FECONDATION NATURELLE ET ASSISTANCE MEDICALE A LA PROCREARTION

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1 FECONDATION NATURELLE ET ASSISTANCE MEDICALE A LA PROCREARTION DR. NOZHA CHAKROUN - FACULTÉ DE MÉDECINE DE SFAX

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3 Table des matières Table des matières 3 I - Etapes préalables à la fécondation 9 A. Transit des spermatozoïdes après insémination naturelle dans les voies génitales féminines...9 B. La capacitation des spermatozoïdes...10 II - Rencontre des gamètes 13 A. traversée du cumulus oophorus...13 B. Fixation à la zone pellucide et réaction acrosomique...13 C. Fusion des gamètes...15 D. Activation de l'ovocyte II Emission des granules corticaux dans l'espace perivitellin La reprise de la 2ème division méiotique...16 E. Formation du pronucleus mâle...17 F. Redistribution des organites cellulaires Les mitochondries Les centrioles...18 III - Conséquences de la fécondation 21 A. Conséquences de la fécondation...21 IV - Aspects cliniques de la fécondation 23 A. Anomalies de la fécondation Absence de fécondation Fécondations anormales...24 B. La fécondation in vitro (FIV) et les techniques d'assistance médicale à la procréation (AMP) Insémination Artificielle avec sperme du Conjoint (IAC) La fécondation in vitro conventionnelle ou FIVETTE (fécondation in vitro et transfert embryonnaire) La fécondation in vitro par micro- injection ou ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïde)...27 V - AUTO EVALUATION 29 3

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5 Objectifs Décrire les modifications que subit le spermatozoïde pour acquérir le pouvoir fécondant Décrire les étapes d'intéraction gamétique Connaître les conséquences de la fécondation Comprendre le mécanisme des anomalies de la fécondation Définir les méthodes utilisées dans l'assistance médicale à la procréation 5

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7 Introduction La fécondation est l'aboutissement d'une cascade d'évènements qui culmine par la fusion d'un gamète féminin (ovule) et d'un gamète masculin (spermatozoïde) et la formation des deux pronuclei mâle et femelle. La fécondation se déroule naturellement et normalement dans l'ampoule de la trompe utérine Image 1 : Insémination et migration des spermatozoïdes dans les voies génitales de la femme La fécondation est précédée d'une étape d'insémination et de capacitation qui correspond à l'acquisition de la fécondance du spermatozoïde éjaculé ou capacitation. Les étapes de la fécondation qui se déroulent après la rencontre des gamètes sont : La traversée du cumulus oophorus La fixation à la zone pellucide et la réaction acrosomique La fusion gamètique L'activation de l'ovocyte La formation des deux pronucleï 7

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9 Etapes préalables à la fécondation I - I Transit des spermatozoïdes après insémination naturelle dans les voies génitales féminines La capacitation des spermatozoïdes 9 10 La maturation des gamètes est un préalable indispensable à la fécondation. La maturation des ovocytes se fait au cours de l'ovogenèse (cf. ovogenèse). La maturation des spermatozoïdes commence au niveau de l'épididyme et se termine dans les voies génitales féminines. A. Transit des spermatozoïdes après insémination naturelle dans les voies génitales féminines Pour un homme fertile au moins 40 millions de spermatozoïdes dont 45 % sont mobiles et progressifs sont déposés au fond du vagin après un rapport sexuel. Seuls quelques centaines arrivent au lieu de la fécondation après passage par plusieurs barrières physiologiques. Au niveau du vagin, la majorité des spermatozoïdes meurent à cause du ph acide, les autres spermatozoïdes progressifs atteignent le canal cervical après élimination du liquide séminal. Les secrétions glandulaires qui occupent le canal cervical ont des caractéristiques biochimiques optimales pour la traversée et la survie des spermatozoïdes en période périovulatoire (mucus très fluide, ph alcalin). 9

