection la plus courante est la colorimétrie. La majorité des analyses chimiques automatisées reposent sur une méthode colométrique en particulier dans le domaine œnologique. Cependant, d autres détecteurs peuvent être utilisés : - spectrophotomètre UV ; - photomètre à flamme ; - fluorescimètre ; - néphélomètre ; 4/40

5 - compteur de cellules ; - réfractomètre ; - électrodes spécifiques ; 1.5 Un enregistreur La présence du composé recherché dans l échantillon prélevé se traduit, au niveau du détecteur, par un signal dont l intensité est proportionnelle à la concentration de ce composé. Ce signal est enregistré sous forme de pics (fig. 2). Entre chaque pic, le retour vers la ligne de base correspond au prélèvement du liquide de rinçage. La fiabilité de la méthode d'analyse à flux continu repose sur la lecture de l'enregistreur grâce aux principes suivants : 1 La création d'un état d'équilibre dans le circuit analytique tel que le retour à la ligne de base est toujours obtenu par prélèvement du liquide de rinçage et par le fait qu'une concentration donnée dans l'échantillon du composé analysé donne un pic d'une hauteur constante. 2 La méthode de dosage est une méthode comparative. Toutes les mesures sont faites par rapport à une gamme étalon dont les concentrations sont parfaitement connues. Tout mauvais fonctionnement du circuit se traduit par une perturbation de l'enregistrement (dérive de la ligne de base, variation de la forme des pics, variation de la hauteur des pics d'étalonnage, etc.), ce qui limite les erreurs d'analyse. Fig. 2 Modèle d enregistrement obtenu dans le cas du dosage de l acidité volatile dans les vins pour une cadence de 30 échantillons par heure. (les valeurs indiquées sont exprimées en g/l d acide sulfurique) 5/40

6 1.6 Une interface numérique Celle-ci permet la conversion du signal analogique issu du colorimètre en valeur numérique qui peut être directement exprimée en concentration du composé dosé. Elle inclut généralement un système de contrôle permettant de s assurer que le dosage n a pas été perturbé. 2 LES ANALYSEURS SEQUENTIELS Principe et organisation d un analyseur séquentiel Ces analyseurs sont le plus souvent multiparamétriques. Ils peuvent ainsi réaliser plusieurs dosages sur un même échantillon et ces dosages peuvent être programmés pour chaque échantillon. Chaque échantillon à analyser est prélevé, placé dans une cuvette de mesure transparente où il reçoit le ou les réactif(s). Une mesure colorimétrique est faite directement sur cette cuvette. Les cadences sont comprises entre 50 et 1000 dosages par heure. Les principales applications sont effectuées soit en analyse chimique soit en analyse enzymatique. Les volumes de réactif nécessaires sont faibles, ce qui limite les coûts, en particulier pour les dosages enzymatiques. Un analyseur séquentiel est composé de plusieurs éléments Composition d un analyseur séquentiel Un plateau de prélèvement Celui-ci peut contenir un nombre variable de godets dans lesquels les échantillons à analyser sont placés Un plateau réactionnel Il est composé de cuvettes transparentes qui reçoivent la prise d essai de l échantillon à analyser et le ou les réactifs nécessaires. Elle sont maintenues dans un bain thermostaté à température constante et permettent une lecture colorimétrique. Les cuvettes peuvent être à usage unique ou nettoyées par une rampe de lavage avant une nouvelle utilisation Un plateau de réactifs Celui-ci supporte les réservoirs des réactifs pour réaliser les dosages souhaités. Ils sont placés dans une enceinte réfrigérée, ce qui autorise l utilisation de réactifs fragiles dans le cas des méthodes enzymatiques Un ou des bras de prélèvement Ils permettent de prélever, à l aide d un système de seringue automatique les échantillons sur le plateau de prélèvement et les réactifs sur le plateau de réactifs et de les placer successivement dans la cuvette réactionnelle Un lecteur optique Celui-ci permet une mesure colorimétrique des différentes cuvettes réactionnelles, soit à des moments précis (début et fin de réaction par exemple) soit de manière dynamique afin de pouvoir établir une courbe de réaction pour chacune d entre elles. Dans ce second cas, la mesure de la vitesse initiale de réaction peut être évaluée et utilisée pour le calcul de la concentration du composé recherché Un module électronique-informatique Celui-ci assure le pilotage du système et les calculs nécessaires pour obtenir le résultat recherché Schéma analytique Le schéma analytique peut être variable. L exemple décrit ci-dessous correspond aux cas les plus classiques. Il comporte les étapes suivantes : 6/40

7 Prise d échantillon L échantillon de vin dont le volume est déterminé pour chaque dosage est prélevé sur le plateau d échantillon et placé dans une cuvette réactionnelle Ajout du premier réactif Le premier réactif (R1) est prélevé sur le plateau de réactif, pour un volume spécifique, et ajouté dans la cuvette réactionnelle. L ensemble est, en général, homogénéisé par un système d agitateur Temporisation 1 Le mélange réactionnel est laissé en l état pendant une durée donnée (souvent 4 à 6 minutes) Mesure d absorbance Une première mesure d absorbance à la longueur d onde requise est effectuée. Elle correspond au point zéro de la réaction mise en œuvre et permet de prendre en compte une éventuelle influence de la couleur du vin Ajout du deuxième réactif Le second réactif (R2) est ajouté à la cuvette réactionnelle. C est lui qui déclenche la réaction colorimétrique recherchée Temporisation 2 Le mélange réactionnel est laissé en l état pendant une durée donnée (souvent 4 à 6 minutes) Mesure d absorbance Une deuxième mesure d absorbance à la longueur d onde requise est effectuée. Elle permet de mesurer la variation d absorbance due à la réaction elle-même. Ce schéma basique peut varier. Ainsi, pour les appareils les plus performants, la mesure d absorbance peut se faire de façon dynamique avec une lecture toutes les 12 secondes par exemple. Cela permet d établir une courbe de réaction et de mesurer la vitesse initiale de réaction qui, dans des conditions analytiques précises, peut être proportionnelle à la concentration du composé recherché Calcul des concentrations Pour les applications œnologiques, celui-ci est toujours fait par calibrage avec des vins de concentration connue en analyte ou des solutions synthétiques de celui-ci. Le nombre d étalons de calibrage peut être variable et plus élevé si la courbe réactionnelle n est pas linéaire. Certains matériels ne peuvent utiliser qu un seul réactif, ce qui élimine la possibilité de réalisation de certains dosages pour lesquels deux réactifs distincts sont nécessaires. En revanche, les appareils autorisant l utilisation de deux réactifs peuvent facilement n en utiliser qu un seul si cela suffit pour la méthode considérée. 7/40

