Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT 1 de l angiotensine II

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1 Université de Sherbrooke Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT 1 de l angiotensine II Par Ivana Domazet Département de pharmacologie Thèse présenté(e) à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l obtention du grade de philosophiae doctor (Ph.D.) en pharmacologie Sherbrooke, Québec, Canada mars, 2015 Membres du jury d évaluation Dr.Gaétan Guillemette, département de pharmacologie Dr.Emanuel Escher, département de pharmacologie Dr. Michel Grandbois, département de pharmacologie Dr. Marek Rola-Pleszczynski, département de pédiatrie Dr. François Marceau, département de médecine, Université de Laval Domazet Ivana, 2015

2 À ma famille

3 La vie est authentique lorsqu elle change. Léon Tolstoї

4 iv RÉSUMÉ Propriétés structurales et fonctionnelles du récepteur AT 1 de l angiotensine II Par Ivana Domazet Programmes de pharmacologie Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de l obtention du diplôme de philosophiae doctor (Ph.D.) en pharmacologie, Faculté de médecine et des sciences de la santé, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Québec, Canada, J1H 5N4 L angiotensine II (Ang II), une hormone jouant un rôle important dans l homéostasie cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT 1 appartenant à la grande famille des GPCRs. Les sept domaines transmembranaires (TM) des GPCRs contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d identifier les acides aminés du TM2 et du TM5 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT 1, nous avons utilisé l approche SCAM qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa réaction avec le MTSEA. Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfère avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement par une cystéine les résidus 70 à 94 du TM2 ainsi que les résidus 190 à 217 du TM5 du récepteur AT 1 et de son mutant constitutivement actif N111G-AT 1. Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont montré une diminution significative d affinité pour le ligand 125 I- Sar 1,Ile 8 Ang II, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT 1. Le mutant D74C- N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de L81C-N111G fut diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s est avéré sensible au MTSEA. Ces résultats suggèrent que l activation constitutive du récepteur AT 1 implique un mouvement de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers la pochette de liaison. Pour le TM5, après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants L197, N200, I201, G203 et F204 ont montré une diminution significative d affinité pour le ligand 125 I- Sar 1,Ile 8 Ang II, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT 1. Le mutant I201C-N111G est devenu plus sensible au MTSEA, alors que la sensibilité de G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats suggèrent que l activation constitutive du récepteur AT 1 implique un mouvement de rotation du TM5 dans le sens anti-horaire. Le récepteur AT 1 est connu pour coupler préférentiellement à la protéine G q et les propriétés fonctionnelles de ce récepteur ont surtout été évaluées en fonction de sa capacité à induire la production des inositol phosphates et à mobiliser le Ca 2+ intracellulaire. Par contre, le récepteur AT 1 interagit avec d autres protéines G (G i et G 12/13 ) et active également des voies de signalisation indépendantes des protéines G (MAPK). Nous avons évalué une série d analogues de l Ang II pour leur capacité à inhiber ou activer plus ou moins sélectivement les diverses voies de signalisation en aval du récepteur. C est la notion de sélectivité fonctionnelle. Nos résultats démontrent que les substitutions à la position 1 ne confèrent pas de séléctivité fonctionnelle, alors que les substitutions à la position 4 montrent un biais vers la signalisation la MAPK et que les substitutions à la position 8 montrent un biais pour le recrutement des β-arrestines. iv

5 v Mots clés : récepteur AT 1, angiotensine II, pochette de liaison, SCAM, sélectivité fonctionnelle. v

6 vi Table des matières Résumé... iv Liste des figures... ix Liste des tableaux... xi Liste des abréviations... xii Introduction... 1 Les récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs)... 1 Système rénine-angiotensine (RAS)... 2 Effets physiologiques de l Ang II:... 3 Récepteurs de l Ang II :... 4 Structure générale du récepteur AT 1 de l Ang II... 4 Nomenclature des résidus situés dans TM... 5 Ang II... 6 Structure du récepteur AT 1 de l Ang II... 6 Pochette de liaison du récepteur AT Méthode SCAM : identification de la pochette de liaison du récepteur AT Utilisation du SCAM afin de délimiter la pochette de liaison des GPCRs... 9 État basal versus état actif du récepteur Activation constitutive du récepteur AT Activation des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) Mécanisme moléculaires impliqués dans l activation des GPCRs Mécanisme d activation du récepteur AT 1 de l Ang II Sélectivité fonctionnelle Concept de sélectivité fonctionnelle Pourquoi faire des études de sélectivité fonctionnelle? La signalisation du récepteur AT Voies de signalisation impliquées dans l activité du récepteur AT Activation de la voie de MAPK/ERK par le récepteur AT Méthodes utilisés pour mesurer l activation de différentes voies de signalisation Production des inositols phosphates Activation de la voie des ERKs Recrutement de l arrestine et l activation de la voie G Calcul du biais de signalisation Importance de la sélectivité fonctionnelle du récepteur AT vi

7 vii Problématique Objectifs Article The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral pivoting movement during the process of receptor activation Résumé Introduction EXPERIMENTAL PROCEDURES RESULTS DISCUSSION FOOTNOTES REFERENCES Article The fifth transmembrane domain of angiotensin II Type 1 receptor participates in the formation of the ligand-binding pocket and undergoes a counterclockwise rotation upon receptor activation Résumé INTRODUCTION EXPERIMENTAL PROCEDURES RESULTS DISCUSSION REFERENCES Article Characterization of Angiotensin II molecular determinants involved in AT 1 receptor functional selectivity Résumé INTRODUCTION MATERIALS AND METHODS RESULTS DISCUSSION REFERENCES TABLES vii

8 viii Discussion CONCLUSIONS Liste des références viii

9 ix LISTE DES FIGURES INTRODUCTION Figure 1 Le système rénine-angiotensine 3 Figure 2 Représentation schématique du récepteur AT Figure 3 Arrangement des domaines transmembranaires autour de la pochette de liaison du récepteur AT Figure 4 Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM) Figure 5 Sélectivité fonctionnelle Figure 6 Les différentes voies de signalisation du récepteur AT ARTICLE 1 Figure 1 Schematic representation of the human AT 1 receptor Figure 2 MTSEA treatment of the wild-type AT 1 receptor and sensitive reporter cysteinebearing mutant receptors Figure 3 Effects of MTSEA on different mutant AT 1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD Figure 4 MTSEA treatment of the N111G-AT 1 receptor and sensitive reporter cysteinebearing mutant N111G-AT 1 receptors Figure 5 Effect of MTSEA on different mutant N111G-AT 1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD Figure 6 [Sar 1,Ile 8 ]Ang II protection of MTSEA-sensitive mutant receptors Figure 7 Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild type and mutant AT 1 receptors Figure 8 Helical wheel representation of TMD2 reporter cysteines and their pattern of reactivity to MTSEA ARTICLE 2 Figure 1 Schematic representation of the human AT 1 receptor ix

10 x Figure 2 MTSEA treatment of the wild-type AT 1 receptor and sensitive reporter cysteinebearing mutant receptors Figure 3 Effects of MTSEA on mutant AT 1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD Figure 4 MTSEA treatment of the N111G-AT 1 receptor and sensitive reporter cysteinebearing mutant N111G-AT 1 receptors Figure 5 Effect of MTSEA on N111G-AT 1 mutant receptors bearing a reporter cysteine in TMD Figure 6 [Sar 1,Ile 8 ]Ang II protection of MTSEA-sensitive mutant receptors Figure 7 Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild-type (WT) and mutant AT 1 receptors Figure 8 Helical wheel representation of TMD5 reporter cysteines and their pattern of reactivity to MTSEA ARTICLE 3 Figure 1 Inositol1-phosphate production induced by Ang II analogs 81 Figure 2 βarrestin1 recrutement to the AT 1 receptor by Ang II analogs Figure 3 βarrestin2 recrutement to the AT 1 receptor by Ang II analogs Figure 4 G 12 activation by Ang II analogs.87 Figure 5 Ang II induced ERK activation Figure 6 EGFR-dependent ERK activation by Ang II analogs Figure 7 PKC-dependent ERK activation by Ang II analogs Figure 8 Atypical PKC-dependent ERK activation Figure 9 Effects of AngII analogs on AT 1 signalling pathways x

11 xi LISTE DES TABLEAUX ARTICLE 1 Tableau 1 Binding Properties of [Sar 1,Ile 8 ]Ang II to cysteine-substitued hat 1 mutant receptors...29 Tableau 2 Binding Properties of [Sar 1,Ile 8 ]Ang II to cysteine-substitued hat 1 mutant receptors bearing the N111G mutation.35 ARTICLE 2 Tableau 1 Binding Properties of [Sar 1,Ile 8 ] Ang II to Cysteine-Substitued hat 1 Mutant Receptors Tableau 2 Binding Properties of [Sar 1,Ile 8 ] Ang II to Cysteine-Substitued hat 1 Mutant Receptors Bearing the Asn 111 Gly Mutation ARTICLE 3 Tableau 1 Binding Properties of AT 1 receptor ligands Tableau 2 Activation of Gq, βarrestin1, βarrestin2 and G 12 by AT 1 receptor ligands.108 Tableau 3 Activation of Gq, PKC-ERK and EGFR-ERK by AT 1 receptor ligands Tableau 4 Transduction ratios of AT1 receptor ligands Tableau 5 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position Tableau 6 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position Tableau 7 Biais factor of AT1 receptor ligands modified at position xi

12 xii LISTE DES ABRÉVIATIONS AT 1 AT 2 Ang II Ang III Ang IV AMPc ACE Bpa Ca 2+ CAM Cys DAG EGF EGFR ERK1/2 GDP GPCR GRK GTP JAK JNK3 IP 3 IP 3 R PDGF PIP 2 PKC RAF IGFR PIP 2 Récepteur à l angiotensine II type 1 Récepteur à l angiotensine II type 2 angiotensine II angiotensine III angiotensine IV adénosine monophosphate 3', 5'-cyclique enzyme de conversion de l angiotensine II para-benzoyl-l-phenylalanine calcium mutant constitutivement actif cystéine Diacylglycérol Facteur de croissance épidermique Récepteur du facteur de croissance épidermique Extracellular signal-regulated kinases Guanosine diphosphate Récepteur couplé à une protéine G Kinase des récepteurs couplés à une protéine G Guanosine triphosphate Janus kinase c-jun N-terminal kinase inositol 1,4, 5-trisphosphate Récepteur à inositol 1,4, 5-trisphosphate platelet-derived growth factor phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate protéine kinase C RAF kinase insulin-like growth factor 1 receptor phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate xii

13 xiii PKC PLC MAPK MEK MMP MPA MTS MTSEA MTSES TM SCAM Src protéine kinase C phospholipase C mitogen-activated kinase MAP kinase kinase métalloprotéinase methionine proximity assay méthanethiosulfonate méthanethiosulfonate-ethylammonium méthanethiosulfonate-éthylsulfonate domaine transmembranaire substituted cysteine accessibility method proto-oncogene tyrosine-protein kinase xiii

14 1 INTRODUCTION Les récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) Les récepteurs situés à la surface cellulaire permettent de capter un stimulus venant de l extérieur afin de le traduire en une réponse appropriée à l intérieur de la cellule. Il existe quatre grandes catégories de récepteurs : les récepteurs nucléaires, les récepteurs canaux, les récepteurs à activité enzymatique et les récepteurs couplés à une protéine G. Les récepteurs couplés à une protéine G sont les protéines transmembranaires les plus nombreuses et les plus diversifiées impliquées dans la transduction du signal intracellulaire. Plus de 2% des gènes de notre organisme codent pour des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs). Les GPCRs sont impliqués dans l homéostasie de divers systèmes. Ces récepteurs sont impliqués dans le contrôle d une multitude de processus biologiques (vision, métabolisme, neurotransmission, olfaction, réponse immunitaire, réponse inflammatoire) et pathophysiologiques (maladies cardiovasculaires, cancer, diabète). Ils représentent donc des cibles très intéressantes pour le traitement de différentes maladies telles que les maladies cardiaques, certains désordres inflammatoires et autres (Lebon and Tate, 2012). Aujourd hui, les GPCRs représentent la cible la plus importante de tous les médicaments sur le marché. Environ 40% des médicaments actuellement disponibles sur le marché ont leurs effets thérapeutiques via un ou des GPCRs (Ma and Zemmel, 2002), d où l importance de bien comprendre leur structure et leur activation. Des stimuli de nature très variée peuvent activer les GPCR (photons, ions, amines, acides aminés, peptides, protéines, lipides, nucléotides, glycoprotéines et phospholipides) (Kroeze, et al., 2003). L unité de signalisation de base d un GPCR comprend un récepteur, une protéine G hétérotrimérique et un effecteur. Suite à la liaison du ligand, le GPCR subit un changement conformationnel qui permet l activation de la protéine G. Les GPCRs doivent leur nom à leur mécanisme de transduction le mieux connu, soit l activation de protéines G hétérotrimériques. Les protéines G hétérotrimériques servent d intermédiaires dans l activation d effecteurs à l intérieur de la cellule tels que les enzymes, les canaux ioniques et autres. Les protéines G sont composés de trois sous-unités, soit la sous-unité Gα, Gβ et Gγ. Les sous-unités Gβ et Gγ forment un dimère stable. Suite à l activation, les GPCRs catalysent l échange d une molécule de GDP pour une molécule de GTP à l intérieur de la sous-unité Gα de la protéine G. Cet 1

15 2 échange cause l activation et la dissociation de la sous-unité Gα du dimère Gβγ. Après dissociation, Gα et Gβγ peuvent chacune activer leurs effecteurs respectifs (Pierce, et al., 2002). On peut classer la protéine Gα en fonction de sa capacité à activer certaines voies de signalisation. Par exemple, la protéine Gα s active l adenylate cyclase, et favorise l augmentation de l AMP cyclique. À l inverse, la protéine Gα i inhibe l adénylate cyclase et cause une baisse de l AMP cyclique. La protéine Gα q active la phospholipase C (PLCβ) qui clive le phosphatidyl inositol 4,5-biphosphate (PIP 2 ) en diacylglycérol et en inositol 1,4,5- triphosphate (IP 3 ). La protéine Gα 12 13, quant à elle, active la Rho kinase impliquée dans la réorganisation du cytosquelette (Pierce, et al., 2002). Même si les protéines G sont responsables de la majorité des effets suite à l activation des GPCRs, il est bien connu que les GPCRs sont capables d activer d autres voies de signalisation indépendantes de la protéine G (Kenakin, 2011) telles que le recrutement d arrestine, la transactivation du récepteur de l EGF, ainsi que l activation de certaines kinases (Src). Système rénine-angiotensine (RAS) Le récepteur de l Ang II (récepteur AT 1 ) est un GPCR et il constitue l élément central du système rénine-angiotensine. Le système rénine-angiotensine joue un rôle clé dans la régulation de la pression artérielle. Suite à une baisse de la concentration de sodium, ou à une baisse du volume sanguin ou encore à une baisse de la pression artérielle, les reins sécrètent la rénine. La rénine est une enzyme qui clive son unique substrat, l angiotensinogène, une protéine plasmatique produite par le foie. Le clivage de l angiotensinogène produit l angiotensine I (Ang I), un décapeptide qui ne possède aucune fonction biologique connue mais qui est converti en Ang II) par l enzyme de conversion de l angiotensine (ACE). L Ang II est la molécule active du système rénine-angiotensine; c est l agoniste du récepteur AT 1 (figure 1). L Ang II a une demi-vie très courte et elle est rapidement métabolisée en angiotensine III (Ang III) par l aminopeptidase A et cette dernière en angiotensine IV (Ang IV) par l aminopeptidase N (Hunyady and Catt, 2006). 2

16 3 FIGURE 1. Le système rénine-angiotensine. Représentation schématique de la production de l angiotensine II et ses effets physiologiques. Effets physiologiques de l Ang II: L Ang II favorise une élévation de la pression artérielle par une variété d actions. Elle stimule la sécrétion d aldostérone par le cortex de la glande surrénale qui favorise la réabsorption de sodium (Na + ) et de l eau par le tubule rénal. L Ang II est aussi un puissant vasoconstricteur qui augmente la résistance vasculaire périphérique. De plus, l Ang II stimule la croissance et la prolifération cellulaire. Également, l Ang II favorise la sécrétion de la vasopressine afin d augmenter la réabsorption d eau. L Ang II agit aussi dans le cerveau, pour augmenter la soif pour favoriser l absorption d eau, ce qui augmente le volume sanguin et par conséquent augmente la pression artérielle (de Gasparo, et al., 2000; Bader, 2010). Afin de réduire les effets physiologiques de l Ang II, il existe plusieurs classes de médicaments sur le marché. Les inhibiteurs d ACE bloquent l enzyme de conversion et empêchent la production d Ang II, abolissant ses principales fonctions : la vasoconstriction et la libération d aldostérone. Ce type de médicament est utilisé pour traiter l hypertension artérielle et l insuffisance cardiaque et le premier inhibiteur de cette classe a été le captopril. Il existe aussi des antagonistes du récepteur AT 1 qui bloquent son activation par l Ang II. Les 3