10 Etapes préalables à la fécondation Image 2 : Migration des spermatozoïdes dans le mucus cervical (1spermatozoïdes, 2 mucus cervical Le mucus cervical présente une barrière naturelle puisque seuls les spermatozoïdes progressifs et morphologiquement normaux peuvent traverser ses mailles. Les spermatozoïdes peuvent rester en survie dans les cryptes glandulaires au niveau du col pendant 3 jours. Le séjour des spermatozoïdes dans la cavité utérine est très court, ils sont rapidement amenés au niveau de la trompe utérine par les contractions utérines et par leur mobilité. A ce niveau, les battements des cils de l'épithélium de la trompe favorisent l'acheminement des spermatozoïdes vers l'ampoule de la trompe. Fondamental L'ensemble des modifications membranaires et biochimiques que subissent les spermatozoïdes au cours de ce transit les rendent aptes à féconder l'ovocyte : c'est le temps de la capacitation. B. La capacitation des spermatozoïdes C'est essentiellement par l'enlèvement de protéines produites par les glandes annexes et déposées sur la membrane du spermatozoïde dans l'épididyme et par l'efflux d'une partie du cholestérol membranaire que le spermatozoïde devient capacité. Ces changements membranaires augmentent la fluidité membranaire et rendent apparents les récepteurs spermatiques spécifiques de la fixation à la zone pellucide. Ils provoquent également une modification de la mobilité du spermatozoïde qui devient hyperactif et perd épisodiquement son mouvement progressif. Les protéines contenues dans les sécrétions du tractus génital féminin et mises en jeux dans la capacitation, sont les glucosaminoglycanes qui fixent les protéines d'origine épididymaire, l'albumine et lipoprtéines qui fixent le cholestérol. Remarque In vitro, la capacitation est une étape inéluctable pour la fécondation in vitro : La 10

11 Etapes préalables à la fécondation capacitation se produit après élimination du plasma séminal, en présence d'un milieu de culture contenant de l'albumine, accepteur du cholestérol. 11

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13 Rencontre des gamètes II - II traversée du cumulus oophorus 13 Fixation à la zone pellucide et réaction acrosomique 13 Fusion des gamètes 15 Activation de l'ovocyte II 16 Formation du pronucleus mâle 17 Redistribution des organites cellulaires 18 A. traversée du cumulus oophorus Grâce à son mouvement hyperactivé, le spermatozoïde va creuser un chemin entre les cellules folliculaires et vient en contact avec la zone pellucide. Au cours de cette traversée, les spermatozoïdes entreront tout d'abord en contact avec les secrétions des cellules du cumulus oophorus (progestérone) puis avec les glycoprotéines de la zone pellucide. Image 3 : Traversée du cumulus oophorus et fixation à la zone pellucide B. Fixation à la zone pellucide et réaction acrosomique Les interactions spermatozoïdes/ zone pellucide sont de type ligand-récepteur. Les glycoprotéines de la zone pellucide (ZP1, ZP2, ZP3) interagissent spécifiquement avec les protéines des spermatozoïdes. 13

14 Rencontre des gamètes Image 4 : Fixation des spermatozoïdes à la zone pellucide La fixation primaire de la ZP3 avec les protéines de la membrane spermatique déclenche la libération des enzymes contenues dans l'acrosome. C'est la réaction acrosomique. Image 5 : Etapes de la réaction acrosomique Définition Il s'agit d'un phénomène de fusion, de vésiculisation et d'exocytose membranaire, calcium dépendant, qui survient dans la partie antérieure de la tête du spermatozoïde entre la membrane plasmique et la membrane externe de l'acrosome (figure5). La conséquence immédiate est la libération du contenu de l'acrosome constitué essentiellement par des enzymes protéolytiques et hydrolityques qui vont faciliter la pénétration des spermatozoïdes à travers la ZP. La RA conduit également à l'extériorisation de la membrane interne de l'acrosome impliquée dans l'adhésion et la fusion avec la membrane ovocytaire. Ainsi, une liaison secondaire et spécifique d'espèce s'effectue entre la ZP2 et les protéines de la membrane interne de l'acrosome. La traversée de la zone pellucide se fait grâce aux mouvements actifs de propulsion 14