8 ANNEXE 1 EXEMPLES DE METHODES DE DOSAGE USUELLES EN ŒNOLOGIE PAR ANALYSEURS AUTOMATIQUES EN FLUX CONTINU Les méthodes décrites ci-dessous ne sont décrites qu à titre d exemple, d autres méthodes pouvant être utilisées Appréciation de la teneur de l acidité volatile dans les vins et les moûts 2.2 Principe L acidité volatile est constituée par les acides gras appartenant à la série acétique. Les acides lactique, succinique, carbonique ainsi que le dioxyde de soufre sont exclus de l acidité volatile. Les acides de la série acétique sont séparés des constituants du vin par micro-distillation à 98 C sous courant d azote. L acide lactique est rectifié lors de la distillation. Le dioxyde de soufre est oxydé en acide sulfurique par du peroxyde d hydrogène et éliminé avant l étape de distillation. Le gaz carbonique n interfère pas. Le distillat des acides de la série acétique est mis en présence d un réactif d oxydo-réduction dont les variations d intensité colorante sont proportionnelles à la teneur en acidité volatile : iodure de potassium ou bleu de bromophénol. 2.3 Appareillage Chaîne à flux segmenté. 2.4 Réactifs et solutions Solution de peroxyde d hydrogène Peroxyde d hydrogène (N CAS[ ]) 30 à 35 % (ou 110 vol.) 0,5 ml eau déminéralisée qsp 200 ml. Conservation: 1 jour Solution d acide tartrique à 5 % acide tartrique (L, D ou DL) cristallisé pur 50 g eau déminéralisée qsp 1000 ml. Conservation en flacon teinté: 1 mois à + 4 C Iodure et iodate de potassium Solution de KI (N CAS[ ]) à 10 % (p/v) Solution de KIO 3 (N CAS[ ]) à 0,2% (p/v) Conservation en flacon teinté: 1 mois. On peut vérifier la neutralité des solutions de KI et KIO 3 en mélangeant de petites quantités dans un tube. Le mélange doit rester incolore Bleu de bromophénol Indicateur coloré - Bleu de bromophénol (N CAS[ ]) 330 mg - Phosphate de potassium (N CAS[ ]) 0.1 M 100 ml - Tétrahydroborate de sodium (N CAS[ ]) 0,1 M 5 ml Eau distillée qsp 1000 ml. Agiter puis laisser reposer pendant 3 jours à l abri de la lumière. Avant utilisation, filtrer puis ajuster le ph à 4,9 avec la solution de tétrahydroborate de sodium. 8/40

9 2.4.5 Solutions d étalonnage (au choix) Solutions d acide acétique (N CAS[ ]) de 0,2 à 1 g l -1 exprimé en H 2 SO 4 (de 4 à 20 méq ou de 0,28 à 1,40 g l -1 en acide acétique) Conservation : 1 jour Vins de référence de teneur connue en acidité volatile 2.5 Mode opératoire Le diagramme des flux est indiqué en annexe. Les échantillons ne subissent aucun traitement préalable. La cadence d analyse peut varier de 30 à 60 échantillons par heure selon le montage utilisé. 2.6 Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité intra-laboratoire : 0,05 g l -1 en H 2 SO 4 (0,07 g l -1 en acide acétique) Reproductibilité inter-laboratoire : 0,10 g l -1 en H 2 SO 4 (0,14 g l -1 en acide acétique) 2.7 Bibliographie DUBERNET M. Dosage automatique de l acidité volatile dans les vins. Connaiss. Vigne et Vin, 1976,10,3, PILONE G.J. Effect of lactic acid on volatile acid determination of wine. J. of Oenol. 1967,18, SARIS J., MORFAUX J.N., DERVIN L. Détermination automatique de l acidité volatile du vin. Ind. Alim. Agric., 1970, 87, Annexes : Exemples de diagrammes de flux Bleu de Bromophénol 9/40

10 2.8.2 Iodure de potassium 3 Appréciation de la teneur des acides L-malique et L-lactique dans les vins et les moûts Principe En présence de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD + ), L acide est oxydé dans une réaction catalysée par son enzyme spécifique: la malate déshydrogénase (MDH) dans le cas de l acide malique, la lactate-déshydrogénase (LDH) dans le cas de l acide lactique. C est une réaction d équilibre que l on déplace dans le sens de la formation de NADH par un tampon d hydrazine basique et un excès de NAD +. MDH L-malate + NAD + <==> oxaloacétate d hydrazone + NADH + H + LDH L-lactate + NAD + <==> pyruvate d hydrazone + NADH + H + La quantité de NADH produite est proportionnelle à la concentration en acide de l échantillon. Son absorbance est mesurée à 340 nm. 3.1 Appareillage Chaîne à flux continu segmenté. 3.2 Réactifs Brij 35 (N CAS[ ]) 30% (p/v) Tampon ph 9,5 environ Pour 500 ml: Glycine pure (N CAS[ ]) 38 g Sulfate d hydrazine (N CAS[ ]) 26 g 10/40