17 4 antagonistes du récepteur AT 1 tel que le losartan agissent en diminuant l effet vasoconstricteur et l effet mitogènique de l Ang II. Enfin, les inhibiteurs de la rénine empêchent la formation de l Ang I à partir de l angiotensinogène. L aliskiren est un exemple de la nouvelle génération d inhibiteurs de la rénine qui sont utilisés en clinique et qui peuvent être administrés par la voie orale (Burnier, 2001; Paulis and Unger, 2010). Récepteurs de l Ang II : Deux types de récepteurs ont été identifiés pour l Ang II : le récepteur AT 1 et le récepteur AT 2 (de Gasparo, et al., 2000). Le récepteur AT 2 est composé de 363 acides aminés et possède une homologie de séquence de 34 % avec le récepteur AT 1. Il s exprime surtout durant la vie fœtale. Le rôle physiologique du récepteur AT 2 est encore relativement obscur bien que certaines études suggèrent que ce récepteur aurait des actions d antagoniste physiologique du récepteur AT 1, ayant des effets antiprolifératifs et pro-apoptotiques (Steckelings, et al., 2005). La majorité des effets physiologiques connus de l Ang II passent par le récepteur AT 1 (Burnier, 2001; Miura, et al., 2003a). Structure générale du récepteur AT 1 de l Ang II Le récepteur AT 1 est présent dans plusieurs organes tels que le foie, la glande surrénale, le cerveau, les poumons, le rein, le cœur et les vaisseaux sanguins. Composé de 359 acides aminés, le récepteur AT 1 fait partie de la classe A des GPCRs, ayant une forte homologie avec le récepteur de la rhodopsine. Ce récepteur comme tous les autres GPCRs est composé de sept domaines transmembranaires α-hélicaux (TM) ainsi que d un domaine N-terminal extracellulaire et un domaine C-terminal intracellulaire. Le domaine extracellulaire de l AT 1 se caractérise par la présence de trois sites consensus de glycosylation (Asn4, Asn176, Asn188) ainsi que quatre résidus cystéine impliqués dans la formation de deux ponts disulfures essentiels pour la liaison de l Ang II (figure 2) (Yamano, et al., 1992; Lanctot, et al., 1999; Lanctot, et al., 2005). Le domaine intracellulaire quant à lui est composé de 3 boucles intracellulaires et d une queue C-terminale. Il contient plusieurs résidus sérine/thréonine pouvant être phosphorylés par les kinases de récepteurs couplés à une protéine G (GRK) afin de recruter l arrestine et initier le processus de désensibilisation et d internalisation du récepteur (Mehta and Griendling, 2007). 4

18 5 Nomenclature des résidus situés dans TM Pour faciliter la comparaison des résidus situés dans les domaines transmembranaires (TM) de différentes GPCR de la classe A, plusieurs nomenclatures ont été proposées. Dans cette thèse, j ai retenu la nomenclature de Ballesteros et Weinstein (Ballesteros, J.A. 1995). La nomenclature est basée sur le fait que dans chaque TM le résidu le plus hautement conservé est désigné le résidu X.50 où X représente le numéro du TM. Les autres résidus sont numérotés relativement à leur position par rapport au résidu le plus conservés. Par exemple, le résidu le plus hautement conservé dans le 2 e TM est un aspartate qu on va désigner Asp- 74 (2.50). Le résidu situé avant l aspartate est une alanine qui sera donc identifié comme Ala- 73 (2.49). Par contre, le résidu situé après l aspartate 74 est une leucine et sera désigné en tant que Leu-75 (2.51). FIGURE 2 : Représentation schématique du récepteur AT 1. Les numéros indiquent les positions des résidus dans le récepteur. Les cercles gris représentent les cystéines qui forment les ponts disulfures et les cercles noirs représentent les cystéines qui ne sont pas impliquées dans la formation de ponts disulfures. Les sites de glycosylation potentiels (Asn-4, Asn-176 et Asn-188) sont aussi identifiés. L Asn-111 dans le TM3 est aussi indiquée en gris. 5

19 6 Ang II L octapeptide Ang II (Asp 1 -Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe 8 ) est le médiateur principal du système rénine-angiotensine (de Gasparo, et al., 2000). Les différentes études effectuées in vivo et in vitro avec les analogues de l Ang II ont permis de déterminer les résidus impliqués dans la liaison et dans l activation du récepteur AT 1 (Khosla, et al., 1974; Regoli, et al., 1974). L activité biologique de l Ang II dépend en grande partie du résidu aromatique Phe 8 et de son carboxylate dans la partie C-terminale du peptide (de Gasparo, et al., 2000). Les chaines latérales aromatiques en position 4 et 6 (Tyr 4 et His 6 ) semblent également impliquées dans l activation du récepteur (Khosla, et al., 1974). Par exemple, en remplaçant les résidus aromatiques Tyr 4 et Phe 8 par des résidus aliphatiques, on génère des antagonistes du récepteur AT 1. Il faut cependant mentionner que le résidu Tyr-4 cause principalement une importante baisse d affinité pour le récepteur, ce qui le rend moins intéressant du point de vue structure-fonction (Guillemette, et al., 84). Les résidus situés dans la partie N-terminale sont importants pour la liaison au récepteur ainsi que pour la durée d action du ligand. L Ang III (Ang-2-8) formée par la délétion de l aspartate en position 1 est aussi puissante que l Ang II. L Ang IV (Ang-3-8) garde une faible activité biologique et se comporte comme un agoniste partiel ayant une faible affinité pour le récepteur AT 1 (de Gasparo, et al., 2000). Structure du récepteur AT 1 de l Ang II Pochette de liaison du récepteur AT 1 Les GPCRs de la classe A possèdent une cavité hydrophile au centre de la protéine appelée la pochette de liaison. La pochette de liaison est délimitée par les sept domaines transmembranaires et sert à accommoder le ligand au sein du récepteur (voir figure 3). Il est connu que dans le cas des GPCRs ayant des ligands plus volumineux comme les peptides (Ang II), le site de liaison se situe en partie dans les domaines transmembranaires et en partie dans les régions extracellulaires (Schwartz, et al., 2006). Différentes études utilisant des analogues de l Ang II en combinaison avec de la mutagénèse dirigée ont permis l identification des déterminants moléculaires importants pour la liaison de l Ang II. Les acides aminés essentiels à la liaison de l Ang II incluent les résidus cystéines qui forment les ponts disulfures ainsi que plusieurs autres résidus situés dans la partie supérieure du récepteur. Par exemple, les résidus chargés situés dans les domaines transmembranaires, tels que la Lys-102 (3.26) dans le haut du TM3 ainsi que la Lys-199 (5.42) 6

20 7 dans le haut du TM5, participent à la liaison du peptide (Yamano, et al., 1995; de Gasparo, et al., 2000). Initialement, on a formulé l hypothèse selon laquelle le groupement carboxyle en C- terminal de l Ang II, de même que les chaines latérales Arg 2, Tyr 4 et His 6 sont importants pour la liaison et l activité du peptide (Khosla, et al., 1974; Hsieh and Marshall, 1986). Il a été également démontré que le groupement C-terminal de la Phe 8 forme une liaison ionique avec la chaine latérale du résidu Lys-199 (5.42) du récepteur AT 1 (Monnot, et al., 1996), alors que la chaine latérale de la Tyr 4 du peptide lierait le résidu N111 du récepteur AT 1 (Feng, et al., 1998). De plus, les chaines latérales des résidus His 6 et Phe 8 de l Ang II se retrouvent à proximité des résidus His-256 (6.51) et Phe-259 (6.54) du récepteur AT 1 (Noda, et al., 1995). Des études de marquage par photoaffinité ont permis d identifier de façon plus directe les points de contact entre l Ang II et son récepteur. Notamment, l Asp 1 du ligand entre en contact avec la 2 ième boucle extracellulaire du récepteur AT 1 (Laporte, et al., 1999), alors que la Val 3 de l Ang II est à proximité du résidu Ile-172 dans la 2 ième boucle extracellulaire (Boucard, et al., 2000), et que la Phe 8 de l AngII est à proximité des résidus Phe-293 (7.44) et Asn-294 (7.45) situé dans le 7 ième domaine transmembranaire (Perodin, et al., 2002). Avec une autre approche de photomarquage par affinité qui exploite la préférence marquée du groupement photosensible para-benzoyl-l-phenylalanine (Bpa) pour le résidu méthionine (Methionine Proximity Assay (MPA)), tous les résidus qui sont à une proximité de 8Å de la position 8 de l Ang II et qui sont donc situés dans la pochette de liaison du récepteur AT 1 ont été identifiés (Clement, et al., 2005; Clement, et al., 2009; Fillion, et al., 2009; Fillion, et al., 2010; Fillion, et al., 2013). Parmi ces résidus, on retrouve Phe77 (2.53) situé dans 2 e domaine transmembranaire, Leu112 (3.36), Tyr113 (3.37) situés dans 3 e domaine transmembranaire, Asn200 (5.43) dans 5 e domaine transmembranaire, Phe249 (6.44), Trp253 (6.48), His256 (6.51),Thr260 (6.55) situés dans 6 e domaine transmembranaire, Phe293 (7.44), Asn294 (7.45), Asn295 (7.46), Cys296 (7.47) et Leu297 (7.48) situés dans 7 e domaine transmembranaire (Fillion, et al., 2010). En ce qui concerne le récepteur AT 1, on peut déduire que l Ang II est capable de pénétrer profondément dans la pochette de liaison constituée à la fois des domaines transmembranaires et des domaines extracellulaires. 7

21 8 FIGURE 3 : Pochette de liaison du récepteur AT 1 : Arrangement des domaines transmembranaires autour de la pochette de liaison du récepteur AT 1. Méthode SCAM : identification de la pochette de liaison du récepteur AT 1 L acide aminé cystéine qui possède un souffre dans sa chaîne latérale est souvent utilisé pour étudier les relations entre la structure et la fonction d une protéine. En effet, la cystéine est capable de former un lien disulfure avec toute autre molécule possédant un groupement thiol libre. Cette propriété peut être exploitée pour modifier les cibles de façon covalente, ce qui a mené au développement des agents capables de réagir spécifiquement avec les cystéines. La cystéine demeure un bon choix pour substituer un résidu natif dans une protéine puisque sa taille est intermédiaire et elle n a pas tendance à former des structures secondaires et donc ne change pas la structure globale de la protéine. Ainsi, Roberts et collaborateurs (Roberts, et al., 1986) ont développé des composés méthanthiosulfonates (MTS), hautement séléctifs au groupement thiol permettant de modifier de façon spécifique les cystéines. Il existe des MTS contenant un groupement éthylammonium (MTSEA) ou éthylsulfonate chargé négativement (MTSES). Ces composés peuvent modifier des protéines (cibles) contenant des cystéines pour y introduire une charge, ainsi qu un certain encombrement stérique. L approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) consiste à remplacer tous les acides aminés, un à la fois, par une cystéine et ensuite d évaluer l effet d un MTS sur les propriétés de liaison du récepteur mutant. Dans un premier temps, le SCAM a été utilisé pour caractériser les canaux ioniques (Akabas, et al., 1992). Les résidus constituant le pore du canal forment une pochette 8

22 9 hydrophile par laquelle passent les ions et ainsi la modification de ces résidus par un composé MTS bloque l accès aux ions, modifiant ainsi la fonctionnalité du canal. En absence de modification des propriétés fonctionnelles, il y a deux explications possibles : soit la cystéine introduite n a pas pu réagir avec le réactif MTS, soit la modification de la cystéine ne cause pas de changement détectable de la fonctionnalité de la protéine. Utilisation du SCAM afin de délimiter la pochette de liaison des GPCRs Afin de mieux comprendre les propriétés moléculaires du récepteur AT 1, nous avons utilisé l approche SCAM (Akabas, et al., 1992; Javitch, et al., 1994; Javitch, et al., 1995) qui permet d identifier les acides aminés faisant partie de la pochette de liaison du récepteur en plus de déterminer l orientation des domaines transmembranaires lors de l activation du récepteur. Cette approche est basée sur la réactivité de dérivés des méthanethiosulfonates (MTS) ayant une spécificité pour les groupements sulfhydryls des cystéines (Cys). Parmi les différents MTS disponibles sur le marché, le MTSEA (2-aminoethyl méthanethiosulfonates) est un réactif chargé et hydrophile. Il réagit un milliard de fois plus rapidement avec les thiols ionisés (RS ) qu avec les thiols non-ionisés (RSH). Ainsi, seulement les cystéines présentes dans le compartiment aqueux sont ionisées et peuvent réagir avec le MTSEA. La méthode de SCAM consiste à vérifier l accessibilité du ligand dans la pochette de liaison suite à la réaction entre le réactif MTS et les cystéines introduites de façon systématique par mutagénèse dirigée dans les domaines transmembranaires. La première étape consiste donc à remplacer de façon successive un par un chacun des résidus dans un domaine transmembranaire par une cystéine. Ces récepteurs mutants sont par la suite traités avec le réactif MTSEA et leur propriété de liaison est évaluée. La cystéine située dans la pochette de liaison sera alkylée par le MTSEA, causant ainsi l encombrement stérique qui interférera avec la liaison du ligand (figure 4). Par contre, si l alkylation n affecte pas les propriétés de liaison du récepteur mutant, on déduit que la cystéine substituante n est pas située dans la pochette de liaison. 9

23 10 FIGURE 4 : Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM). Le MTSEA réagit spécifiquement avec les cystéines libres. Il réagit un milliard de fois plus rapidement avec les thiols ionisés (RS-) qu avec les thiols non-ionisés (RSH). Ainsi, seulement les cystéines dans le compartiment aqueux sont ionisées et réagiront avec le MTSEA. La cystéine située dans la pochette de liaison sera alkylée par le MTSEA, causant ainsi un encombrement stérique qui interférera avec la liaison du ligand. État basal versus état actif du récepteur Les GPCRs sont des protéines dynamiques capables de transition entre de multiples conformations (Lefkowitz, 2007). Ces diverses conformations sont en équilibre dynamique avec les effecteurs intracellulaires et les ligands extracellulaires. Le modèle ternaire cubique a été formulé pour décrire l interaction dynamique entre le récepteur, son ligand et sa protéine G effectrice (Schwartz, et al., 2006). De façon générale, la forme basale d un GPCR est la plus énergétiquement favorable en absence de ligand. La liaison d un agoniste complet stabilise une conformation active du récepteur, (augmente la population des récepteurs de conformation active aux dépens de la population étant dans la conformation inactive) ce qui augmente l affinité du récepteur pour 10

24 11 une protéine effectrice intracellulaire et mène à une signalisation maximale. Pour leur part, les agonistes partiels stabilisent une conformation active du récepteur de façon moins efficace que les agonistes complets, sans toutefois produire une réponse maximale. Les antagonistes neutres occupent le site de liaison du récepteur, mais n ont aucune influence sur l adoption des diverses conformations du récepteur. En fait, les antagonistes ne font que bloquer l accès de l agoniste au récepteur. Les agonistes inverses stabilisent la conformation inactive du récepteur. La notion de l agoniste inverse a été proposée récemment, suite à la découverte de l activité constitutive de certains récepteurs, qui peuvent donc adopter une conformation active en absence d agoniste (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002). En absence du ligand, la majorité des GPCRs possèdent un faible niveau d activité constitutive (Seifert and Wenzel-Seifert, 2002) (une sous-population des récepteurs ayant assez d énergie pour être dans leur conformation active). Certaines mutations peuvent déstabiliser la forme inactive d un GPCR et favoriser les conformations plus actives : ce sont des mutants constitutivement actifs (CAM). Les CAM favorisent le déplacement de l état inactif vers l état actif des GPCRs et par ce fait, offrent un précieux outil dans l identification des résidus impliqués dans l activation des GPCRs. En plus des résidus identifiés à l aide des mutants constitutivement actifs (CAM), on croit que les résidus hautement conservés dans les GPCRs jouent un rôle essentiel dans le mécanisme d activation (Gether and Kobilka, 1998). Dans les études visant à identifier et caractériser les mouvements des domaines transmembranaires qui accompagnent l activation d un GPCR, il est nécessaire de discriminer entre les conformations basales et actives du récepteur. Dans le cas du récepteur AT 1, l utilisation du mutant constitutivement actif s avère donc très appropriée pour représenter la conformation active du récepteur, alors que l utilisation du récepteur de type sauvage est un bon modèle de la conformation basale. Activation constitutive du récepteur AT 1 La découverte d une activité constitutive chez certains GPCRs qui peuvent activer leur protéine G en absence d agoniste fut une avancée importante. Il est connu que certaines mutations favorisent l augmentation de l activité constitutive. Le récepteur AT 1 fait partie d un large groupe de GPCRs démontrant une certaine activité constitutive. Une légère activité constitutive du récepteur AT 1 a été observée lors de sa surexpression dans les cellules COS-1, causant ainsi une augmentation de l activité basale de la PLCβ (Noda, et al., 1996). Ensuite, d autres études indépendantes ont elles aussi démontré une importante augmentation de l activité constitutive du récepteur AT 1 lorsque le 11