11 EDTA (N CAS[ ]) 1,0 g Hydroxyde de sodium (N CAS[ ]) 20 g Brij % 5 gouttes Eau bidistillée qsp 500 ml. Filtrer si nécessaire. Conservation maximale 2 mois à +4 C NAD +, MDH et LHD β Nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) (NAD) (N CAS [ ]) de pureté 98% MDH suspension dans du sulfate d ammonium (N CAS [ ]) LDH suspension dans du sulfate d ammonium (N CAS [ ]) Conservation: Flacon MDH ou LDH non entamé à -20 C jusqu à la date de péremption. Flacon entamé +4 C au maximum 6 mois ou jusqu à la date de péremption. La poudre de NAD + est conservée à sec à +4 C jusqu à la date de péremption Solutions enzymatiques pour l analyse Solution NAD à 100 mg pour 10 ml d eau bidistillée. Solution de MDH ou LDH: 100 µl dans 10 ml d eau bidistillée. Les quantités à préparer sont fonction de la durée d analyse. Conservation: une semaine à +4 C Solutions de référence d acide L-malique (N CAS[ ]) ou L-lactique (N CAS[ ]) de 0,5 à 5 g/l 3.3 Mode opératoire Le diagramme des flux est donné en annexe. Les échantillons ne subissent aucun traitement préalable. Dans le cas d échantillons chargés en matières en suspension, une centrifugation est indispensable. La cadence analytique est de 30 échantillons par heure au moins avec temps de prélèvement / temps de rinçage = 1/1. Remarque: Pour les vins rouges très colorés, on soustraira à l absorbance mesurée celle due à la coloration du vin à 340 nm, par passage des échantillons sans l enzyme dans les réactifs mais en gardant le coenzyme NAD Expression des résultats Les résultats sont exprimés en grammes par litre avec une décimale 3.5 Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité inter-laboratoire : 0,15 g l Bibliographie Battle, J.-L. et Bouvier, J.C., Automatisation de dosages enzymatiques pour l analyse oenologique, Revue Française d Oenologie (Cahier Scientifique), 1986, 26, (101) : Battle, J.-L., Joubert, R., Collon, Y. et Jouret, C., Dosage enzymatique en flux continu du L- malate et du L-lactate dans les moûts de raisin et les vins, Ann. Fais. Exp. Chim., 1978, 71(766) : Curvelo-Garcia, A. S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées à l analyse des vins et des moûts, Feuillet Vert de 1 OIV n 941 (1993). 11/40

12 3.7 Annexe : Exemple de diagramme des flux ml/mn 12/40

13 4 Appréciation de la teneur de l acide tartrique dans les vins et les moûts Principe. La méthode de Rebelein est appliquée sur des échantillons de vin dialysés pour développer une couleur rouge orangée à chaud (37 C) avec le métavanadate de sodium en milieu alcalin. L absorbance est mesurée à 520 nm. De fortes teneurs en acide malique et en sucres peuvent interférer. 4.1 Appareillage. Chaîne à flux continu segmenté. 4.2 Réactifs Brij 35 (N CAS[ ]) 30% p/v Acide acétique (CH 3 COOH) (N CAS[ ]) pur Solution d acétate de sodium (NaCH 3 COO) (N CAS[ ]) à 27 % Vanadate d ammonium (NH4 VO3) (N CAS[ ]) Solution N d hydroxyde de sodium (NaOH) (N CAS[ ]) Solution acide d acétate de sodium acide acétique 80 ml acétate de sodium 27 % 320 ml brij 30 % 1 ml eau distillée qsp 1000 ml Conservation: 1semaine Solution de métavanadate de sodium. vanadate d ammonium 4 g solution NaOH M 150 ml acétate de sodium 27% 200 ml eau distillée qsp 500 ml. Conservation: 1 semaine Solutions de référence d acide D(+)-tartrique (N CAS[ ]) de 1 à 8 g/l. 4.3 Mode opératoire. Le diagramme des flux est indiqué en annexe. Les échantillons ne subissent aucun traitement préalable. Dans le cas des moûts ou d autres échantillons chargés en matières en suspension, une centrifugation est indispensable. La cadence analytique est de 30 échantillons par heure (temps de prélèvement / temps de rinçage = 1/1). 4.4 Expression des résultats. Les résultats sont exprimés en grammes par litre avec une décimale. 13/40

14 4.5 Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité inter-laboratoire : 0,7 g l Bibliographie Battle, J.-L., Joubert, R., Colion, Y. et Jouret, C., Utilisation du flux continu pour le dosage colorimétrique de l acide tartrique dans les moûts de raisin et les vins par la méthode de Rebelein, Ann. Fals. Exp. Chim., 1978, 71(764), Curvelo-Garcia, A.S., La fiabilité des méthodes de flux continu segmenté appliquées àl analyse des vins et des moûts, Feuillet Vert de l OIV N 941 (1993). Trossais J. et Asselin C. Influence des teneurs en acide malique des moûts sur le dosage de l acide tartrique par analyse en flux continu par colorimétrie avec le métavanadate. Conn. Vigne Vin. 1985, 19, 4, Annexe : Exemple de diagramme des flux 5 Appréciation de la teneur de l acide citrique dans les vins et les moûts Principe La méthode automatique pour la détermination fluorimétrique de l'acide citrique est basée sur la méthode du dicyclohexilcarbodimide (DCC). L'échantillon réagit avec le DCC en présence d'acide acétique dans le milieu anhydre, ce qui donne lieu à la formation d aconitine. 14/40