25 12 résidu Asn111 (3.35) situé dans le 3 e domaine transmembranaire est remplacé par des résidus moins encombrants tels que l alanine ou la glycine (Noda, et al., 1996; Balmforth, et al., 1997; Groblewski, et al., 1997). Il a été suggéré que les GPCRs dans leur état basal sont contraints dans une conformation inactive favorisé par certaines interactions intramoléculaires. Suite à la liaison d un agoniste ou sous la présence d une mutation spécifique, cette contrainte est libérée ce qui favorise la conformation active d un récepteur. Il est bien connu que le résidu Asn-111 est hautement mais non strictement conservé dans la classe A des GPCRs. Activation des récepteurs couplés à une protéine G (GPCRs) Mécanisme moléculaires impliqués dans l activation des GPCRs Afin de propager un signal vers l intérieur de la cellule, un GPCR doit adopter une conformation active. Dans le modèle le plus simple de l activation des GPCRs, un ligand agoniste complet stabilise une conformation active du récepteur, ce qui augmente l affinité de ce dernier pour un ou des effecteurs intracellulaires et mène à une signalisation maximale. Les GPCRs possèdent tous une structure commune dictée par l arrangement des sept domaines transmembranaires dans la membrane plasmique (Palczewski, et al., 2000; Park, et al., 2008; Rasmussen, et al., 2007; Rasmussen, et al., 2011). Plusieurs résidus et motifs (D/ERY, NPxxY) conservés pour les GPCRs de la classe A ont été impliqués dans leur processus d activation (Katritch, et al., 2013; Rosenbaum, et al., 2009). L ensemble des informations disponibles suggère que tous les GPCRs pourraient partager un mécanisme d activation commun (Rosenbaum, et al., 2009). En dépit de toutes les informations disponibles, il reste encore beaucoup de travail à effectuer afin de déterminer les différentes conformations qu adoptent les GPCRs au cours de leur transition de l état inactivé à l état activé. Mécanisme d activation du récepteur AT 1 de l Ang II Chez plusieurs GPCRs, une étape clé de l activation est un éloignement entre le TM3 et le TM6 du côté cytoplasmique du récepteur (Gether, et al., 1997; Ballesteros, et al., 2001). Si on bloque ce mouvement, on empêche l activation de la protéine G. Dans le cas du récepteur AT 1, il y a des évidences qui montrent qu une interaction forte entre le résidu Tyr-113 (3.37) situé dans le 3 e domaine transmembranaire et His-256 (6.51) situé dans le 6 e domaine transmembranaire favorise l état inactif du récepteur et empêche l activation de la protéine G q 12

26 13 (production des inositols phosphates) (Miura, et al., 2006). Il a été démontré qu un mouvement vers l extérieur du côté cytoplasmique du 6 e domaine transmembranaire favorise la flexibilité de la 3 e boucle intracellulaire, ce qui favorise l adoption d une conformation active, présentant un lieu d ancrage pour la protéine G (Martin, et al., 2007; Conchon, et al., 1997). Il existe différents motifs impliqués dans l activation des GPCRs. Un de ces motifs, le motif D/ERY est celui qui a été le plus étudié. Les trois résidus composant ce motif sont une Asp ou un Glu en position 3.49, une arginine en position 3.50 et une tyrosine en position Ce motif est situé sur le côté cytoplasmique du 3 e domaine transmembranaire, à l interface de la 2 e boucle intracellulaire. Plusieurs études montrent que ce motif joue un rôle central dans la régulation de l état conformationnel des GPCRs. L arginine (3.50) est impliquée dans une interaction ionique avec l aspartate (3.49) adjacente ainsi qu avec un résidu chargé situé en position 6.30 dans le TM6 afin de former ce qu on appelle la serrure ionique («ionic lock»). L interaction intramoléculaire entre ces 3 résidus serait importante pour le maintien du récepteur dans sa forme inactive et cette interaction doit être brisée lors de l activation. Les structures cristallines de la rhodopsine (Palczewski, et al., 2000) ainsi que du récepteur β 2 - adrénergique (Yao, et al., 2006) semblent appuyer cette hypothèse. Dans le cas du récepteur AT 1, il n y a pas de résidu chargé négativement à la position 6.30 mais le motif DRY semble jouer un rôle dans l activation de la protéine G et dans le recrutement de l arrestine. Par exemple, en substituant l aspartate (3.49) par des résidus plus petits (alanine ou glycine), on empêche l activation de la protéine G mais on permet encore une signalisation indépendante de la protéine G (Wei, et al., 2003; Seta, et al., 2002; Gaborik, et al., 2003). Des études suggèrent que lors de l activation du récepteur de l urotensine, les résidus du motif DRY sont impliqués dans une interaction directe avec la protéine G. En effet, une mutation à l intérieur du motif DRY conduit souvent à une forme inactivable du récepteur par rapport à la protéine G (Proulx, et al., 2008). Un autre motif impliqué dans l activation des GPCRs est le motif NPxxY situé dans le 7 e domaine transmembranaire. Il a été suggéré que ce motif joue le rôle d un interrupteur moléculaire qui serait important dans la transition du récepteur de la conformation basale vers la conformation active. Selon cette hypothèse, le résidu Asn (7.49) est orienté vers le 6 e domaine transmembranaire dans la conformation inactive du récepteur et suite à l activation, ce résidu se réoriente de façon à interagir avec l Asp-74 (2.50) du 2 e domaine transmembranaire. Plusieurs études montrent l importance de l Asp-74 (2.50) (Bihoreau, et al., 1993) ainsi que de plusieurs autres résidus situés dans le 7 e domaine transmembranaire (Tyr-292 (7.43), Asn- 13

27 (7.45), Asn-298 (7.49), Tyr-302 (7.52) ) (Perodin, et al., 2002; Clement, et al., 2005; Balmforth, et al., 1997; Miura, et al., 2003b; Laporte, et al., 1996) pour l activation du récepteur AT 1. L activation du récepteur AT 1 dans cette section fait référence à l activation du récepteur via la protéine G mais récemment il a été mis en évidence que le récepteur AT 1 est également capable d activer des voies de signalisation indépendantes de la protéine G, d où l importance du concept de sélectivité fonctionnelle. Sélectivité fonctionnelle Concept de sélectivité fonctionnelle L interaction d un ligand avec un récepteur est l un des fondements de la pharmacologie. Cette interaction (ligand-récepteur) est à l origine des principaux paramètres pharmacologiques que sont la capacité du ligand à lier le récepteur (affinité) et la capacité à produire la réponse biologique (efficacité). Jusqu à tout récemment, on évaluait l efficacité d un récepteur par sa capacité à activer une seule voie de signalisation. Il est maintenant bien connu que le récepteur AT 1 active plusieurs voies de signalisation en interagissant avec différents effecteurs responsables de la variété d actions de l Ang II. Il est donc logique de penser que divers ligands peuvent induire une variété de conformations d un GPCR et ainsi inhiber ou activer plus ou moins sélectivement les diverses voies de signalisation en aval du récepteur. C est le concept de sélectivité fonctionnelle (Galandrin, et al., 2007)(Kenakin, 2011; Violin and Lefkowitz, 2007; Rajagopal, et al., 2010) (Figure 5). Par exemple, une certaine conformation du récepteur peut coupler plus efficacement à une voie de signalisation X et moins bien à la voie Y. À l inverse, une autre conformation adoptée par le récepteur activera plus efficacement la voie Y et moins bien la voie X. 14

28 15 FIGURE 5 : Sélectivité fonctionnelle. Représentation schématique de divers ligands pouvant induire diverses conformations d un même récepteur et pouvant activer ainsi diverses voies de signalisation engendrant différentes conséquences fonctionnelles. Pourquoi faire des études de sélectivité fonctionnelle? L importance de la sélectivité fonctionnelle est qu elle permet de concevoir des ligands plus sélectifs qui favoriseront un effet voulu au détriment des effets indésirables. La sélectivité fonctionnelle trouve son importance dans le développement des nouveaux médicaments que l on veut plus sélectifs. Comment y parvenir? En testant plusieurs ligands ayant une structure chimique différente, il sera possible de déterminer les voies d activation privilégiées par ces derniers. Dans un premier temps, à partir de ces données, il sera possible de tirer les conclusions sur l influence de la structure chimique des ligands sur la voie d activation privilégiée par le récepteur AT 1. Par la suite, en faisant du modelage moléculaire, il sera possible de déduire la conformation du récepteur efficace à activer l une ou l autre voie de signalisation. Finalement, l étape ultime sera de designer des super ligands agonistes ou antagonistes pour chacune des voies de signalisation. La signalisation du récepteur AT 1 Voies de signalisation impliquées dans l activité du récepteur AT 1 La voie de signalisation classique du récepteur AT 1 passe par la protéine G q qui active la phospholipase Cβ (PLCβ). La PLCβ hydrolyse le phosphatidyl inositol 4,5-bisphosphate (PIP 2 ) menant à la production de deux seconds messagers : l inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3 ) et le diacylglycérol (DAG) (Kojima, et al., 1984; Balla, et al., 1986). Ces seconds messagers 15

29 16 amplifient d autres cascades de signalisation. L IP 3 active un récepteur/canal, l IP 3 R, dans le réticulum endoplasmique et provoque une relâche du Ca 2+ intracellulaire (Ferris, et al., 1992). Le DAG active la protéine kinase C (PKC), une sérine/thréonine kinase qui phosphoryle des substrats dans la cellule et ainsi module leur activité (Kanashiro and Khalil, 1998). Les connaissances actuelles suggèrent que le récepteur AT 1 interagit aussi avec d autres protéines G hétérotrimériques telles que la protéine G i responsable de l inhibition de l adenylyl cyclase et la protéine G 12/13 impliquée dans le remodelage du cytosquelette (Hunyady and Catt, 2006b; Mehta and Griendling, 2007). L effet hypertrophique de l Ang II met en jeu l activation de plusieurs protéines kinases. L Ang II régule l activité des kinases de la famille JAK (Ali, et al., 1997; Ali, et al., 1998; Mascareno and Siddiqui, 2000) et de la famille Src (Seta, et al., 2002; Sayeski, et al., 1998; Sayeski and Ali, 2003). Les kinases de la famille JAK stimulent la phosphorylation et l activité de facteurs de transcription tels que les STATs (Signal Transducers and Activators of Transcription) (Liang, et al., 1999; McWhinney, et al., 1998). Les kinases de la famille Src (csrc) peuvent phosphoryler de nombreuses protéines et mener à l activation de MAP kinases (mitogen activated protein) telles que les ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases) (Seta, et al., 2002; Kim, et al., 2009). L Ang II est aussi capable de réguler l activité de certains récepteurs de facteurs de croissance (PDGF, EGFR, IGFR) (Mehta and Griendling, 2007; Heeneman, et al., 2000; Shah and Catt, 2003; Folli, et al., 1997). Le récepteur AT 1 serait également capable d activer des voies n impliquant pas les protéines G (figure 6). Par exemple, le récepteur AT 1 peut lier l arrestine, une protéine d échafaudage qui favorise la désensibilisation et l internalisation du récepteur via les puits tapissés de clathrine (Gaborik, et al., 2001; Hunyady, et al., 2000). En inhibant une voie de signalisation, l arrestine peut également en activer d autres. Par exemple, l arrestine permet la formation des complexes pouvant activer la voie des MAP kinases (JNK3 et ERK1/2) (Wei, et al., 2003; McDonald, et al., 2000; Wei, et al., 2004). En plus d activer les MAP kinases via les arrestines (Wei, et al., 2003), il est aussi connu que le récepteur AT 1 peut activer les MAP kinases via la protéine kinase C (Tian, et al., 1998) et via la transactivation du récepteur à l EGF (epidermal growth factor) (Shah, et al., 2004). 16

30 17 FIGURE 6 : Les différentes voies de signalisation du récepteur AT 1 : Récepteur AT 1 de l Ang II peut activer plus d une voie de signalisation en interagissant avec différents effecteurs. Récepteur AT 1 peut activer les voies de signalisation dépendante ou indépendante de la protéine G. Activation de la voie de MAPK/ERK par le récepteur AT 1 Les voies de signalisation impliquant les MAP kinases contrôlent des processus cellulaires importants tels que la croissance, la différenciation et la prolifération cellulaire. Ce sont des protéines kinases qui catalysent la phosphorylation d autres protéines (enzymes, facteurs de transcription) afin de les activer. L activation des MAP kinases se fait en cascade : la protéine sérine/thréonine MAPK kinase kinase (Raf) phosphoryle MAPK kinase (MEK1/2) et cette cascade de phosphorylation se poursuit par l activation des MAPK (ERK1/2) (Rozengurt, 2007). Comme déjà mentionné, le récepteur AT 1 peut activer les ERK1/2, une des voies des MAP kinases, de trois façons différentes : par une voie dépendante de la protéine G q et impliquant la protéine kinase C, par la transactivation du récepteur tyrosine kinase (EGFR) ou par une voie indépendante de la protéine G q et impliquant les arrestines. 17

31 18 L activation des ERK1/2 passant par la voie de la protéine G q met en jeu la PKC. Cette dernière est responsable de la phosphorylation de cibles en amont de la cascade de signalisation des ERK1/2. La PKC active une petite protéine G, la protéine Ras, qui interagit avec la kinase Raf initiant l activation de la cascade de signalisation impliquant Raf, Mek1/2 et ERK1/2 (Tian, et al., 1998). L activation de la voie des ERK1/2 n impliquant pas la protéine G passe par les arrestines. Les arrestines favorisent le recrutement des complexes protéiques menant vers l activation de MAP kinases (Wei, et al., 2003; Wei, et al., 2004). L Ang II peut aussi activer les ERK1/2 via la transactivation du récepteur de l EGFR. La transactivation de l EGFR est initiée par une augmentation du Ca 2+ intracellulaire, l activation de la PKC et de la kinase Src. Src active une métalloprotéinase (MMP) relâchant le ligand EGF (epidermal growth factor) lié à l héparine (HB-EGF). La liaison du ligand EGF entraîne un changement conformationnel de l EGFR et sa dimérisation. La dimérisation favorise une autophosphorylation au niveau des résidus tyrosine dans la queue cytoplasmique du récepteur. Cette phosphorylation crée des sites d ancrage pour d autres protéines adaptatrices possédant les domaines SH2, et recrute ensuite le complexe Shc-Grb2-Sos. Ceci permet l activation de la petite protéine G Ras menant à l activation des MAP kinases impliquant Raf, Mek1/2 et ERK1/2 (Hunyady and Catt, 2006b; Mehta and Griendling, 2007). La transactivation de l EGFR par le récepteur AT 1 a été démontrée dans plusieurs tissus tels que le foie, le rein, la prostate, le cœur et les cellules musculaires lisses vasculaires (Thomas, et al., 2004). Des études récentes montrent que l activation de ERK1/2 par la voie dépendante de la protéine G (PKC) possède un profil cinétique très différent de l activation de ERK1/2 par la voie indépendante de la protéine G (les arrestines) (Ahn, et al., 2004). L activation d ERK1/2 par la PKC est un phénomène rapide et transitoire favorisant la translocation des ERKs dans le noyau et la transcription du gène c-fos. Par contre l activation des ERKs par les arrestines est un phénomène beaucoup plus lent et plus soutenu dans le temps et ERK activé reste dans les compartiments cytosoliques (Wei, et al., 2003; Wei, et al., 2003; Ahn, et al., 2004; Ahn, et al., 2004; Aplin, et al., 2007; Tohgo, et al., 2002). Les conséquences moléculaires semblent aussi différer en fonction de la voie d activation de ERK1/2. L activation des ERKs par les arrestines est associée aux phénotypes cardioprotecteurs tels que la survie cellulaire (Ahn, et al., 2009b), la régulation de la contraction cellulaire (Rajagopal, et al., 2006) et la migration (Hunton, et al., 2005). Dans les études faites au niveau du cœur et de cardiomyocytes isolés, l activation de la voie des 18