15 La longueur d'onde de transmission de l aconitine est de 490 nm et la longueur d'onde d'excitation est de 400 nm. Le signal donné par le fluorimètre est envoyé à une interface qui est connectée au logiciel système. 5.1 Appareillage Chaîne à flux segmenté. 5.2 Réactifs et solutions Solution de chlorure de sodium (NaCl) Chlorure de sodium (NaCl) N CAS [ ], 4,0 g Acide acétique (CH 3 COOH) N CAS [ ], 180 cm 3 Ethanol (CH 3 CH 2 OH) N CAS [ ], 20 cm 3 Solution d'acide citrique 10,0 g/dm 3, 30 cm 3 Eau type I (Norme ISO 3696) ou équivalente qsp, 2000 cm 3 Brij 35 (30%) N CAS [ ], 6 cm 3 Préparation : Dans une fiole jaugée de 2000,0 cm 3, dissoudre le chlorure de sodium dans environ 1600 cm 3 d'eau. Ajouter délicatement l'acide et laisser reposer jusqu'atteindre la température ambiante. Ajouter l'éthanol et la solution d'acide citrique et mélanger. Ajuster à la marque avec de l'eau déminéralisée, ajouter le Brij et mélanger. Conservation: 6 mois butanol (CH 3 (CH 2 )3OH) N CAS [ ] Solution d'acide acétique à 1,7% (v/v) Acide acétique (CH 3 COOH) N CAS [ ], 17 cm 3 1-butanol (CH 3 (CH 2 )3OH) N CAS [ ] qsp, 1000 cm 3 Préparation : Dans le flacon 1-butanol (1 litre), ajouter avec précaution l'acide. Bien mélanger. Conservation: 1 an Solution Dicyclohexylcarbodimide (DCC) Dicyclohexylcarbodimide (C 13 H 22 N 2 ) N CAS [ ], 41 g 1-butanol (CH 3 (CH 2 )3OH) N CAS [ ], qsp, 1000 cm 3 Préparation : Peser le Dicyclohexylcarbodimide dans un erlenmeyer de 1000 cm 3 et ajouter le n-butanol. Bien mélanger. Conservation: 1 an Brij 35 N CAS [ ] Solution de décontamination 1-butanol (CH 3 (CH 2 )3OH) N CAS [ ] 15/40

16 5.3 Préparation de l'échantillon Dégazer l'échantillon afin d'éliminer la plus grande quantité possible de dioxyde de carbone par le vide, au moins 2 minutes, en remuant. Si l'échantillon est trouble il doit être filtré. 5.4 Solutions d étalonnage Solutions d acide citrique (C 6 H 8 O 7 ) N CAS[ ], de 0,07 à 1,00 g/dm 3 en acide citrique Conservation : la stabilité est donnée par le contrôle interne de l'étalonnage Etalons de contrôle de concentration connue de l'acide citrique. Conservation : 1 mois ou par le contrôle interne 5.5 Mode opératoire Le diagramme des flux est indiqué en annexe. La cadence d analyse est d'environ 18 échantillons par heure selon le montage utilisé. 5.6 Résultats 1. Les résultats sont présentés à deux décimales et exprimées en g (acide citrique) l Caractéristiques de la méthode décrite Répétabilité: 0,03 g (acide citrique) l -1 Reproductibilité intra-laboratoire : 0.03 g (acide citrique) l -1 Incertitude : uexp= 0.20 x concentration de l'échantillon en g (acide citrique) l -1 16/40

17 5.8 Annexe : Exemple de diagramme des flux Pompes Debits ml/min Evier Fluorimètre Émission 490 nm L'extinction à 400 nm 2 mm d'épaisseur de cellule Acide acétique air n-butanol DCC air chlorure de sodium échantillon evier Sampler evier o * Membrane de dialyse, Ref SA5283 ** Tubes à la bombe en aciflex 6 Appréciation de la teneur du glucose et du fructose dans les vins et les moûts Principe. La méthode de dosage permet de déterminer la concentration en glucose et en fructose séparément ou la somme de ces deux concentrations dans les vins ou les moûts Phosphorylation du glucose et du fructose. Cette réaction est catalysée par l hexokinase (HK): HK glucose + ATP <==> glucose-6-phosphate + ADP (1) HK fructose + ATP <=> fructose-6-phosphate +ADP ATP : adénosine triphosphate. ADP : adénosine diphosphate Oxydation du glucose-6-phosphate(g-6-p). Elle se fait par l action de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP), en présence de son enzyme spécifique glucose-6-phosphate déhydrogénase (G6PDH). G6PDH G-6-P + NADP+ <==> gluconate-6-phosphate + NADPH + H+ (2) 17/40

18 La réaction d équilibre est déplacée dans le sens de la formation de NADPH, grâce au choix des conditions opératoires (tampon ph 7,6 et excès de NADP). Le NADPH proportionnel à la concentration en glucose dans l échantillon est dosé en mesurant son absorption à 340 nm Isomérisation du fructose-6-phosphate. Cette réaction permet de doser la somme glucose + fructose. L enzyme utilisée est la phosphoglucose-isomérase (PGI). PGI fructose-6-phosphate <==> glucose-6-phosphate (3) Le glucose-6-phosphate formé réagit avec le NADP selon (2) pour former du NADPH, que l on dose à 340 nm. 6.2 Appareillage. Chaîne à flux continu segmenté. 6.3 Réactifs et solutions. Il existe sur le marché de nombreux fournisseurs proposant des coffrets comprenant les réactifs préparés. Un exemple parmi d autres est donné ci-dessous Flacon 1 : Lyophilisat composé de: Tampon triéthanolamine ph = 7,6 NADP (N CAS[ ]) 64 mg ATP (N CAS[ ]) 16O mg Sulfate de magnésium MgSO 4 (N CAS[ ]) Stabilisateurs Flacon 2: 0,7 ml de suspension enzymatique composée de: Hexokinase (N CAS[ ]) environ 200 U Glucose-6-phosphate déhydrogénase (N CAS[ ]) 100 U en solution dans du sulfate d ammonium Flacon 3 : 0,7 ml de phosphoglucose-isomérase (N CAS[ ]) (environ 490 U) en suspension dans du sulfate d ammonium Flacon 4 : 7 ml de solution standard de D-glucose (N CAS[ ]) à 0,5 g -1. Conservation du coffret non entamé à -20 C jusqu à la date de péremption Solution tampon NAD/ATP. Elle se prépare à partir du coffret enzymatique: Dissoudre le contenu du flacon 1 dans 90 ml d eau bidistiliée. Conserver le tampon dilué à -20 C pendant au maximum 3 mois. 18/40

19 6.3.6 Préparation des solutions d enzymes pour le dosage. Exemple de volumes à préparer pour le montage proposé: Dosages Fructose et glucose + fructose Glucose Durée de l analyse tampon NAD/ATP HK/G6PDH PGI 1 heure 15 ml 100 µl 100 µl 4 heures 60 ml 500 µl 500 µl 8 heures 120 ml 1000 µl 1000 µl Le dosage du fructose nécessite deux passages des étalons et échantillons, le temps d analyse double par rapport au dosage du glucose. Conservation des solutions d enzymes pour le dosage: une semaine à +4 C Solutions étalons Solution mère à 10,0 g/l L utilisation du glucose seul suffit pour l étalonnage : l isomérisation du fructose se fera uniquement pour les échantillons. D-glucose anhydre 2,50 g Eau distillée qsp 250 ml Isothiocyanate d allyle (conservateur) (N CAS[ ]) 2 gouttes Solutions filles de glucose: Etalon à 3 g/l : 15 ml de solution mère dans une fiole de 50 ml Etalon à 2 g/l : 10 ml de solution mère dans une fiole de 50 ml Etalon à 1 g/l : 10 ml de solution mère dans une fiole de 100 ml Ces solutions sont ensuite complétées au trait de jauge par de l eau distillée. Etalon à 0,50 g/l : solution standard du coffret enzymatique Conservation: à + 4 C pendant 1 mois. 6.4 Mode opératoire. Le diagramme des flux est indiqué en annexe. La cadence analytique est de 60 échantillons par heure avec un temps de prélèvement / rinçage = 1/1. Les échantillons ne subissent aucun traitement préalable. Dans le cas des moûts ou d échantillons chargés en matières en suspension, une filtration préalable est indispensable. 6.5 Expression des résultats. La concentration en glucose, en fructose ou en glucose + fructose est donnée en g l -1 avec une décimale. 6.6 Bibliographie Battle J.L., Bouvier J.C. Rev. Fr. Oenol., 1986, 101, /40

20 6.7 Annexe : exemple de diagramme des flux 7 Appréciation de la teneur du dioxyde de soufre libre et total dans les vins et les moûts après dialyse Principe. Après acidification du vin, le dioxyde de soufre libre diffuse au travers d une membrane de dialyse. Le dioxyde de soufre combiné est libéré par une hydrolyse alcaline. Les deux dosages s effectuent à 560 nm en présence de para-rosaniline (ou fuschine basique). La segmentation est faite par l azote afin d éviter toute oxydation. SO2 + rosaniline > complexe incolore + formaldéhyde > complexe coloré. La méthode est applicable pour une gamme de LOQ à 200 mg l Appareillage. Chaîne à flux segmenté. 7.2 Réactifs et solutions Réactif spécifique au dosage du dioxyde de soufre libre Solution à 10 % d acide sulfurique (pureté 98%) H 2 SO 4 (N CAS[ ]) 20 ml eau distillée qsp 200 ml. 20/40

21 7.2.2 Réactifs spécifiques au dosage du dioxyde de soufre total Solution d hydroxyde de sodium 4 M NaOH (N CAS[ ]) 40 g eau distillée qsp 250 ml. Conservation : 1 semaine Solution d acide sulfurique (N CAS[ ]) au 1/2 (v/v) Conservation : 1 mois Réactifs communs Azote type R (N CAS[ ]) Solution d acide sulfurique (N CAS[ ]) à 1% (v/v) Conservation : 1 mois Solution de formaldéhyde à 6 % (v/v) formaldéhyde à 37 % minimum (N CAS[ ]) 1,2 ml eau distillée qsp 200 ml. Conservation : 1 jour en flacon bouché Rosaniline (réactif coloré). Solution mère: 2 g/l de fuschine basique (ou chlorhydrate de rosaniline) (N CAS[ ]) Agiter puis laisser reposer 3 jours et conserver à l abri de la lumière. Conservation : 3 mois en flacon teinté. Solution de travail - solution mère 40 ml - acide orthophosphorique (N CAS[ ]) 62 ml - eau distillée qsp 500 ml. Conservation : 2 semaines en flacon teinté. Note : Cette préparation est fortement exothermique. Prendre les précautions d usage Solutions étalons synthétiques Solution acide à ph 3 environ. H 2 SO 4 1 % (N CAS[ ]) 5ml eau distillée qsp 1000 ml. Cette solution servira à compléter les fioles étalons de SO 2. Conservation : 1 jour Solution mère à 300 mg l -1 de SO 2 Disulfite de sodium pur (N CAS[ ]) solution ph 3 qsp Conservation : 1 jour. 227 mg 500 ml Solutions étalons filles. Exemple de préparation d une solution étalon à 120 mg l -1 : solution mère à 300 mg l ml solution ph3 40 ml eau distillé qsp 125 ml Etalons Vins. Vins de référence ou contrôlés par la méthode de référence. 21/40