32 19 arrestines favorise la croissance et l hypertrophie (Zhai, et al., 2005), la prolifération des cardiomyocytes (Aplin, et al., 2007; Hansen, et al., 2008), et une augmentation au niveau de leur contractilité (Rajagopal, et al., 2006; Violin, et al., 2010). Dans les cellules musculaires lisses vasculaires, la signalisation via les arrestines augmente la synthèse protéique en interagissant avec la MAP kinase interacting kinase 1 (Mnk-1) (DeWire, et al., 2008) et protège contre l apoptose par la phosphorylation de BAD (Ahn, et al., 2009) Méthodes utilisés pour mesurer l activation de différentes voies de signalisation Production des inositols phosphates Nous avons mesuré l activation de la voie Gq/PLC/IP 3 /Ca 2 par un immunoessai compétitif IPone HTRF (homogeneous time resolved fluorescence) développé par la compagnie Cisbio.Cet immunoessai mesure l accumulation de l IP 1 en présence de LiCl qui bloque la conversion de l IP 1 en myoinositol. Le signal spécifique est généré entre l anticorps dirigé contre l IP 1 et l IP 1 synthétique couplé à l accepteur fluorophore. Suite à la stimulation du récepteur, l IP 1 provenant de la dégradation de l IP 3 rentre en compétition avec l IP 1 synthétique pour la liaison à l anticorps ce qui produit une baisse du signal de fluorescence. Donc, le transfert de l énergie est inversement proportionnel à la concentration de l IP 1 produit suite à la stimulation du récepteur dans le lysat cellulaire. Activation de la voie des ERKs Afin de vérifier l état de l activation des ERK1/ 2, nous avons utilisé l essai Alpha Screen Sure Fire (Amplified Luminescent Proximity Homogenous Assay). Dans cet essai, un premier anticorps, reconnaissant la forme phosphorylée de ERK, est capturé par une bille enrobée de protéine A (bille accepteuse). Un deuxième anticorps, reconnaissant ERK, est biotinylé et capturé par une bille enrobée de streptavidine (bille donneuse). Les deux billes sont à proximité seulement s il y a présence de ERK phosphorylé. Lorsque les deux billes sont à proximité, l excitation de la bille donneuse par AlphaScreen libère le radical libre O 2 qui excite la bille accepteuse, et cette dernière émet alors de la lumière. L activation de ERK1/2 est proportionnelle à la quantité de la lumière émise par la bille accepteuse. 19

33 20 Recrutement de l arrestine et l activation de la voie G 12 Afin de vérifier l activation de la voie G 12 et le recrutement de l arrestine (β 1 -arrestine et β 2 -arrestine), nous avons utilisé l essai BRET. L essai BRET est fondé sur le transfert d énergie entre un donneur bioluminescent et un accepteur fluorescent. Pour qu il y ait un transfert d énergie, le donneur et l accepteur doivent être situé à la proximité (10-100Å). La méthode BRET utilise une luciférase RLuc dont le substrat est la coelenterazine. En présence de l oxygène, la luciférase favorise la transformation du substrat coelenterazine en coelenteramide en émettant une légère lumière visible dans le bleu (395nm). Lorsqu un possible accepteur est situé à proximité de cette source lumineuse, la lumière bleu est captée par l accepteur, dans ce cas la protéine GFP10. L excitation de cette dernière (GFP10) entraîne l émission d une lumière verte à 510nm. L efficacité du transfert d énergie du complexe Rluc à la GFP10 est déterminée par le rapport entre l intensité d émission de l accepteur (lumière verte) sur l intensité d émission du donneur (lumière bleu). Pour le recrutement des arrestines, nous avons utilisé la construction RLuc fusionné avec les arrestines (β1 ou β2 arrestine) et la protéine GFP10 fusionnée avec le récepteur AT 1. Pour l activation de la voie G 12, nous avons utilisé la construction de RLuc fusionnée avec la protéine G 12 et la protéine GFP10 fusionnée avec la sous-unité gamma de la protéine G (Ggamma). Calcul du biais de signalisation Dans l objectif d identifier efficacement la signalisation biaisée de différents analogues de l Ang II et de faciliter la compréhension des données, nous avons utilisé la méthode proposée par le groupe de Kenakin nous permettant de calculer le biais de signalisation (Kenakin, et al., 2012). Les ratios de transduction log(τ/k a ) ont été calculé en utilisant le logiciel GraphPad Prism. Le ratio de transduction représente une estimation de l effet (puissance et efficacité) d un analogue sur la conformation du récepteur et par la suite sur l interaction du complexe ligand-récepteur avec les effecteurs intracellulaires. Afin d évaluer le biais à l intérieur d une voie de signalisation donnée, il faut comparer le comportement d un ligand avec le ligand de référence. L Ang II a été capable de produire une réponse maximale ayant des puissances semblables pour toutes les voies de signalisation que nous avons testées, et nous l avons choisi pour être notre ligand de référence. En comparant le log(τ/ka) du ligand de référence (Ang II) à la valeur du log(τ/ka) de chaque analogue testé pour une voie de signalisation, nous avons pu établir le biais à l intérieur d une voie de 20

34 21 signalisation donnée, soit le Δlog(τ/Ka). Afin d évaluer le biais entre les différentes voies de signalisation pour chaque analogue, nous avons calculé le ΔΔlog(τ/Ka) et le facteur biaisé. ΔΔ(τ/Ka) a été calculé en comparant la valeur du Δlog(τ/Ka) pour une voie de signalisation versus la valeur du Δlog(τ/Ka) d une autre voie de signalisation. Le facteur biaisé représente la base de 10 de la valeur calculée du ΔΔlog(τ/Ka). Importance de la sélectivité fonctionnelle du récepteur AT 1 Le récepteur AT 1 fut un des premiers récepteurs pour lequel l importance de la signalisation biaisée a été démontrée. Le récepteur AT 1 joue un rôle important dans la régulation de la pression sanguine et une suractivité peut mener à plusieurs pathologies telles que l hypertension, la dysfonction rénale ainsi que l insuffisance cardiaque. Les études de mutagénèse sur le récepteur AT 1 montrent qu en bloquant sa capacité à activer la protéine G q, on n affecte pas sa phosphorylation, son internalisation, son recrutement ainsi que sa signalisation via l arrestine (Wei, et al., 2003; Gaborik, et al., 2003). Il a été démontré que l activation de la signalisation β-arrestine via le récepteur AT 1 favorise les effets cardioprotecteur et anti-apoptotique (Ahn, et al., 2009b; Rakesh, et al., 2010). Suite à une délétion du récepteur AT 1 ou des arrestines, le stress mécanique au niveau du cœur induit l apoptose, suggérant que la signalisation via les β-arrestines par le récepteur AT 1 est cardioprotectrice (Rakesh, et al., 2010). Les propriétés de l analogue [Sar 1,Ile 4,Ile 8 ]Ang II (SII) qui active la voie des ERKs en absence de production d inositol phosphate l ont fait reconnaître comme l un des premiers ligands biaisés (Holloway, et al., 2002). D autres travaux montrent que SII améliore la contractilité des cardiomyocytes chez la souris via la signalisation dépendante de la β- arrestine et ceci en absence de la signalisation dépendante de la protéine G q (Rajagopal, et al., 2006). D autres expériences faites avec le SII montrent qu il cause une diminution de l apoptose, qu il stimule la chimiotaxie, qu il augmente la contractilité cardiaque, la croissance et la prolifération cellulaire (Aplin, et al., 2007; Ahn, et al., 2009b; Rajagopal, et al., 2006; Hunton, et al., 2005; DeWire, et al., 2008). Il a également été suggéré que le ligand biaisé SII et l Ang II stabilisent différentes conformations actives du récepteur AT 1 (Sauliere, et al., 2012). Sadoshiwa et al ont généré des souris transgéniques qui surexpriment le récepteur AT 1 de type sauvage et un mutant du récepteur AT 1 incapable de coupler à la protéine G q. Bien que les deux groupes de souris aient développé une hypertrophie cardiaque suite à une 21

35 22 stimulation chronique par l Ang II, il y a eu moins d apoptose et de fibrose au niveau du myocarde des souris exprimant le récepteur AT 1 incapable de coupler à la protéine G q (Zhai, et al., 2005). Ceci porte à croire que ces deux aspects (fibrose et apoptose) impliqués dans la progression de la maladie sont potentiellement reliés à l activité de la voie de signalisation dépendante de la protéine Gq. Les antagonistes du récepteur AT 1 tel le losartan, utilisé couramment en clinique pour traiter l hypertension, bloquent toutes les voies de signalisation en aval du récepteur. Par contre, il serait intéressant de développer une nouvelle génération d antagonistes capables de bloquer sélectivement une voie de signalisation et n influençant pas l activation des autres voies de signalisation. Par ce fait même, on pourrait espérer développer des médicaments pouvant contrôler sélectivement certains aspects de la fonction du récepteur où le contrôle de la pression artérielle serait influencé indépendamment de la croissance pathologique des cardiomyocytes ou des cellules musculaires lisses vasculaires (VSMC). Problématique Une connaissance approfondie de la structure moléculaire du récepteur, en particulier de la topologie de la pochette de liaison ainsi que des changements structuraux associés à l activation du récepteur est requise pour le développement de nouveaux outils thérapeutiques. L élucidation de la pochette de liaison d un GPCR fournit des informations importantes sur les mécanismes de reconnaissance moléculaire entre une hormone et son récepteur. L interaction spécifique entre l hormone et son récepteur se fait au niveau de la pochette de liaison. Les sept TM des GPCRs contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Il existe différentes approches biochimiques pour étudier la structure moléculaire d un GPCR. Nous proposons d utiliser l approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) qui nous permettra de caractériser la pochette de liaison en identifiant les résidus de chaque domaine transmembranaire impliqués dans sa formation. De plus, en utilisant le mutant constitutivement actif N111G-AT 1, l approche SCAM nous aidera à déterminer la position relative de chaque domaine transmembranaire suite à l activation du récepteur. Ces résultats seront utiles pour élaborer un modèle moléculaire de la pochette de liaison du récepteur AT 1 de l Ang II. Afin d améliorer ce modèle, nous allons étudier les différents changements conformationels se produisant lors de l activation du récepteur. Au cours des dernières années, il est devenu de plus en plus évident que le récepteur AT 1 peut activer plus 22

36 23 d une voie de signalisation en interagissant avec différents effecteurs intracellulaires. Le concept de sélectivité fonctionnelle suggère que différents ligands peuvent induire différentes conformations du récepteur et ainsi favoriser l activation ou l inhibition de certaines voies de signalisation. Nous proposons donc de tester les propriétés fonctionnelles d une série d analogues de l Ang II possédant des structures chimiques différentes et possiblement des propriétés pharmacologiques distinctes. Ces ligands nous donneront l information par rapport à la sélectivité fonctionnelle en identifiant les voies de signalisation préférentiellement activées ou inhibées par ces derniers. Les données obtenues serviront à améliorer notre modèle moléculaire du récepteur AT 1. Objectifs 1 ère et 2 ième publication 1. Déterminer la pochette de liaison du récepteur AT 1 avec l approche de SCAM 2. Identifier les résidus du TM2 et du TM5 qui participent dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT 1 et de son mutant constitutivement actif AT 1 -N111G 3. Déterminer le type de mouvement qui se produit lorsque le récepteur passe de la forme inactive vers la forme active 3 ième publication 1.Étudier la sélectivité fonctionnelle de différents ligands analogues de l Ang II 2. Évaluer la puissance (EC 50 ) et l efficacité (E max ) des différents analogues de l Ang II à activer sélectivement une voie de signalisation. 1. G q /PLC 2. G Le recrutement des arrestines 4. La voie de MAP kinases (PKC-ERK et EGFR-ERK) 23

37 24 ARTICLE 1 The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral pivoting movement during the process of receptor activation Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Stéphane S. Martin, Pierre Lavigne, Richard Leduc, Emanuel Escher and Gaétan Guillemette. J. Biol. Chem, 284: (2009). Statut de l article: publié dans Journal of Biological Chemistry. Référence : Domazet I., Holleran B.J., Martin S.S, Lavigne P., Leduc R., Escher E. & Guillemette G. (2009). The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in the formation of the ligand binding pocket and undergoes integral pivoting movement during the process of receptor activation. J. Biol. Chem. 284 (18): Avant-propos: J ai dirigé cette étude et produit toutes les manipulations de ce manuscrit. J ai rédigé la première version de ce manuscrit. 24

38 25 Résumé : L angiotensine II, une hormone jouant un rôle important dans l homéostasie cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT 1 qui appartient à la grande famille des GPCRs. Comme tous les autres GPCRs, le récepteur AT 1 possède sept domaines transmembranaires (TM) qui contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d identifier les acides aminés du TM2 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT 1, nous avons utilisé l approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa réaction avec le methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfèrera avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement par une cystéine les résidus 70 à 94 du TM2 du récepteur AT 1 et de son mutant constitutivement actif AT 1 -N111G. Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants D74C, L81C, L83C, A85C, A89C ont montré une diminution significative d affinité pour le ligand 125 I Sar 1, Ile 8 AngII, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT 1. Des résultats différents ont été obtenus dans le cas du récepteur N111G- AT 1. Le mutant D74C-N111G est devenu insensible au MTSEA, alors que la sensibilité de L81C-N111G fut grandement diminuée. Par contre, le mutant V86C-N111G s est avéré sensible au MTSEA. Ces résultats suggèrent que l activation constitutive du récepteur AT 1 implique un mouvement de pivot du TM2, favorisant le rapprochement du haut du TM2 vers la pochette de liaison. 25

39 26 The second transmembrane domain of the human type 1 angiotensin II receptor participates in the formation of the ligand binding-pocket and undergoes integral pivoting movement during the process of receptor activation Ivana Domazet, Brian J. Holleran, Stéphane S. Martin, Pierre Lavigne, Richard Leduc, Emanuel Escher, and Gaétan Guillemette Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4 Running title: SCAM method to study the ligand-binding pocket of the hat 1 receptor Corresponding author: Gaétan Guillemette, Ph.D., Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, Université de Sherbrooke, th Avenue North, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4, Tel.: (819) , Fax: (819) , Gaetan.Guillemette@USherbrooke.ca 26

40 27 The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) exerts a wide variety of cardiovascular effects through the activation of the angiotensin II type-1 (AT 1 ) receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor superfamily. Like other G protein-coupled receptors, the AT 1 receptor possesses seven transmembrane domains that provide structural support for the formation of the ligand-binding pocket. In order to identify those residues in the second transmembrane domain (TMD2) that contribute to the formation of the binding pocket of the AT 1 receptor, we used the substituted cysteine accessibility method. All the residues within the Leu-70 to Trp-94 region were mutated one at a time to a cysteine, and, after expression in COS-7 cells, the mutant receptors were treated with the sulfhydryl-specific alkylating agent methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA). MTSEA reacts selectively with wateraccessible, free sulfhydryl groups of endogenous or introduced point mutation cysteines. If a cysteine is found in the binding pocket, the covalent modification will affect the binding kinetics of the ligand. MTSEA substantially decreased the binding affinity of D74C-AT 1, L81C-AT 1, A85C-AT 1, T88C-AT 1, and A89C-AT 1 mutant receptors, which suggests that these residues orient themselves within the water-accessible binding pocket of the AT 1 receptor. Interestingly, this pattern of acquired MTSEA sensitivity was altered for TMD2 reporter cysteines engineered in a constitutively active N111G-AT 1 receptor background. Indeed, mutant D74C-N111G-AT 1 became insensitive to MTSEA, whereas mutant L81C- N111G-AT 1 lost some sensitivity and mutant V86C-N111G-AT 1 became sensitive to MTSEA. Our results suggest that constitutive activation of the AT 1 receptor causes TMD2 to pivot, bringing the top of TMD2 closer to the binding pocket and pushing the bottom of TMD2 away from the binding pocket. Introduction The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) 6 is the active component of the reninangiotensin system. It exerts a wide variety of physiological effects, including vascular contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth and proliferation (1). Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through the activation of the AT 1 receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily (2, 3). GPCRs possess seven transmembrane domains (TMDs), which provide structural support for signal transduction. The AT 1 receptor interacts with the G protein G q/11, which activates a phospholipase C, which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate and diacylglycerol from the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (4, 5). Inositol 27

41 28 1,4,5-trisphosphate causes the release of Ca 2+ from an intracellular store whereas diacylglycerol activates protein kinase C. Like other GPCRs, the AT 1 receptor undergoes spontaneous isomerization between its inactive state (favored in the absence of agonist) and its active state (induced or stabilized by the agonist) (6). Movement of TMD helices through translational or rotational displacement is believed to be essential to achieve the active state (7, 8). It has been proposed that TMD3, TMD5, TMD6, and TMD7 may participate in the activation process of the AT 1 receptor by providing a network of interactions through the AngII-binding pocket (9). The dynamics of this network are thought to be modified following agonist binding, thereby forcing the receptor to form new interactions between the TMDs. Based on homology with the high resolution structure of rhodopsin, the archetypal GPCR (10), it was expected that the binding site of the AT 1 receptor would involve the seven mostly hydrophobic TMDs and would be accessible to charged water-soluble ligands, like AngII. For this receptor, the binding site would thus be contained within a water-accessible crevice, the binding pocket, extending from the extracellular surface of the receptor to the transmembrane portion. Using a photoaffinity labeling approach, we directly identified ligand-contact points within the second extracellular loop and the seventh TMD of the AT 1 receptor (11-13). Interestingly, numerous mutagenesis studies have provided the basis for a model in which an interaction between Asn-111 in TMD3 and Tyr-292 in TMD7 maintains the AT 1 receptor in the inactive conformation. The agonist AngII would disrupt this interaction and promote the active conformational state (14). In support of this model, it was further shown that substitution of Asn-111 for a residue of smaller size (Ala or Gly) confers constitutive activity on the AT 1 receptor (15-17). The substituted cysteine accessibility method (SCAM) (18-20) is an ingenious approach for systematically identifying the residues in a TMD that contribute to the binding site pocket of a GPCR. Consecutive residues within TMDs are mutated to cysteine, one at a time, and the mutant receptors are expressed in heterologous cells. If ligand binding to a cysteinesubstituted mutant is unchanged compared with wild-type receptor, it is assumed that the structure of the mutant receptor, especially around the binding site, is similar to that of the wild-type and therefore that the substituted cysteine lies in a similar orientation to that of the wild-type residue. In TMDs, the sulfhydryl of a cysteine oriented toward the binding site pocket should react faster with a positively charged sulfhydryl reagent like methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA) than sulfhydryls facing the interior of the protein or the lipid bilayer. Two criteria are used for identifying engineered cysteines on the 28