22 7.3 Mode opératoire. Les diagrammes des flux sont donnés en annexe. Les échantillons ne subissent aucun traitement préalable. La cadence analytique peut atteindre 60 échantillons par heure avec temps rinçage / prélèvement = 2/1 Remarque: En fin d analyse, rincer le circuit analytique à l eau pendant au moins 10 mn. Chaque fois que nécessaire, laver le circuit à l eau de javel au 1/20 pendant 30 mn au moins. Rincer à l eau pendant 2 h minimum. 7.4 Expression des résultats. Les valeurs en dioxyde de soufre s expriment en mg par litre sans décimale. 7.5 Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité inter-laboratoire dioxyde de soufre libre : 7 mg l -1 Reproductibilité inter-laboratoire dioxyde de soufre total : 27 mg l Bibliographie DUBERNET M., L automatisation de l analyse chimique en œnologie. Revue Française d Œnologie, 66, SCHOLTEN G., WOLLER R., HOLBACH B. Automatisierte weinanalyse, 2. Mittteilung. Die Wein. Wiss., 1982, 38, /40

23 7.7 Annexe : exemples de diagramme des flux 23/40

24 8 Appréciation de la teneur du dioxyde de soufre libre et total dans les vins et les moûts par distillation Principe Une alternative à la méthode précédente est aussi largement appliquée. Elle consiste à remplacer la dialyse par une distillation dans une micro colonne. Dans le cas du dioxyde de soufre total, l hydrolyse alcaline n est plus effectuée, la libération de la totalité du dioxyde de soufre est assurée par une acidification plus poussée et par une température de distillation supérieure. 8.1 Réactifs et solutions Réactif spécifique au dosage du dioxyde de soufre libre Solution à 1 % d acide sulfurique (pureté 98%) H 2 SO 4 (N CAS[ ]) 2 ml eau distillée qsp 200 ml Réactif spécifique au dosage du dioxyde de soufre total Solution d acide sulfurique (N CAS[ ]) à 20 % (v/v) Conservation: 1 mois Réactifs communs Azote type R (N CAS[ ]) Solution d acide sulfurique (N CAS[ ]) à 1% (v/v) avec addition de 4 gouttes par litre de mouillant Brij 35 (N CAS[ ]) Conservation : 1 mois Solution de formaldéhyde formaldéhyde à 40 % (N CAS[ ]) 10 ml eau distillée qsp 1000 ml. Conservation: 1 jour en flacon bouché Solution d hydroxyde de sodium (NaOH) 0,2 M Hydroxyde de sodium (N CAS[ ]) Brij 35 (N CAS[ ]) eau distillée qsp Rosaniline (réactif coloré). 4 g 2 gouttes 500 ml. Solution mère: 2 g/l de fuschine basique (ou chlorhydrate de rosaniline) (N CAS[ ]) Agiter puis laisser reposer 3 jours et conserver à l abri de la lumière. Conservation: 3 mois en flacon teinté. Solution de travail solution mère 70 ml acide orthophosphorique H 3 PO 4 (N CAS[ ]) 70 ml eau distillée qsp 500 ml. Conservation : 2 semaines en flacon teinté. Note : Cette dilution est fortement exothermique. Prendre les précautions d usage Solutions étalons synthétiques Solution acide à ph 3 environ. H 2 SO 4 1 % (N CAS[ ]) 5 ml eau distillée qsp 1000 ml. Cette solution servira à compléter les fioles étalons de SO 2. 24/40

25 Conservation: 1 jour Solution mère à 300 mg l -1 de SO 2 Disulfite de sodium pur Na 2 S 2 O 5 (N CAS[ ]) solution ph 3 qsp Conservation : 1 jour. 227 mg 500 ml Solutions étalons filles. Exemple de préparation d une solution étalon à 120 mg l -1 : solution mère à 300 mg l ml solution ph3 40 ml eau distillé qsp 125 ml Etalons Vins. Vins de référence ou contrôlés par la méthode de référence. 8.2 Expression des résultats. Les valeurs en dioxyde de soufre s expriment en mg par litre sans décimale. 8.3 Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité inter-laboratoire dioxyde de soufre libre : 7 mg l -1 Reproductibilité inter-laboratoire dioxyde de soufre total : 27 mg l -1 25/40

26 8.4 Annexe : exemples de diagramme des flux Dosage du dioxyde de soufre libre 5 tours Colonne de distillation Azote pour entraînement Débit : 40 ml/mn Réfrigérant (eau froide) 20 tours Evier Pompe ml/mn 0,16 1,40 0,05 1,60 0,05 2,50 Cadence : 90 éch. / heure Rapport prélèvement /rinçage : 1/1 Echantillon H 2SO 4 1% Azote pour bullage NaOH 0,2 M Azote pour bullage Colorimètre 560 nm 5 tours 5 tours Bain-marie 48 C ± 5 C 5 tours 0,60 1,20 0,32 0,32 0,80 H 2SO 4 1% + Brij Formaldéhyde Para-rosaniline Dosage du dioxyde de soufre total Reprise colorimètre Réfrigérant (eau froide) Colonne de distillation Bain-marie 105 C ± 5 C Azote pour entraînement Débit : 40 ml/mn Cadence : 90 éch. / heure Rapport prélèvement /rinçage : 1/1 Pompe ml/mn 20 tours Evier 0,16 1,40 0,05 1,40 0,05 2,00 Echantillon H 2SO 4 10% Azote pour bullage NaOH 0,2 N Azote pour bullage Colorimètre 560 nm 3 x 20 tours 5 tours ANNEXE 2 0,60 1,20 0,32 0,32 0,80 H 2SO 4 1% + Brij Formaldéhyde Para-rosaniline Reprise colorimètre 26/40

27 EXEMPLES DE METHODES DE DOSAGE USUELLES EN ŒNOLOGIE PAR ANALYSEURS SEQUENTIELS Les méthodes décrites ci dessous ne sont décrites qu à titre d exemple, d autres méthodes pouvant être utilisées Dosage de l acide acétique dans les vins et les moûts Principe Méthode enzymatique. En présence d ATP, l acide acétique est transformé en acétyl-phosphate catalysée par l acétate kinase. (1) Acétate + ATP Acétate Kinase Acétyl-phosphate + ADP dans une réaction L ADP formé par cette réaction est retransformé en ATP par réaction avec du phosphoénolpyruvate en présence de pyruvate kinase. (2) ADP + Phosphoénolpyruvate Pyruvate Kinase Pyruvate + ATP Le pyruvate est réduit en L-lactate par le nicotinamide-adénine-nucléotide réduit (NADH) en présence de lactate-déshydrogénase. (3) Pyruvate + NADH + H + Lactate déshydrogénase Lactate + NAD + + H 2 O La quantité de NADH oxydé en réaction (3) est déterminée par la mesure de l absorbance à 340 nm, et est proportionnelle à la concentration du vin en acide acétique. Une quatrième réaction permet de maintenir l équilibre de la réaction 1 dans le sens de formation d acétylphosphate par élimination de ce dernier. (4) Acétyl-phosphate + CoA Phosphotransacétylase Acétyl-CoA + Phosphate inorganique Le milieu réactionnel est additionné de polyvinylpyrrolidone (PVP) pour éliminer les interférences dues aux composés phénoliques du vin. 8.5 Réactifs Préparation du tampon MOPS Ajouter : 13 g de MOPS (Acide N-morpholino-3-propanesulfonique) CAS [ ] 500 mg de Chlorure de magnésium, 6H 2 O - CAS [ ] 1,5 g de Chlorure de potassium (KCl) - CAS [ ] 250 ml d eau bidistillée Ajuster le ph à 4,75 avec une solution 1,5 M d hydroxyde de potassium (KOH) - CAS [ ]. Attendre 5 minutes et réajuster à nouveau le ph à 7,45. Compléter à 300 ml avec de l eau bidistillée. Stabilité du tampon : 60 jours à ± 4 C Préparations des réactifs Réactif 1 (R1) : Ajouter à 100 ml de tampon MOPS 400 mg de Polyvinylpyrrolidone (PVP) - CAS [ ] Réactif 2 (R2) Ajouter à 100 ml de tampon MOPS : 300 à 350 mg d adénosine-5-triphosphate, sel disodique (ATP) - CAS [ ] 50 mg de Phosphoenolpyruvate de tricyclohexylammonium (PEP) - CAS [ ] 38 mg de β Nicotinamide adénine dinucléotide (forme réduite) (NADH) - CAS [ ] - Pureté 98% 27/40

28 25 mg de Sel de trilithium de coenzyme A - CAS [ ] -pureté2 400 unités environ de Pyruvate kinase (PK) - CAS [ ] et Lactate déshydrogénase (LDH) - CAS [ ] 600 unités environ de Phosphotransacétylase (PTA) - CAS [ ] 230 unités d Acétate kinase (AK) - CAS [ ] Stabilité du réactif : environ 12 heures à + 4 C. 8.6 Préparation des échantillons Les échantillons de vins sont préalablement dilués au 1/ Procédure analytique Celle-ci peut varier en fonction du matériel utilisé. La description suivante doit être considérée comme un exemple. Le volume des cuvettes réactionnelles est de 300 µl. Le cycle analytique est de 10 minutes soit 50 tours du plateau réactionnel. Une lecture colorimétrique est effectuée toutes les 12 secondes soit à chaque tour du plateau réactionnel, afin de pouvoir tracer la courbe réactionnelle Programmation La longueur d onde de lecture est de 340 nm. Le volume d échantillon dilué au 1/10, ajouté au temps zéro est de 20 µl. Le volume de réactif R1 ajouté au temps zéro est de 111 µl. Le volume de réactif R2 ajouté au bout de 5 minutes est de 125 µl. Le volume réactionnel total est ainsi de 256 µl Calibrage Le calibrage est réalisé en 4 points. Une valeur zéro est obtenue en utilisant une solution à 9 de chlorure de sodium - CAS [ ]. Les trois autres calibrants sont des solutions de concentrations croissantes d acide acétique pur - CAS [ ] (0,25 g l -1 ; 0,50 g l -1 ; 1 g l -1 ) ou des vins étalons de concentration connue en acide acétique Résultats La figure ci-dessous donne une illustration de la courbe réactionnelle obtenue. 28/40

29 Dans les conditions de mesure mise en œuvre, la courbe de réaction observée après l addition du réactif R2 est une droite, dans l échelle de travail retenue (0 à 1 g/l). Elle traduit la vitesse initiale de réaction, proportionnelle à la concentration en acide acétique. La mesure de la pente de cette droite peut se faire par une lecture en deux points aux tours N 27 et 50. La valeur de la concentration en acide acétique sera donnée par la formule : C = K (L1-L2) Dans laquelle K est un facteur de réaction calculé par l appareil après chaque calibration selon la formule suivante : dans laquelle : AB = absorbance du blanc CB = concentration du blanc AEt = absorbance de l étalon CEt = concentration de l étalon K Les résultats sont donnés en g l -1 d acide acétique. 8.8 Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité intra-laboratoire : 0,04 g l -1 Reproductibilité inter-laboratoire : 0,10 g l -1 CEt CB AEt AB 29/40