42 29 surface of the binding-site pocket: (i) the reaction with MTSEA alters binding irreversibly and (ii) the reaction is retarded by the presence of ligand. We previously used this approach to identify the residues in TMD3, TMD6, and TMD7 that form the surface of the binding site pocket in the wild-type AT 1 receptor and in the constitutively active N111G-AT 1 receptor (21-23). Here we report the application of SCAM to probe TMD2 in the wild-type and constitutively active receptors. EXPERIMENTAL PROCEDURES Materials Bovine serum albumin, bacitracin, and soybean trypsin inhibitor were from Sigma. The sulfhydryl-specific alkylating reagent MTSEA (CH 3 SO 2 -SCH 2 CH 2 NH + 3 ) was purchased from Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, Canada). The cdna clone for the human AT 1 receptor subcloned in the mammalian expression vector pcdna3 was kindly provided by Dr. Sylvain Meloche (Université de Montréal). LipofectAmine2000 and culture media were obtained from Invitrogen. 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII (specific radioactivity ~1500 Ci/mmol) was prepared with Iodo-GEN (Perbio Science, Erembodegem, Belgium) according to the method of Fraker and Speck (24)and as previously reported (25). Numbering of Residues in TMD2 -Residues in TMD2 of the human AT 1 receptor were given two numbering schemes. First, residues were numbered according to their positions in the human AT 1 receptor sequence. Second, residues were also indexed according to their position relative to the most conserved residue in the TMD in which it is located (26). By definition, the most conserved residue was assigned the position index 50 (e.g. in TMD2, Asp74 is the most conserved residue and was designated Asp-74 (2.50), whereas the upstream residue was designated Leu-75 (2.51) and the downstream residue, Ala-73 (2.49). This indexing simplified the identification of aligned residues in different GPCRs. Oligodeoxynucleotide Site-directed Mutagenesis -Site-directed mutagenesis was performed on the wild-type AT 1 receptor with the overlap PCR method (Expand High Fidelity PCR System; Roche Applied Science). Briefly, forward and reverse oligonucleotides were constructed to introduce cysteine mutations between Leu-70 (2.46) and Trp-94 (2.70). PCR products were subcloned into the HindIII-XbaI sites of the mammalian expression vector pcdna3.1. Site-directed mutations were then confirmed by automated DNA sequencing by aligning the AT 1 sequence with multialin (26). Cell Culture and Transfection -COS-7 cells were grown in Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM) containing 2 mm L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum. 29

43 30 The cells were seeded into 100-mm culture dishes at a density of 2 x 10 6 cells/dish. When the cells reached ~90% confluence, they were transfected with 4 g of plasmid DNA and 15 l of lipofectamine2000. After 24 h, transfected cells were trypsinized, distributed into 12-well plates, and grown for an additional 24 h in complete DMEM containing 100 IU/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin before the MTSEA treatment and binding assay. Binding Experiments -COS-7 cells were grown for 36 h post-transfection in 100-mm culture dishes, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), and subjected to one freeze-thaw cycle. Broken cells were then gently scraped into washing buffer (25 mm Tris- HCl, ph 7.4, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ), centrifuged at 2500 X g for 15 min at 4 o C, and resuspended in binding buffer (25 mм Tris-HCl, ph 7.4, 100 mм NaCl, 5 mм MgCl 2, 0.1% bovine serum albumin, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Saturation binding experiments were done by incubating broken cells (20-40 g of protein) for 1 h at room temperature with increasing concentrations of 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII in a final volume of 500 µl. Nonspecific binding was determined in the presence of 1 µм unlabeled [Sar 1,Ile 8 ]AngII. Bound radioactivity was separated from free ligand by filtration through GF/C filters presoaked for at least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was evaluated by -counting. Treatment with MTSEA -MTSEA treatment was performed according to the procedure of Javitch et al. (18), with minor modifications. Two days after transfection, the cells, which were grown in 12-well plates, were washed with PBS and incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared MTSEA at the desired concentrations (typically from 0.5 to 6 mм) in a final volume of 0.2 ml. The reaction was stopped by washing the cells with icecold PBS. Intact cells were then incubated in binding medium (DMEM, 25 mм HEPES, 0.1% bovine serum albumin, ph 7.4) containing 0.05 nм 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII for 90 min at room temperature. After washing with ice-cold PBS, the cells were lysed with 0.1 ɴ NaOH, and the radioactivity was evaluated by -counting. The percentage of fractional binding inhibition was calculated as (1- (specific binding after the MTSEA treatment/specific binding without the treatment)) 100. TABLE1 Binding Properties of [Sar 1, Ile 8 ]AngII to cysteine-substitued hat 1 mutant receptors Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described under the Experimental Procedure". Binding affinities (K d ) and maximal binding capacities (B max ) are expressed as the means ± S.D. of values obtained in n independent experiments performed in 30

44 31 duplicate. Mutants P82C, W84C, Y87C, Y92C, and W94C did not demonstrate any detectable binding. K d (nm) B max (fmol/mg) n WT (Cys 76 ) 0.6 ± ± L70C 0.7 ± ± A71C 0.9 ± ± L72C 0.4 ± ± A73C 0.4 ± ± D74C 1.2 ± ± L75C 0.9 ± ± F77C 3.1 ± ± L78C 0.4 ± ± L79C 0.5 ± ± T80C 0.3 ± ± L81C 4.0 ± ± L83C 1.8 ± ± A85C 0.9 ± ± V86C 0.6 ± ± T88C 3.2 ± ± 72 3 A89C 0.5 ± ± M90C 1.6 ± ± 20 3 E91C 2.1 ± ± R93C 0.8 ± ±

45 32 FIGURE 1. Schematic representation of the human AT 1 receptor. The numbers indicate the positions of cysteines and other residues in the receptor. The gray closed circles represent cysteine residues that are thought to be linked via disulfide bridges, and the black closed circles represent cysteine residues whose side chains do not form a disulfide bridge. Mutated TMD2 residues are located between Leu 70 and Trp 94 inclusively. Potential N-glycosylation sites (Asn 4, Asn 176, and Asn 18 ) are indicated. Asn 111 in TMD3 is also shown in gray. Protection against MTSEA reaction by [Sar 1,Ile 8 ]AngII Transfected cells grown in 12-well plates were washed once with PBS and incubated in the presence or absence of 100 nм [Sar 1,Ile 8 ]AngII for 1 h at 16 o C (to avoid internalization of receptors). The cells were washed to remove excess ligand and then treated with MTSEA. The cells were washed three times with ice-cold PBS and once with an acidic buffer (150 mм NaCl, 50 mм acetic acid, ph 3.0) to dissociate bound ligand. They were then incubated for 3 h at 16 o C in binding medium (DMEM, 25 mм HEPES, 0.1% bovine serum albumin, ph 7.4) containing 0.05 nм 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII. The percentage of protection was calculated as ((inhibition in the absence of [Sar 1, Ile 8 ]AngII) - (inhibition in the presence of [Sar 1,Ile 8 ]AngII)/(inhibition in the absence of [Sar 1, Ile 8 ]AngII)) 100. Phospholipase C assay- Inositol phosphates accumulation was determined as described previously (27). In brief, COS-7 cells were seeded in 6-well plates, transfected, and 32

46 33 labeled for 16 h in serum-free M199 containing 10 Ci/ml [myo- 3 H]inositol (MP Biomedicals, Solon, OH). Cells were washed twice with PBS plus 0.1% (w/v) dextrose and then incubated in stimulation buffer (DMEM containing 25mм HEPES, 10mм LiCl, and 0.1% bovine serum albumin, ph 7.4) for 30 min at 37 C. Incubations were terminated by the addition of ice-cold perchloric acid (final concentration, 5% (v/v)). Water-soluble inositol phosphates were then extracted with an equal volume of a 1:1 (v/v) mixture of 1,1,2- trichlorotrifluoroethane and tri-n-octylamine. The samples were mixed vigorously and centrifuged at 2500 g for 30 min. The upper phase containing inositol phosphates was applied to an AG1-X8 resin column (Bio-Rad). Inositol phosphates were eluted sequentially by the addition of an ammonium formate/formic acid solution of increasing ionic strength. Fractions containing inositol phosphates were collected and measured in a liquid scintillation counter. Data analysis -Results are presented as means ± SD. Specific binding data (B max and K d ) were analyzed with Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA), using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis. FIGURE 2. MTSEA treatment of the wild-type AT 1 receptor and sensitive reporter cysteine-bearing mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type, D74C, L81C, A85C, T88C, or A89C AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mм). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм 125 I-[Sar 1,Ile 8 ] AngII, and their binding properties were evaluated as indicated in "Experimental Procedures." Each curve represents the means ± S.D. of data obtained from at least three independent experiments. 33

47 34 FIGURE 3. Effects of MTSEA on different mutant AT 1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD2. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type or mutant AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mм MTSEA (A) or 2 mм MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII. The percentage of binding inhibition was calculated as indicated in Experimental Procedures. The vertical line represents an arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants and was set at a value corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the wild-type AT 1 receptor. The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared to the wild-type receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the means ± SD of data from at least three independent experiments. RESULTS Binding Properties of Mutant Receptors Bearing Cysteines in TMD2 -To identify the residues in TMD2 that face the binding site pocket of the AT 1 receptor, we mutated 24 34

48 35 consecutive residues between Leu-70 (2.47) and Trp-94 (2.70) to cysteine, one at a time. Each mutant receptor was transiently expressed in COS-7 cells. To assess the conservation of the global conformation of these receptors after the substitution, pharmacological parameters describing the equilibrium binding of the radiolabeled competitive ligand 125 I-[Sar 1,Ile 8 ] AngII such as K d and B max were determined (Table 1). All mutant AT 1 receptors exhibited high binding affinity for 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII (similar to that of the wild-type AT 1 receptor) except for mutants P82C (2.58), W84C (2.60), Y87C (2.63), Y92C (2.68), and W94C (2.70), which did not demonstrate any detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. B max values for all detectable receptors ranged from 490 to 4282 fmol/mg of protein. Effect of Extracellularly Added MTSEA on the Binding Properties of Mutant Receptors -To verify whether the reporter cysteines introduced into the TMD2 of the AT 1 receptor were oriented toward the binding pocket, mutant receptors were treated with concentrations of MTSEA varying between 0.5 and 6 mм. We also verified whether the wildtype AT 1 receptor, which contains 10 endogenous cysteines (Fig. 1) was sensitive to MTSEA treatment. Fig. 2 shows that various concentrations of MTSEA had very little effect (no more than a 25% reduction) on the binding properties of the wild-type AT 1 receptor, indicating that the endogenous cysteines made a relatively small contribution to the binding site pocket. A 3- min treatment with 0.5 mм MTSEA (Fig. 3A) strongly inhibited the binding properties of mutants L81C (2.57) -AT 1 (binding inhibition of 65%), A85C (2.61) -AT 1 (binding inhibition of 71%), and T88C (2.64) -AT 1 (binding inhibition of 75%), whereas it had only a minor effect on the binding properties of the other mutant receptors. At higher MTSEA concentrations (2 mм and above), the binding properties of mutant receptors D74C (2.50) -AT 1 and A89C (2.65) -AT 1 were also slightly affected (Fig. 3B). Overall, the most reactive cysteines were those substituted for L81C (2.57), A85C (2.61) and T88C (2.64), whereas the cysteine substituted for D74C (2.50) and A89C (2.65) were less reactive. Altered Accessibility to TMD2 Reporter Cysteines in the Constitutively Active N111G- AT 1 Receptor -We made use of the constitutively active N111G-AT 1 receptor to assess and map the potentially altered accessibility of MTSEA to the engineered cysteines. We first determined the pharmacological properties of the 24 cysteine-substituted mutant receptors. Within the N111G-AT 1 receptor background, 18 cysteine-substituted mutants conserved a high binding affinity for the competitive ligand 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII (Table 2). The mutant receptors P82C (2.58) -N111G-AT 1, L83C (2.59) -N111G-AT 1, W84C (2.60) -N111G-AT 1, Y87C (2.63) - N111G-AT 1, Y92C (2.68)) -N111G-AT 1, and W94C (2.70) -N111G-AT 1 did not have any 35

49 detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. B max values for all detectable receptors ranged from 570 to 3967 fmol/mg of protein (Table 2). 36 TABLE 2 Binding Properties of [Sar 1,Ile 8 ]AngII to cysteine-substitued hat 1 mutant receptors bearing the N111G mutation Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described under Experimental Procedure. Binding affinities (K d ) and maximal binding capacities (B max ) are expressed as the means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants P82C-N111G, L83C-N111G, W84C-N111G, Y87C-N111G, Y92C- N111G and W94C-N111G did not demonstrate any detectable binding. K d (nm) B max (Fmol/mg) n N111G 0.8 ± ± L70C 3.6 ± ± A71C 1.3 ± ± L72C 0.9 ± ± A73C 0.6 ± ± D74C 1.8 ± ± L75C 0.6 ± ± F77C 0.7 ± ± L78C 0.6 ± ± L79C 0.5 ± ± T80C 0.4 ± ± L81C 1.7 ± ± A85C 0.9 ± ± V86C 2.6 ± ± T88C 0.7 ± ± A89C 1.0 ± ± M90C 2.9 ± ± E91C 2.1 ± ± R93C 1.2 ± ±

50 37 FIGURE 4. MTSEA treatment of the N111G-AT 1 receptor and sensitive reporter cysteine-bearing mutant N111G-AT 1 receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing the N111G-AT 1, L81C-N111G-AT 1, A85C-N111G-AT 1, V86C-N111G-AT 1, T88C-N111G- AT 1, or A89C-N111G-AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mм). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII, and their binding properties were evaluated as indicated under Experimental Procedures. Each curve represents the means ± S.D. of data from at least three independent experiments. Figure 4 (see also Fig. 2) shows that, like the wild-type receptor, the N111G-AT 1 receptor was relatively insensitive to a 3-min treatment with MTSEA concentrations ranging from 0.5 to 2 mм, again indicating the relatively low contribution of the endogenous cysteines to the binding site pocket. Cysteine-substituted N111G-AT 1 receptor mutants were also treated with increasing concentrations of MTSEA, and their binding properties were assessed with 125 I- [Sar 1,Ile 8 ]AngII. Fig. 5 summarizes the effect of the MTSEA treatment on the different cysteine-substituted N111G-AT 1 receptor mutants. As observed in the wild-type background, 0.5 mм MTSEA decreased the binding activity of the A85C (2.61) N111G AT 1 and T88C (2.64) N111G AT 1 by 78 and 82 % respectively. It is noteworthy that the V86C (2.62) N111G AT 1 mutant, which was insensitive to MTSEA in the wild-type background, had reduced binding activity by 47% in the N111G-AT 1 background after a treatment with 0.5 mm MTSEA. On the other hand, L81C (2.57) N111G AT 1 which exhibited a significant reduction in binding activity in the wild-type background, became less sensitive to MTSEA in the N111G-AT 1 background (reduction of 39% in binding activity after a treatment with 2 37

51 38 mm MTSEA) and that D74C (2.50) N111G AT 1 became completely insensitive to treatment with MTSEA. Protection against MTSEA Reaction by a Pretreatment with [Sar 1,Ile 8 ]AngII To confirm that reporter cysteines accessible to MTSEA are located within the binding pocket, receptor mutants were saturated with the competitive ligand [Sar 1,Ile 8 ]AngII prior to the MTSEA treatment. The cells were then washed with an acid buffer to dissociate the bound ligand. The receptors were then assayed for binding with the radiolabeled competitive ligand. Fig. 6 shows how a preincubation with the competitive ligand [Sar 1,Ile 8 ]AngII protected mutant receptors D74C (2.50) -AT 1, L81C (2.57) -AT 1, A85C (2.61) -AT 1, T88C (2.64) -AT 1, A89C (2.65) - AT 1, L81C (2.57) -N111G-AT 1, A85C (2.61) -N111G-AT 1, V86C (2.62) -N111G-AT 1, T88C (2.64) - N111G-AT 1, and A89C (2.65) -N111G-AT 1 from the inhibitory effect of MTSEA, with protection levels ranging from 59 to 91%. Functional Properties of Wild-type and Mutant AT 1 receptors-the functional properties of wild-type and mutant AT 1 receptors were evaluated by measuring phospholipase C activity in transiently transfected COS-7 cells. Fig. 7 shows the relative amounts of inositol phosphates accumulated under basal conditions. Cells expressing cysteine mutant receptors in the wild-type background produced inositol phosphates at levels that were not significantly different from that produced by cells expressing the wild-type AT 1 receptor. The basal level of inositol phosphates found in cells expressing cysteine mutant receptors in the N111G background was at least 3-fold higher than that found in cells expressing the wild-type AT 1 receptor, thereby confirming the constitutive activity of all receptors bearing both cysteine and N111G mutations. These results show that cysteine mutations within TMD2 do not compromise the functional integrity of either the ground state AT 1 receptor or the constitutively active N111G-AT 1 receptor. DISCUSSION The rationale of this study, which relied on SCAM analysis, was to gain an insight into the orientation of TMD2 of the AT 1 receptor by identifying the residues accessible to MTSEA within the binding site pocket. Mapping these residues in the ground state receptor and the constitutively active N111G background allowed us to measure relative changes in the position of certain residues, thus providing valuable information with which to infer a structural change underlying AT 1 receptor activation. It is important to mention that our approach of systematically substituting each residue within TMD2 for a cysteine did not alter 38

52 the functional properties of either the ground state AT 1 receptor or the constitutively active N111G-AT 1 receptor (Fig.7). 39 FIGURE 5. Effect of MTSEA on different mutant N111G-AT 1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD2. Intact COS-7 cells transiently expressing the mutant N111G- AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mм MTSEA (A) or 2 mм MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nм 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII. The percentage of binding inhibition was calculated as indicated under Experimental Procedures. The vertical line represents an arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants. It was set at a value corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the N111G-AT 1 receptor. The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared to that of the N111G-AT 1 receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the means ± SD of data from at least three independent experiments. 39

53 40 FIGURE 6. [Sar 1,Ile 8 ]AngII protection of MTSEA-sensitive mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing MTSEA-sensitive mutant AT 1 receptors were preincubated for 1 h at 16 o C in the absence or presence of 100 nм [Sar 1,Ile 8 ]AngII. The cells were then incubated for 3 min at 16 o C in the continued absence or presence of [Sar 1,Ile 8 ]AngII with optimal MTSEA concentrations to achieve maximal binding inhibition of each receptor. The MTSEA concentrations were as follows: 0.5 mм for L81C-AT 1, A85C- AT 1, T88C-AT 1, A85C-N111G-AT 1, V86C-N111G-AT 1, and T88C-N111G-AT 1 ; 2 mм for D74C-AT 1, A89C-AT 1, L81C-N111G-AT 1, and A89C-N111G-AT 1. The cells were then washed with ice-cold PBS and incubated for 3 h at 16 o C with 0.05 nм 125 I-[Sar 1,Ile 8 ]AngII. Protection was calculated as described under Experimental Procedures. Each bar represents the means ± S.D. of data from at least three independent experiments. As previously reported, the insensitivity of the wild-type receptor to MTSEA suggests either that endogenous cysteines are not alkylated by MTSEA or that their alkylation does not affect the binding of the ligand (23). Our methodological approach of adding the MTSEA reagent to whole adherent cells expressing the AT 1 receptor essentially exposed only the extracellular ligand-accessible side of the receptor to MTSEA. Interestingly, most of the MTSEAaccessible residues that we identified with the SCAM approach lie in the middle (D74C (2.50), L81C (2.57) ) to the top portion of TMD2 (A85C (2.61), T88C (2.64), A89C (2.65) ) (Fig.8). These results imply that the residues involved in the interaction with the ligand are mostly located within this interface. Thus, residue Ala-89 (2.65) would delineate the top of the binding pocket, whereas residue Asp-74 (2.50) would delineate the bottom of the water-accessible binding pocket of the receptor. Along with these residues, three other residues, Leu-81 (2.57), Ala- 40

54 41 85 (2.61), and Thr-88 (2.64), would lie on the same α-helix face in the ground state of the receptor, with great exposure to a potential hydrophilic pocket (see Fig.8). By a mechanism that could be steric, electrostatic, or indirect, the alkylation of these residues with MTSEA would hamper the binding of the ligand. It is very likely that these two subsets of residues do not interact with the same portion of the ligand. Furthermore, it is assumed that water-accessible residues are in the binding site pocket if a competitive ligand protects them from the effect of MTSEA. The competitive ligand [Sar 1,Ile 8 ]AngII protected all the residues tested, thus supporting the notion that these specific residues within TMD2 are located in the binding pocket. Although the mutant L83C-AT 1 did show sensitivity (Fig. 3B), we did not consider residue Leu-83 (2.59) to be in the binding pocket, because 1) it is not on the same helical face as the other MTSEA-sensitive residues 2) in the constitutively active background, the mutant L83C (2.59) -N111G-AT 1 did not show any binding activity. These results suggest that residue Leu-83 (2.59) is important to maintain the global conformation of the receptor. Our finding that residues Asp-74 (2.50), Leu-81 (2.57), Ala-85 (2.61), Val-86 (2.62), Thr-88 (2.64), and Ala-89 (2.65) are located in the binding pocket of the AT 1 receptor is in accordance with the current models proposed for bovine rhodopsin (10), squid rhodopsin (28), the opsin receptor (29), and dopamine D2 receptor (30). Indeed, residue Thr-94 (2.61) is thought to be one of the contact points with retinal in the crystal structure of bovine rhodopsin (10) whereas residue Asn-87 (2.57) is one of the contact points with retinal in the crystal structure of squid rhodopsin (28). Also, the SCAM approach was used to show that residues Asp-80 (2.50), Val-87 (2.57), Val- 91 (2.61), Val-92 (2.62), Leu-94 (2.64), and Glu-95 (2.65) are located in the binding pocket of dopamine D2 receptor (30). 41

55 42 FIGURE 7. Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild type and mutant AT 1 receptors. Transfected COS-7 cells were preloaded for h with 10 Ci/ml [myo- 3 H]inositol. Inositol phosphates (sum of inositol bisphosphate, inositol trisohosphate, and inositol tetrakisphosphate) accumulated within a period of 30 min were determined as described under Experimental Procedures. These results represent the mean ± S.D. values from three independent experiments (done in triplicate), where inositol phosphates production was normalized for incorporation of [myo- 3 H]inositol into phospholipids and for receptor expression level (determined by saturation binding assays). 42

56 43 FIGURE 8. Helical wheel representation of TMD2 reporter cysteines and their pattern of reactivity to MTSEA. A and B, positions in TMD2 of MTSEA-alkylated cysteines affecting ligand binding are shown in a helical wheel representation viewed from the extracellular side for receptors with no additional mutation in TMD2 (A) and for receptors in which Asn-111 has been mutated to Gly in addition to the reporter cysteine in TMD2 (B). The gray and black circles indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or significantly reduced (black) after the treatment with MTSEA. White circles indicate those mutant receptors that were insensitive to MTSEA treatment or positions that resulted in little or no detectable binding when substituted for cysteine. To further investigate the mechanism by which the AT 1 receptor undergoes structural changes during the transition from its inactive to its active state, we took advantage of the constitutively active N111G-AT 1 receptor. It is believed that the isomerization of conformers toward the active state, which involves transmembrane movement, is stabilized by the binding of an agonist and would be mimicked in part by the constitutively active receptor (6, 31). Thus, within the structural background of the N111G-AT 1 receptor, we verified the accessibility of TMD2 residues to MTSEA, and we compared the pattern obtained with that of the wild-type receptor. We found that Cys-substituted mutant A85C (2.61) -N111G-AT 1, T88C (2.64) -N111G-AT 1, and A89C (2.65) -N111G-AT 1 maintained their sensitivity to MTSEA in 43

57 44 the constitutively active receptor background (Fig. 5). One more Cys-substituted mutant in the N111G-AT 1 receptor background,v86c (2.62) -N111G-AT 1, was found to be sensitive to MTSEA (Fig. 5). It is important to mention that in the N111G-AT 1 background, the sensitivity of D74C (2.50) -N111G-AT 1 was completely abolished, and the sensitivity of L81 (2.57) -N111G-AT 1 was greatly diminished when compared with that observed in the basal state (Fig. 3 versus Fig. 5). Thus, in the active state of the receptor, Asp-74 (2.50), which is located more toward the bottom of the TMD, would be displaced away from the binding pocket (Fig. 8). Interestingly, our finding that residues Leu-81 (2.57) -N111G and Ala-85 (2.61) - N111G are in the binding pocket in the active state of the AT 1 receptor is in accordance to the current model proposed for the ligand-free G-protein-coupled receptor opsin (29). Indeed, residues Phe-91 (2.57) and Thr-94 (2.61) confine the retinal pocket in the active form of opsin (29, 32). In the protection assay for the mutants in the N111G- AT 1 background, the competitive ligand [Sar 1,Ile 8 ]AngII offered effective protection to all sensitive mutants (L81C (2.57) - N111G-AT 1, A85C (2,61) -N111G-AT 1, V86C (2,62) -N111G-AT 1, T88C (2,64) -N111G-AT 1, and A89C (2,65) -N111G-AT 1 ) against the alkylating effect of MTSEA, suggesting that these residues are located in the binding pocket (Fig. 6). Our study showed that position 2.50, a well conserved aspartic acid residue found in many class A receptors, appears to be facing the binding pocket in the ground state but not in the N111G-AT 1 background. This position in TMD2 is known to be crucial for G protein activation (6, 33, 34). Also, this residue is suggested to be a part of an intermolecular bonding network implicating interhelical interactions between TMD2 and TMD7. Indeed, the recently elucidated crystal structure of squid rhodopsin shows that the carboxyl group of Asp- 80 (2.50) interacts directly with the side chain of Asn-311 (7.61), corresponding to a state in which rhodopsin is able to bind G proteins (28). Our data suggesting that residue Asp-74 (2.50) is displaced away from the binding pocket in the active state of the receptor is concordant with the suggestion that this residue forms intramolecular interactions with residues of other TMDs and particularly of TMD7 upon activation. This would support the idea that the N111G receptor stabilizes its constitutive activity partly by altering the conformation of this residue. Since the residues corresponding to Asp-74 (2.50) in TMD2 and the NPXXY motif in TMD7 are highly conserved in GPCRs, the functional significance of TMD2-TMD7 interaction may be common to many GPCRs (3). The divergence in the sensitivity of Cys-substituted mutants in the wild-type background and in the N111G-AT 1 receptor background suggests that the accessibility of residues in TMD2 and their spatial proximity within the binding pocket were altered due to 44

58 45 the single substitution of an asparagine for a glycine at position 111 in TMD3. Our results points to a considerable structural change during the process of activation of the receptor. In the N111G-AT 1 receptor background, Val-86 (2.62), which is located near the top of TMD2, became MTSEA-sensitive. This residue is located at the extreme right of the helical face formed by the MTSEA-sensitive Thr-88 (2.64), Leu-81 (2.57), Ala-85 (2.61), and Ala-89 (2.65) residues identified in the ground state (Fig.8). The simple explanation for such a gain in sensitivity of mutant V86C-N111G-AT 1 is that upon activation, TMD2 slightly rotates clockwise, bringing Val-86 (2.62) within the binding pocket, where it can be alkylated by MTSEA. If this were the case, one should expect that the sensitive residue at the extreme left of the helical face forming the binding pocket would be displaced out of the binding pocket, where it could not be alkylated by MTSEA. Because T88C (2.64) -N111G-AT 1 is still sensitive to MTSEA, this explanation is unlikely. A clockwise rotation of TMD2 cannot either explain the reduced sensitivity of mutant L81C (2.57) -N111G-AT 1 and the complete loss of sensitivity of mutant D74C (2.50) -N111G-AT 1. The straightforward explanation for the sensitivity changes observed between the mutant in the ground state and those in the constitutively active state could be that TMD2 undergoes integral pivoting, bringing the top of TMD2 toward the binding pocket and pushing the bottom of TMD2 away from the binding pocket. This simple pivoting movement would then expose Val-86 (2.62) to the binding pocket and extrude Asp-74 (2.50) out of the binding pocket. This explanation would go along with the four proposed simple but varied types of movements (pivoting, rotation, translation and piston movements) that TM α-helices can undergo in a lipid bilayer (35). Previous studies using the SCAM approach have proposed a rigid body rotation of TMD2 for the constitutively active rat AT 1 receptor bearing mutations at residue Asn-111 (3.35) (36). In that study (36), a decrease in the accessibility of the residues in the bottom of TMD2 to the binding pocket in the case of constitutively active receptor was observed. This corresponds partly to our observations and could be interpreted as we suggest as a pivoting movement, where the bottom of the TMD2 is pushed away from the binding pocket. In conclusion, we show that TMD2 participates in the formation of the binding pocket of the AT 1 receptor. Our data comparing the ground state versus an activated state of the AT 1 receptor strongly point toward a pivoting movement of TMD2 that exposes Val-86 (2.62) and alters the exposure of Leu-81 (2.57) to the binding pocket. The movement of the bottom of TMD2 would shift Asp-74 (2.50) away from the binding pocket. This particular movement could be a structural feature common to other rhodopsin-like GPCRs. 45

59 46 FOOTNOTES This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. This article was submitted to fulfil the requirements of a Ph.D. thesis for I.D. at the Université de Sherbrooke. E.E. is recipient of the J.C. Edwards Chair in Cardiovascular Research. R.L. is a Chercheur National of the Fonds de la recherche en Santé du Québec. P.L. is a Chercheur Senior of the Fonds de la recherche en Santé du Québec. The abbreviations used are: AngII, angiotensinii; AT 1 receptor, Angiotensin II Type-1 receptor; GPCR, G protein-coupled receptor; TMD, transmembrane domain; SCAM, substituted-cysteine accessibility method; MTSEA, methanethiosulfonate-ethylammonium; DMEM, Dulbecco s Modified Eagle s Medium. REFERENCES 1. de Gasparo, M., Catt, K. J., Inagami, T., Wright, J. W., and Unger, T. (2000) Pharmacol. Rev. 52, Burnier, M. (2001) Circulation 103, Miura, S., Saku, K., and Karnik, S. S. (2003) Hypertens. Res. 26, Balla, T., Baukal, A. J., Guillemette, G., Morgan, R. O., and Catt, K. J. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83, Kojima, I., Kojima, K., Kreutter, D., and Rasmussen, H. (1984) J. Biol. Chem. 259, Gether, U., and Kobilka, B. K. (1998) J. Biol. Chem. 273, Ghanouni, P., Steenhuis, J. J., Farrens, D. L., and Kobilka, B. K. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, Dunham, T. D., and Farrens, D. L. (1999) J. Biol. Chem. 274, Inoue, Y., Nakamura, N., and Inagami, T. (1997) J. Hypertens. 15, Palczewski, K., Kumasaka, T., Hori, T. et al. (2000) Science 289, Boucard, A. A., Wilkes, B. C., Laporte, S. A., Escher, E., Guillemette, G., and Leduc, R. (2000) Biochemistry 39, Laporte, S. A., Boucard, A. A., Servant, G., Guillemette, G., Leduc, R., and Escher, E. (1999) Mol. Endocrinol. 13, Perodin, J., Deraet, M., Auger-Messier, M. et al. (2002) Biochemistry 41, Joseph, M. P., Maigret, B., Bonnafous, J. C., Marie, J., and Scheraga, H. A. (1995) J. Protein Chem. 14,

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61 48 ARTICLE 2 The fifth transmembrane domain of angiotensin II Type 1 receptor participates in the formation of the ligand-binding pocket and undergoes a counterclockwise rotation upon receptor activation Auteurs de l article: Ivana Domazet, Stéphane S. Martin, Brian J. Holleran, Marie-Ève Morin, Patrick Lacasse, Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc et Gaétan Guillemette Statut de l article: publié dans Journal of Biological Chemistry (2009) 284 : Avant-propos: j ai fait la majorité des expériences et j ai redigé la première version du manuscrit. Résumé : L angiotensine II, une hormone jouant un rôle important dans l homéostasie cardiovasculaire, produit la majorité de ses effets en activant le récepteur AT 1 appartenant à la grande famille des GPCRs. Les sept domaines TM des GPCRs contribuent à former la pochette de liaison du ligand. Afin d identifier les acides aminés du TM5 impliqués dans la formation de la pochette de liaison du récepteur AT 1, nous avons utilisé l approche SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) qui consiste à évaluer les propriétés de liaison du récepteur suite à sa réaction avec le methanethiosulfonate (MTSEA). Le MTSEA alkyle les cystéines endogènes ou introduites par mutagénèse dirigée, causant ainsi un encombrement stérique qui interfèrera avec la liaison du ligand. Une série de mutants ont été produits en remplaçant successivement par une cystéine les résidus 190 à 217 du TM5 du récepteur AT 1 et de son mutant constitutivement actif AT 1 -N111G. Après le prétraitement avec le MTSEA, les mutants L197, N200, I201, G203 et F204 ont montré une diminution significative d affinité pour le ligand 125 I Sar 1, Ile 8 AngII, suggérant que ces résidus sont orientés dans la pochette de liaison du récepteur AT 1. Des résultats différents ont été obtenus dans le cas du récepteur AT 1 -N111G. Le mutant I201C-N111G est devenu plus sensible au MTSEA, alors que la sensibilité de G203C-N111G fut diminuée. Ces résultats suggèrent que l activation constitutive du récepteur AT 1 implique un mouvement de rotation dans le sens antihoraire du TM5. 48