30 8.9 Bibliographie DONECHE B., et SANCHEZ P.J., 1985 : Automatisation en flux continu du dosage enzymatique de l acide acétique dans les vins, Connaissance de la vigne et du vin, 1985 ; n 3, DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., 1997 Adaptation du dosage de l acide acétique dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717, Feuillet vert OIV N 1001 McCLOSKEY Leo P., 1980 : An improved enzymatic assay for acetate in juice and wine, Am. J. Enol. Vitic. Vol 31, N 2, 1980, pp Dosage du dioxyde de soufre total dans les vins et les moûts Principe Méthode chimique. L échantillon à doser est dilué dans une solution tampon phosphate de ph 8. Après stabilisation, le milieu de réaction reçoit une solution tamponnée de DTNB acide (5,5 -dithio-bis(2- nitrobenzoïque) (3,3-6) ou Bis(3-Carboxy-4-nitrophényl) disulfure, connu sous le vocable «réactif d Ellman». Il s agit d un réactif spécifique permettant la modification et la détection quantitative des liaisons disulfures dont la formule développée est donnée ci-dessous : O OH O 2 N S S NO 2 O OH La réaction développe une coloration jaune mesurable à une longueur d onde de 405 nm. 9.1 Protocole de mesure Matériel Tout matériel d analyse séquentiel permettant l utilisation de deux réactifs et autorisant une mesure à 405 nm peut être utilisé Réactifs Deux réactifs sont mis en oeuvre : Réactif 1 K 2 HPO 4 (CAS [ ]) 17,4 g Eau bidistillée q.s.p ml Le ph de la solution tampon ainsi préparée est ajusté par addition de H 3 PO 4 pur (CAS [ ]) pour obtenir une valeur de 8 (écart maximum tolérable : ± 0,2 unité ph). Réactif 2 DNTB (CAS [ ]) Réactif 1 Ethanol pur 760 mg 900 ml 100 ml 30/40

31 Do (Valeurs relatives) Mise en oeuvre Le tableau suivant résume les différentes quantités d échantillon de vin et de réactifs à ajouter dans la cuvette de réaction au cours du temps : Temps en minutes Echantillon Réactif 1 en µl Réactif 2 en µl en µl Eau bidistillée en µl La lecture de l'absorbance à 405 nm est effectuée régulièrement au cours du temps dont la durée totale est de 10 minutes mais qui peut éventuellement être raccourcie compte tenu de la rapidité de la réaction qui est pratiquement instantanée. Le graphe suivant montre le type de courbe réactionnelle obtenue : Courbe réactionnelle Temps en secondes Après l addition du réactif N 1, la stabilisation est rapide. L addition du réactif N 2 contenant le DNTB est suivie d une réaction colorée immédiate dont le plateau est atteint en quelques secondes. Celui-ci est ensuite stable. La lecture se fait par différence entre l absorbance DO 1 lue après stabilisation du réactif N 1 et l absorbance DO 2 lue au plateau. Cette différence d absorbance est proportionnelle à la teneur en SO 2 total de l échantillon mis en oeuvre. Le calibrage est réalisé soit avec des vins étalons dont les valeurs en SO 2 total sont connues et couvrent la gamme de mesure envisagée, soit à l aide de solutions de métabisulfite de potassium (N CAS[ ]) stabilisées en milieu sulfurique à 1 % et de concentration connue. En général, la courbe de calibration n étant pas tout à fait linéaire, 4 à 5 points de calibration sont nécessaires. Une valeur zéro est obtenue par utilisation d une solution de chlorure de sodium (N CAS[ ]) à Caractéristiques de la méthode décrite Reproductibilité intra-laboratoire : 12 mg l -1 Reproductibilité inter-laboratoire : 20 mg l Bibliographie ELLMAN G.L., For the modification and quantitative detection of sulfhydryl groups ; Arch. Biochem. Biophys. 82,70. DUBERNET M., LEBOEUF J.P. et GRASSET F., Méthode automatisée de dosage colorimétrique du dioxyde de soufre total dans les vins. FV N 1068 OIV. DUBERNET M., PENNEQUIN F. et GRASSET F., Adaptation du dosage du dioxyde de soufre total dans les vins sur analyseur séquentiel Hitachi 717. FV N 997 OIV. 31/40

32 10 Dosage du dioxyde de soufre libre dans les vins et les moûts Principe Méthode chimique. Le dioxyde de soufre libre est stabilisé en milieu acide. Son dosage est asuré par développement, en présence de formaldéhyde, d une coloration rose par combinaison avec la Fuschine préalablement décolorée en milieu phosphorique. Le dosage est corrigé d une réaction parasite due aux composés phénoliques présents dans le vin Matériel Tout matériel d analyse séquentiel permettant l utilisation de deux réactifs et autorisant une mesure à 570 nm peut être utilisé Réactifs Deux réactifs sont mis en oeuvre : Réactif Solution mère de Fushine basique (Chlorhydrate de Rosaniline) Chlorhydrate de Rosaniline (N CAS[ ]) Eau bidistillée q.s.p ml Conservation : 6 mois au réfrigérateur 2g Solution de travail (R1) Solution mère de Fuschine basique Acide phosphorique (CAS [ ]) à 10% Eau bidistillée 3 ml 77 ml 20 ml Conservation : 5 jours à 4 C et à l abri de la lumière Réactif 2 Formaldéhyde (N CAS[ ]) 5 ml Eau bidistillée q.s.p ml Conservation : 1 semaine à température ambiante Préparation des échantillons Les échantillons de vin ne sont pas dilués. Il est recommandé de procéder à l analyse aussi rapidement que possible après prélèvement pour éviter les pertes de dioxyde de soufre libre Procédure analytique La longueur d onde de lecture est de 570 nm. La séquence analytique est la suivante : Tour 1 (6 secondes) : prélèvement de l échantillon de vin de 20 µl Tour 1 (12 secondes) : addition de 250 µl de réactif R1 Tour 24 (288 secondes) : lecture DO1 à 570 nm Tour 25 (300 secondes) : addition de 106 µl de réactif R2 Tour 28 (336 secondes) : lecture DO2 à 570 nm 10.5 Calibrage il est réalisé en deux points. Une valeur zéro est obtenue par utilisation d une solution de chlorure de sodium (N CAS[ ]) à 9. La valeur standard est donnée par une solution régulièrement titrée de métabisulfite de potassium (N CAS[ ]) stabilisée en milieu sulfurique à 1 % et de concentration de 50 mg l -1 environ Lecture des résultats Le schéma suivant montre l évolution de l absorbance à 570 nm. 32/40