62 49 THE FIFTH TRANSMEMBRANE DOMAIN OF ANGIOTENSIN II TYPE 1 RECEPTOR PARTICIPATES IN THE FORMATION OF THE LIGAND BINDING POCKET AND UNDERGOES A COUNTERCLOCKWISE ROTATION UPON RECEPTOR ACTIVATION Ivana Domazet, Stéphane S. Martin, Brian J. Holleran, Marie-Ève Morin, Patrick Lacasse, Pierre Lavigne, Emanuel Escher, Richard Leduc and Gaétan Guillemette Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4 Running title: Rotation of transmembrane five upon AT 1 receptor activation Corresponding author: Gaétan Guillemette, Ph.D., Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, th Avenue North, Sherbrooke, Quebec, Canada, J1H 5N4, Tel.: (819) , Fax: (819) , Gaetan.Guillemette@USherbrooke.ca 49

63 50 The octapeptide hormone angiotensin II exerts a wide variety of cardiovascular effects through the activation of the angiotensin II Type 1 (AT 1 ) receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor superfamily. Like other G protein-coupled receptors, the AT 1 receptor possesses seven transmembrane domains that provide structural support for the formation of the ligand-binding pocket. The role of the fifth transmembrane domain (TMD5) was investigated using the substituted cysteine accessibility method. All of the residues within Thr-190 to Leu-217 region were mutated one at a time to cysteine, and after expression in COS-7 cells, the mutant receptors were treated with the sulfhydryl-specific alkylating agent methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA). MTSEA reacts selectively with wateraccessible, free sulfhydryl groups of endogenous or introduced point mutation cysteines. If a cysteine is found in the binding pocket, the covalent modification will affect the binding kinetics of the ligand. MTSEA substantially decreased the binding affinity of L197C-AT 1, N200C-AT 1, I201C-AT 1, G203C-AT 1, and F204C-AT 1 mutant receptors, which suggests that these residues orient themselves within the water-accessible binding pocket of the AT 1 receptor. Interestingly, this pattern of acquired MTSEA sensitivity was altered for TMD5 reporter cysteines engineered in a constitutively active N111G-AT 1 receptor background. Indeed, mutant I201C-N111G-AT 1 became more sensitive to MTSEA, whereas mutant G203C-N111G-AT 1 lost some sensitivity. Our results suggest that constitutive activation of AT 1 receptor causes an apparent counterclockwise rotation of TMD5 as viewed from the extracellular side. INTRODUCTION The octapeptide hormone angiotensin II (AngII) 6 is the active component of the reninangiotensin system. It exerts a wide variety of physiological effects, including vascular contraction, aldosterone secretion, neuronal activation, and cardiovascular cell growth and proliferation (1). Virtually all the known physiological effects of AngII are produced through the activation of the AT 1 receptor, which belongs to the G protein-coupled receptor (GPCR) superfamily (2, 3). GPCRs possess seven transmembrane domains (TMDs), which provide structural support for signal transduction. The AT 1 receptor interacts with the G protein G q/11, which activates a phospholipase C, which in turn generates inositol 1,4,5-trisphosphate and diacylglycerol from the cleavage of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (4, 5). Inositol 1,4,5-trisphosphate causes the release of Ca 2+ from an intracellular store, whereas diacylglycerol activates protein kinase C. 50

64 51 Like other GPCRs, the AT 1 receptor undergoes spontaneous isomerization between its inactive state (favored in the absence of agonist) and its active state (induced or stabilized by the agonist) (6). Movement of TMD helices through translational or rotational displacement is believed to be essential to achieve the active state (7, 8). For the AT 1 receptor, it was proposed that TMD3, TMD5, TMD6, and TMD7 participate in the activation process by providing a network of interactions through the AngII-binding pocket (9). The dynamics of this network are thought to be modified following agonist binding, which forces the receptor to form new interactions or sever existing interactions between the residues forming the TMDs. Based on homology with the high resolution structure of rhodopsin, the archetypal GPCR (10), it was expected that the binding site of the AT 1 receptor would be formed between its seven mostly hydrophobic transmembrane domains and would be accessible to charged water-soluble agonists, like AngII. For this receptor, the binding site would thus be contained within a water-accessible crevice, the binding pocket, extending from the extracellular surface of the receptor to the transmembrane portion. Using a photoaffinity labeling approach, we directly identified ligand contact points within the second extracellular loop and the seventh TMD of the AT 1 receptor (11-13). Interestingly, numerous mutagenesis studies have provided the basis for a model in which an interaction between Asn-111 in TMD3 and Tyr-292 in TMD7 maintains the AT 1 receptor in the inactive conformation. The agonist AngII would disrupt this interaction and promote the active conformational state (14). In support of this model, it was further shown that substitution of Asn-111 for a residue of smaller size (Ala or Gly) confers constitutive activity on the AT 1 receptor (15-17). The substituted cysteine accessibility method (SCAM) (18-20) is an ingenious approach for systematically identifying the residues in a TMD that contribute to the binding site pocket of a GPCR. Consecutive residues within TMDs are mutated to cysteine, one at a time, and the mutant receptors are expressed in heterologous cells. If ligand binding to a cysteine-substituted mutant is unchanged compared with wild-type receptor, it is assumed that the structure of the mutant receptor, especially around the binding site, is similar to that of wild type and therefore that the substituted cysteine lies in a orientation similar to that of the wild-type residue. In TMDs, the sulfhydryl of a cysteine oriented toward the binding site pocket should react more quickly with a positively charged sulfhydryl reagent like methanethiosulfonate-ethylammonium (MTSEA) than sulfhydryls facing the interior of the protein or the lipid bilayer. Hence, two criteria are used for identifying engineered cysteines on the surface of the binding-site pocket: (i) the reaction with MTSEA alters ligand binding 51

65 52 irreversibly and (ii) the reaction is retarded by the presence of ligand. We previously used this approach to identify residues in TMD2, TMD3, TMD6, and TMD7 that form the surface of the binding site pocket in the wild-type AT 1 receptor and in the constitutively active N111G- AT 1 receptor (21-24). Here we report the application of SCAM to probe TMD5 in the wildtype and constitutively active receptors. EXPERIMENTAL PROCEDURES Materials -Bovine serum albumin, bacitracin, and soybean trypsin inhibitor were from Sigma. The sulfhydryl-specific alkylating reagent MTSEA (CH 3 SO 2 -SCH 2 CH 2 NH + 3 ) was purchased from Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, Canada). The cdna clone for the human AT 1 receptor subcloned in the mammalian expression vector pcdna3 was kindly provided by Dr. Sylvain Meloche (Université de Montréal). LipofectAmine2000, and culture media were obtained from Invitrogen. 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII (specific radioactivity, ~1500 Ci/mmol) was prepared with Iodo-GEN (Perbio Science, Erembodegem, Belgium) according to the method of Fraker and Speck (25) and as previously reported (26). Numbering of residues in TMD5 -Residues in TMD5 of the human AT 1 receptor were given two numbering schemes. First, residues were numbered according to their positions in the human AT 1 receptor sequence. Second, residues were also indexed according to their position relative to the most conserved residue in the TMD in which it is located (27). By definition, the most conserved residue was assigned the position index 50, e.g., in TMD5, Pro-207 is the most conserved residue and was designated Pro-207 (5.50), whereas the upstream residue was designated Phe-206 (5.49) and the downstream residue, Phe-208 (5.51). This indexing simplified the identification of aligned residues in different GPCRs. Oligodeoxynucleotides site-directed mutagenesis -Site-directed mutagenesis was performed on the wild-type AT 1 receptor with the overlap PCR method (Expand High Fidelity PCR System; Roche Applied Science). Briefly, forward and reverse oligonucleotides were constructed to introduce cysteine mutations between Thr-190 (5.33) and Leu-217 (5.60). PCR products were subcloned into the HindIII-XbaI sites of the mammalian expression vector pcdna3.1. Site-directed mutations were then confirmed by automated DNA sequencing by aligning the AT 1 sequence using MultAlin (28). Cell culture and transfection -COS-7 cells were grown in Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM) containing 2 mm L-glutamine and 10% (v/v) fetal bovine serum. The cells were seeded into 100-mm culture dishes at a density of 2 x 10 6 cells/dish. When the cells 52

66 53 reached ~90 % confluency, they were transfected with 4 g of plasmid DNA and 15 l of lipofectamine2000. After 24 h, transfected cells were trypsinized, distributed into 12-well plates, and grown for an additional 24 h in complete DMEM containing 100 IU/ml penicillin and 100 g/ml streptomycin before the MTSEA treatment and binding assay. Binding experiments -COS-7 cells were grown for 36 h post-transfection in 100-mm culture dishes, washed once with phosphate-buffered saline (PBS), and subjected to one freeze-thaw cycle. Broken cells were then gently scraped into washing buffer (25 mm Tris- HCl, ph 7.4, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2 ), centrifuged at 2500 g for 15 min at 4 o C, and resuspended in binding buffer (25 mm Tris-HCl, ph 7.4, 100 mm NaCl, 5 mm MgCl 2, 0.1% BSA, 0.01% bacitracin, 0.01% soybean trypsin inhibitor). Saturation binding experiments were done by incubating broken cells (20-40 g of protein) for 1 h at room temperature with increasing concentrations of 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII in a final volume of 500 µl. Non-specific binding was determined in the presence of 1 µm unlabeled [Sar 1,Ile 8 ]AngII. Bound radioactivity was separated from free ligand by filtration through GF/C filters pre-soaked for at least 3 h in binding buffer. Receptor-bound radioactivity was evaluated by counting. Treatment with MTSEA -MTSEA treatment was performed according to the procedure of Javitch et al. (29), with minor modifications. Two days after transfection, the cells, which were grown in 12-well plates, were washed with PBS and incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared MTSEA at the desired concentrations (typically from 0.5 mm to 6 mm) in a final volume of 0.2 ml. The reaction was stopped by washing the cells with ice-cold PBS. Intact cells were then incubated in binding medium (DMEM, 25 mm HEPES, 0.1% BSA, ph 7.4) containing 0.05 nm 125 I [Sar 1, Ile 8 ]AngII for 90 min at room temperature. After washing with ice-cold PBS, the cells were lysed with 0.1 N NaOH and the radioactivity was evaluated by counting. The percentage of fractional binding inhibition was calculated as [1-(specific binding after the MTSEA treatment/specific binding without the treatment)] x 100. Protection against MTSEA reaction by [Sar 1, Ile 8 ]AngII -Transfected cells grown in 12- well plates were washed once with PBS and incubated in the presence or absence of 100 nm [Sar 1, Ile 8 ]AngII for 1 h at 16 o C (to avoid internalization of receptors). The cells were washed to remove excess ligand and then treated with MTSEA. The cells were washed three times with ice-cold PBS and once with an acidic buffer (150 mm NaCl, 50 mm acetic acid, ph 3.0) to dissociate bound ligand. They were then incubated for 3 h at 16 o C in binding medium (DMEM, 25 mm HEPES, 0.1% BSA, ph 7.4) containing 0.05 nm 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII. The percentage of protection was calculated as [(inhibition in the absence of [Sar 1, Ile 8 ]AngII) - 53

67 54 (inhibition in the presence of [Sar 1, Ile 8 ]AngII)/(inhibition in the absence of [Sar 1, Ile 8 ]AngII)] x 100. Phospholipase C assay -Inositol phosphates accumulation was determined as described previously (30). In brief, COS-7 cells were seeded in six-well plates, transfected, and labeled for 16 h in serum-free M199 containing 10 Ci/ml [myo- 3 H]inositol (MP Biomedicals, Solon, OH). Cells were washed twice with PBS/0.1% (w/v) dextrose and then incubated in stimulation buffer (DMEM containing 25mM HEPES, 10mM LiCl, and 0.1% BSA, ph 7.4) for 30 min at 37 C. Incubations were terminated by the addition of ice-cold perchloric acid [final concentration, 5% (v/v)]. Water-soluble inositol phosphates were then extracted with an equal volume of a 1:1 (v/v) mixture of 1,1,2-trichlorotrifluoroethane and tri-n-octylamine. The samples were mixed vigorously and centrifuged at 2500g for 30 min. The upper phase containing inositol phosphates was applied to an AG1-X8 resin column (Bio-Rad). Inositol phosphates were eluted sequentially by the addition of an ammonium formate/formic acid solution of increasing ionic strength. Fractions containing inositol phosphates were collected and measured in a liquid scintillation counter. Data analysis -Results are presented as means ± SD. Specific binding data (B max and K d ) were analyzed with Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, San Diego CA), using a one-site binding hyperbola nonlinear regression analysis. RESULTS Binding properties of mutant receptors bearing cysteines in TMD5 -To establish whether residues in TMD5 orient themselves towards the binding-site pocket of the AT 1 receptor, we mutated 27 consecutive residues between Thr-190 (5.33) and Leu-217 (5.60) to cysteine, one at a time. Each mutant receptor was transiently expressed in COS-7 cells. To assess the conservation of the global conformation of these receptors after the substitution, pharmacological parameters describing the equilibrium binding of the radiolabeled competitive ligand 125 I-[Sar 1, Ile 8 ] AngII such as K d and B max were determined (Table 1). Most mutant AT 1 receptors exhibited high binding affinity for 125 I-[Sar 1, Ile 8 ] AngII (similar to that of the wild-type AT 1 receptor) except for mutant G203C (5.46) -AT 1 that showed a moderate 5-fold decrease in binding affinity. The mutant receptors G196C (5.39) -AT 1, K199C (5.42) -AT 1 and P207C (5.50) -AT 1 did not demonstrate any detectable binding activity and 54

68 were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all detectable receptors ranged from 0.2 to 7.9 pmol/mg of protein. 55 Table 1 Binding Properties of [Sar 1, Ile 8 ] AngII to Cysteine-Substitued hat 1 Mutant Receptors Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described in the Experimental Procedure. Binding affinities (K d ) and maximal binding capacities (B max ) are expressed as the means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants G196C, K199C and P207C did not demonstrate any detectable binding. K d B max n nm pmol/mg WT 0.9 ± ± T190C 0.8 ± ± L191C 2.2 ± ± P192C 1.0 ± ± I193C 2.1 ± ± G194C 0.7 ± ± L195C 3.5 ± ± L197C 1.8 ± ± T198C 0.8 ± ± N200C 0.9 ± ± I201C 1.0 ± ± L202C 1.5 ± ± G203C 5.0 ± ± F204C 2.4 ± ± L205C 0.9 ± ± F206C 0.9 ± ± F208C 1.1 ± ± L209C 0.8 ± ± I210C 1.2 ± ± I211C 0.7 ± ± L212C 0.8 ± ±

69 56 T213C 0.8 ± ± S214C 1.1 ± ± Y215C 2.0 ± ± T216C 0.8 ± ± L217C 1.3 ± ± Effect of extracellularly added MTSEA on the binding properties of mutant receptors -To verify whether the reporter cysteines introduced into TMD5 of the AT 1 receptor were oriented towards the binding pocket, mutant receptors were treated with concentrations of MTSEA varying between 0.5 mm and 6 mm. We had initially verified whether the wild-type AT 1 receptor, which contains 10 endogenous cysteines (Fig. 1) was sensitive to MTSEA. Fig. 2 shows that various concentrations of MTSEA had very little effect (no more than a 15% reduction at high MTSEA concentrations) on the binding properties of the wild-type AT 1 receptor, indicating that the endogenous cysteines made a relatively small contribution to the binding-site pocket. A 3-min treatment with 0.5 mm MTSEA (Fig. 3A) strongly inhibited the binding properties of mutants L197C (5.40) -AT 1 (binding inhibition of 35%), N200C (5.43) -AT 1 (binding inhibition of 38%), G203C (5.46) -AT 1 (binding inhibition of 57%) and F204C (5.47) -AT 1 (binding inhibition of 30%), whereas it had only a minor effect on the binding properties of the other mutant receptors. At higher MTSEA concentrations (2 mm and above), the binding properties of mutant receptor I201C (5.44) -AT 1 were also slightly affected (Fig. 3B). Overall, the most reactive cysteines were those substituted for L197C (5.40), N200C (5.43), G203C (5.46) and F204C (5.47), whereas the cysteine substituted for I201C (5.44) was less reactive. Altered accessibility to TMD5 reporter cysteines in the constitutively active N111G-AT 1 receptor -We made use of the constitutively active N111G-AT 1 receptor to assess and map the potentially altered accessibility of MTSEA to the engineered cysteines. We first determined the pharmacological properties of the 27 cysteine-substituted mutant receptors. 56

70 57 FIGURE 1. Schematic representation of the human AT 1 receptor. The numbers indicate the positions of cysteines and other residues in the receptor. The gray closed circles represent cysteine residues that are thought to be linked via disulfide bridges, and the black closed circles represent cysteine residues whose side chains do not form a disulfide bridge. Mutated TMD5 residues are located between Thr-190 and Leu-217 inclusively. Potential N- glycosylation sites (Asn-4, Asn-176, and Asn-188) are indicated. Asn-111 in TMD3 is also shown in gray. 57

71 58 FIGURE 2. MTSEA treatment of the wild-type AT 1 receptor and sensitive reporter cysteine-bearing mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type (WT), L197C, N200C, I201C, G203C, or F204C AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mm). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII, and their binding properties were evaluated as indicated under Experimental Procedures. Each curve represents the mean ± S.D. of data obtained from at least three independent experiments. Within the N111G-AT 1 receptor background, 24 cysteine-substituted mutants conserved a high binding affinity for the competitive ligand 125 I-[Sar 1, Ile 8 ] AngII, whereas one mutant G203C (5.46) -N111G-AT 1 displayed a moderate almost 8-fold decrease in binding affinity (Table 2). It is interesting to note that the mutation K199C (5.42) which abolished the binding properties of the wild-type receptor, caused only a minor decrease of binding affinity in the N111G-AT 1 receptor background. The mutant receptors G196C (5.39) -N111G-AT 1, P207C (5.50) - N111G-AT 1 and L212C (5.55) -N111G-AT 1 did not have any detectable binding activity and were not used for the SCAM analysis. Bmax values for all detectable receptors ranged from 0.2 to 1.9 pmol/mg of protein (Table 2). Figure 4 (see also Fig. 2) shows that, like the wild-type receptor, the N111G-AT 1 receptor was relatively insensitive to a 3-min treatment with MTSEA concentrations ranging from 0.5 mm to 2 mm, again indicating the relatively low contribution of the endogenous cysteines in the binding-site pocket. Cysteine-substituted N111G-AT 1 receptor mutants were also treated with increasing concentrations of MTSEA and their binding properties were assessed with 125 I-[Sar 1, Ile 8 ] AngII. 58

72 59 FIGURE 3. Effects of MTSEA on mutant AT 1 receptors bearing a reporter cysteine in TMD5. Intact COS-7 cells transiently expressing wild-type (WT) or mutant AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mm MTSEA (A) or 2 mm MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII. The percentage of binding inhibition was calculated as indicated under Experimental Procedures. The vertical line represents an arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants and was set at a value corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the wild-type AT 1 receptor. The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared with the wild-type receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments. 59

73 60 Table 2 Binding Properties of [Sar 1, Ile 8 ] AngII to Cysteine-Substitued hat 1 Mutant Receptors Bearing the Asn 111 Gly Mutation Cells transfected with the appropriate receptor were assayed as described in the Experimental Procedure. Binding affinities (K d ) and maximal binding capacities (B max ) are expressed as the means ± SD of values obtained in n independent experiments performed in duplicate. Mutants G196C, P207C, and L212C did not demonstrate any detectable binding. K d B max n nm pmol/mg N111G 0.7 ± ± T190C 1.0 ± ± L191C 2.4 ± ± P192C 0.8 ± ± I193C 3.2 ± ± G194C 0.9 ± ± L195C 2.0 ± ± L197C 3.1 ± ± T198C 0.6 ± ± K199C 3.2 ± ± N200C 1.8 ± ± I201C 1.4 ± ± L202C 1.4 ± ± G203C 7.7 ± ± F204C 1.7 ± ± L205C 0.9 ± ± F206C 1.8 ± ± F208C 1.2 ± ± L209C 0.7 ± ± I210C 1.6 ± ± I211C 0.7 ± ± T213C 1.6 ± ± S214C 1.3 ± ± Y215C 3.1 ± ±

74 61 T216C 1.0 ± ± L217C 1.1 ± ± Figure 5 summarizes the effect of the MTSEA treatment on the different cysteine-substituted N111G-AT 1 receptor mutants. As observed in the wild-type background, mutants L197C (5.40) - N111G-AT 1 (binding inhibition of 27%), N200C (5.43) -N111G-AT 1 (binding inhibition of 43%) and F204C (5.47) -N111G-AT 1 (binding inhibition of 37%) were very sensitive to 0.5 mm MTSEA. It is noteworthy that mutation I201C (5.44) which conferred a low sensitivity to MTSEA in the wild-type background (binding inhibition of 32% after treatment with a high 2 mm concentration of MTSEA), conferred a higher sensitivity to MTSEA in the N111G-AT 1 background (binding inhibition of 48% after treatment with a low 0.5 mm concentration of MTSEA). At the opposite, the mutation G203C (5.46) conferred a high sensitivity to MTSEA in the wild-type background whereas it conferred only a low sensitivity to MTSEA in the N111G-AT1 background. Finally, of interest, MTSEA treatment increased (127%) the binding activity of mutant K199C (5.42) -N111G-AT 1 (Fig.5) Protection against MTSEA reaction by a pretreatment with [Sar 1, Ile 8 ]AngII To confirm that reporter cysteines accessible to MTSEA are located within the binding pocket, receptor mutants were saturated with the competitive ligand [Sar 1, Ile 8 ]AngII prior to MTSEA treatment. Cells were then washed with an acid buffer to dissociate the bound ligand and the receptors were then assayed for binding with the radiolabeled competitive ligand. Figure 6 shows how a pre-incubation with the competitive ligand [Sar 1, Ile 8 ]AngII protected all mutant receptors that had exhibited changes in binding properties during MTSEA treatment (L197C (5.40) -AT 1, N200C (5.43) -AT 1, I201C (5.44) -AT 1, G203C (5.46) -AT 1, F204C (5.47) -AT 1, L197C (5.40) -N111G-AT 1, N200C (5.43) -N111G-AT 1, I201C (5.44) -N111G-AT 1, G203C (5.46) - N111G-AT 1 and F204C (5.47) -N111G-AT 1 ) from the inhibitory effect of MTSEA, with protection levels ranging from 60% to 95%. Functional properties of wild-type and mutant AT 1 receptors -The functional properties of wild-type and mutant AT 1 receptors were evaluated by measuring the phospholipase C activity in transiently transfected COS-7 cells. Figure 7 shows the relative amounts of inositol phosphates accumulated under basal conditions. The basal production of inositol phosphates in cells expressing the cysteine mutant receptor in the wild-type 61

75 background were not significantly different from that produced by the cells expressing the wild-type AT 1 receptor. 62 FIGURE 4. MTSEA treatment of the N111G-AT 1 receptor and sensitive reporter cysteine-bearing mutant N111G-AT 1 receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing the N111G-AT 1, L197C-N111G-AT 1, N200C-N111G-AT 1, I201C-N111G-AT 1, G203C- N111G-AT 1, or F204C-N111G-AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with increasing concentrations of freshly prepared MTSEA (0.5 to 6 mm). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII, and their binding properties were evaluated as indicated under Experimental Procedures. Each curve represents the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments. 62

76 63 FIGURE 5. Effect of MTSEA on N111G-AT 1 mutant receptors bearing a reporter cysteine in TMD5. Intact COS-7 cells transiently expressing the mutant N111G-AT 1 receptors were incubated for 3 min at room temperature with freshly prepared 0.5 mm MTSEA (A) or 2 mm MTSEA (B). The intact cells were then incubated for 90 min at room temperature with 0.05 nm 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII. The percentage of binding inhibition was calculated as indicated under Experimental Procedures. The vertical line represents an arbitrary threshold used to identify cysteine-sensitive mutants. It was set at a value corresponding to binding inhibition 20% greater than the value for the N111G-AT 1 receptor. The white bars indicate mutant receptors for which binding activities were not appreciably reduced compared with that of the N111G-AT 1 receptor after treatment with MTSEA. The gray and black bars indicate mutant receptors for which binding activities were slightly reduced (gray) or strongly reduced (black) after treatment with MTSEA. Each bar represents the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments. The basal level of inositol phosphates found in cells expressing cysteine mutant receptors in the N111G background was at least 4-fold higher than that found in cells expressing the wildtype AT 1 receptor, thereby confirming the constitutive activity of all receptors bearing both 63

77 64 cysteine and N111G mutations. These results show that cysteine mutations within TMD5 do not compromise the functional integrity of either the ground state AT 1 receptor or the constitutively active N111G-AT 1 receptor. DISCUSSION The rationale of this study, which relied on SCAM analysis, was to gain an insight into the orientation of TMD5 of the AT 1 receptor by identifying the residues accessible to MTSEA within the binding site pocket. Mapping these residues in the ground state receptor and the constitutively active N111G background allowed us to measure relative changes in the position of certain residues, thus providing valuable information with which to infer a structural change underlying AT 1 receptor activation. It is important to mention that our systematic approach of substituting each residue within TMD5 for a cysteine did not alter the functional properties of either the wild-type AT 1 receptor or the constitutively active N111G- AT 1 receptor (Fig.7) As previously reported, the insensitivity of the wild-type receptor to MTSEA suggests either that endogenous cysteines are not alkylated by MTSEA or that their alkylation does not affect the binding of the ligand (24). Our approach of adding the MTSEA reagent to whole adherent cells expressing the AT 1 receptor essentially exposed only the extracellular ligandaccessible side of the receptor to MTSEA. Interestingly, most of the MTSEA-accessible residues that we identified with the SCAM approach are located from the middle (N200C (5.43), I201C (5.44), G203C (5.46), F204C (5.47) ) to the top (L197C (5.40) ) portion of TMD5 (Fig.8). These results suggest that this portion of TMD5 is involved in the interaction with the ligand. Residue Leu-197 (5.40) would delineate the top whereas residue Phe-204 (5.47) would delineate the bottom of the water-accessible binding pocket of the AT 1 receptor. Along with these two residues, three other residues, Asn-200 (5.43), Ile ) and Gly-203 (5.46), would also be part of the binding pocket in the ground state of the receptor. Indeed, by a mechanism that could be steric, electrostatic, or indirect, the alkylation of these residues with MTSEA hampered the binding of the ligand. This is further supported by the fact that the competitive ligand [Sar 1, Ile 8 ]AngII protected them from the effect of MTSEA. 64

78 65 FIGURE 6. [Sar 1, Ile 8 ]AngII protection of MTSEA-sensitive mutant receptors. Intact COS-7 cells transiently expressing MTSEA-sensitive mutant AT 1 receptors were preincubated for 1 h at 16 C in the absence or presence of 100 nm [Sar 1, Ile 8 ]AngII. The cells were then incubated for 3 min at 16 C in the continued absence or presence of [Sar 1, Ile 8 ]AngII with optimal MTSEA concentrations to achieve maximal binding inhibition of each receptor. The MTSEA concentrations were as follows: 0.5 mm for L197C-AT 1, N200C-AT 1, G203C-AT 1, F204C-AT 1, L197C-N111G-AT 1, N200C-N111G-AT 1, I201C-N111G-AT 1, and F204C-N111G-AT 1 ; and 2 mm for I201C-AT 1 and G203C-N111G-AT 1. The cells were then washed with ice-cold PBS and incubated for 3 h at 16 C with 0.05 nm 125 I-[Sar 1, Ile 8 ]AngII. Protection was calculated as described under Experimental Procedures. Each bar represents the mean ± S.D. of data from at least three independent experiments. 65

79 66 FIGURE 7. Basal levels of inositol phosphates in cells expressing the wild-type (WT) and mutant AT 1 receptors. Transfected COS-7 cells were preloaded for h with 10 μci/ml [myo- 3 H]inositol. Inositol phosphates (sum of inositol bisphosphate, inositol trisphosphate, and inositol tetrakisphosphate) accumulated within a period of 30 min were determined as described under Experimental Procedures. These results represent the mean ± S.D. values from at least three independent experiments (done in triplicate) where inositol phosphate production was normalized for incorporation of [myo- 3 H]inositol into phospholipids and for receptor expression level (determined by saturation binding assays). Our finding that residues Leu-197 (5.40), Asn-200 (5.43), Ile-201 (5.44), Gly-203 (5.46) and Phe-204 (5.47) are located in the binding pocket of the AT 1 receptor is in accordance with the structures of bovine rhodopsin (10), squid rhodopsin (31), opsin (32), β 1 -adrenergic receptor (33), β 2 - adrenergic receptor (34-36) and dopamine D2 receptor (19). Indeed, residues His-211 (5.46) and 66

80 67 Phe-212 (5.47) are thought to constitute a contact point for retinal in the crystal structure of bovine rhodopsin (10) whereas residues Phe-205 (5.43) and Phe-209 (5.47) are located in the binding pocket of the crystal structure of squid rhodopsin (31). The crystal structure of the β 1 -adrenergic receptor revealed that residues Ser-212 (5.43) and Ser-215 (5.46) are contact points for the highaffinity antagonist cyanopindolol (33). Also, the crystal structure of the β 2 -adrenergic receptor revealed that residues Ser-204 (5.43), Ser-207 (5.46) and Phe-208 (5.47) are important for catecholamines binding (34, 35). Furthermore, using the SCAM approach, it was shown that residues Val-191 (5.40), Ser-194 (5.43), Ile-195 (5.44), Ser-197 (5.46) and Phe-198 (5.47) are located in the binding pocket of dopamine D2 receptor (19). Moreover, using the methionine proximity approach, we recently observed that residue N200 (5.43) reacts with the photosensitive ligand [Sar 1, Bpa 8 ]AngII (37). In light of these results, this orientation of TMD5 in the ligand-binding pocket appears to be a common feature of many class A GPCRs. To further investigate the mechanism by which the AT 1 receptor undergoes structural changes during the transition from its inactive to its active state, we took advantage of the constitutively active N111G-AT 1 receptor. It is believed that the isomerization of conformers toward the active state, which involves transmembrane movement, is stabilized by the binding of an agonist and would be mimicked at least in part by the constitutively active receptor (6, 38). Thus, within the structural background of the N111G-AT 1 receptor, we verified the accessibility of TMD5 residues to MTSEA and we compared the pattern obtained with that of the wild-type receptor. We found that Cys-substituted mutants L197C (5.40) -N111G-AT 1, N200C (5.43) -N111G- AT 1 and F204C (5.47) -N111G-AT 1 maintained their sensitivity to MTSEA in the constitutively active receptor background whereas mutant I201C (5.44) -N111G-AT 1 gained sensitivity and mutant G203C (5.46) -N111G-AT 1 lost some sensitivity to MTSEA (Fig. 5). In the protection assay, the competitive ligand [Sar 1, Ile 8 ]AngII offered effective protection to all sensitive mutants (L197C (5.40) -N111G-AT 1, N200C (5.43) -N111G-AT 1, I201C (5.44) -N111G-AT 1, G203C (5.46) -N111G- AT 1 and F204C (5.47) -N111G-AT 1 ) against the alkylating effect of MTSEA, confirming that these residues are located in the binding pocket (Fig. 6). Our finding that residues Leu-197 (5.40), Asn-200 (5.43), Ile-201 (5.44), Gly-203 (5.46) and Phe- 204 (5.47) face the binding pocket in the active state of the AT 1 receptor is in accordance with the current model proposed for the crystal structure of opsin (32). Indeed, residues Ile-205 (5.40), Phe- 208 (5.43) and Phe-212 (5.47) confine the binding pocket of the retinal in the active form of opsin (32, 67

81 68 39). In the crystal structure of activated rhodopsin (40), residues Met-207 (5.43) and His-211 (5.46) were also found in the binding pocket. Furthermore, using NMR spectroscopy measurements, it was found that residues His-211 (5.46) and Phe-212 (5.47) interact with retinal in the receptor s active intermediate form metarhodopsin II (41). A peculiar observation made when the N111G-AT 1 receptor was tested with the SCAM approach was the increased binding activity (127%) of mutant K199C (5.42) -N111G-AT 1 following a treatment with 0.5 mm MTSEA. Obviously, the alkylation of this mutant did not cause any constraint but rather facilitated its interaction with [Sar 1, Ile 8 ]AngII. A likely explanation is that the positive charge added by MTSEA at this position would promote ligand binding, possibly by restoring the initial charge lost by substitution of this residue for cysteine. Interestingly, when tested in the wild-type background, this mutant did not demonstrate any detectable affinity, whereas in the constitutively active background K199C (5.42) -N111G-AT 1 displayed a 3-fold decrease in binding affinity. These results suggest that alkylation of K199 (5.42) potentiates binding via a mechanism involving an intramolecular ionic interaction within the receptor. Further studies are needed to clarify this issue. FIGURE 8. Helical wheel representation of TMD5 reporter cysteines and their pattern of reactivity to MTSEA. The positions in TMD5 of MTSEA-alkylated cysteines affecting ligand 68

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