15 Rencontre des gamètes des spermatozoïdes capacités. Fondamental Un seul spermatozoïde traverse la zone pellucide et arrive dans l'espace perivitellin C. Fusion des gamètes Le spermatozoïde doit reconnaître la membrane plasmique de l'ovocyte pour pouvoir fusionner avec elle. Cette reconnaissance fait intervenir plusieurs couples ligand-récepteurs. Image 6 : Couples ligand-récepteur intervenant dans la reconnaissance gamétique (1 zone post acrosomique, 2 membrane de l'ovule, 3 espace peivitellin, 4 zone pellucide)) La fusion se produit entre la membrane plasmique qui recouvre le segment équatorial du spermatozoïde et la membrane plasmique de l'ovocyte. 15

16 Rencontre des gamètes D. Activation de l'ovocyte II La fusion provoque une décharge massive de Ca++ qui déclenche l'activation de l'ovocyte se manifestent par 2 évènements : 1. Emission des granules corticaux dans l'espace perivitellin Les enzymes contenues dans les granules corticaux, libérées rendent impénétrable la zone péllucide par les autres spermatozoïdes (empêche la polyspermie). 2. La reprise de la 2ème division méiotique L'ovule conserve la totalité du cytoplasme de l'ovocyte II avec le pronoyau ou pronucleus femelle ; le 2ème globule polaire contenant essentiellement du matériel génétique est éliminé dans l'espace périvitellin. 16

17 Rencontre des gamètes Image 7 : Emission du 2me globule polaire et formation des pronuclei (A : 1 microtubules, 2 GP1, 3 ZP, 4 espace perivitellin, 5 membranes spermatiques, 6 kinocil, 7 noyau du spz, 8 centrosome du spermatozoïde ; B 1 pronucleus paternel, 2 pronucleus maternel, 3 centrosome E. Formation du pronucleus mâle La totalité du spermatozoïde s'introduit dans le cytoplasme de l'ovocyte (la pièce intermédiaire et le flagelle sont progressivement incorporés puis disparaissent). Le noyau du spermatozoïde incorporé dans le cytoplasme ovocytaire va subir des modifications: décondensation de la chromatine : changement des protamines par des histones formation d'une nouvelle membrane nucléaire Le stade de pronuclei dure 24 heures et correspond aux phases G1, S et G2 du cycle cellulaire. 17

18 Rencontre des gamètes F. Redistribution des organites cellulaires 1. Les mitochondries d'origine exclusivement maternelle se localisent autour des pronuclei puis aux deux pôles du fuseau mitotique. 2. Les centrioles Les centrioles apportés uniquement par le spermatozoïde ; se répliquent et occupent les deux pôles du fuseau de la première division de segmentation. Il n'y a jamais de fusion des pronuclei chez les mammifères, la réplication de l'adn se fait dans chacun d'eux indépendamment; quand leurs enveloppes nucléaires se fragmentent et disparaissent durant la prophase de la 1ère division du zygote, les chromosomes paternels et maternels restent groupés séparément attachés aux microtubules centraux. 18

19 Rencontre des gamètes Image 8 : Fusion des pronoyaux et formation du zygote A : 1 pronucleus paternel, 2 pronucleus maternel, 3 centrosome paternel, inner bodies, 5, microtubules de l'aster ; B 1 pronucleus paternel, 2 pronucleus maternel, 3 centrosome, 4 inner bodies 19

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21 Conséquences de la fécondation III - Conséquences de la fécondation III 21 A. Conséquences de la fécondation La fécondation permet : Le rétablissement de la diploïdie (23 paires de chromosomes). Le déterminisme du sexe basé sur le dimorphisme chromosomique (XX ou XY). 21

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23 Aspects cliniques de la fécondation IV - IV Anomalies de la fécondation 23 La fécondation in vitro (FIV) et les techniques d'assistance médicale à la procréation (AMP) 25 La fécondité humaine est relativement faible (la probabilité de concevoir est de 25% par cycle chez un couple normal). A. Anomalies de la fécondation La fécondation peut ne pas avoir lieu ou être anormale, dans ce cas elle aboutit à la formation d'un zygote anormal qui n'a pas de grandes chances pour s'implanter. 1. Absence de fécondation Plusieurs facteurs peuvent intervenir a) Facteurs masculins Exemple Anomalies spermatiques incompatibles avec une fécondation naturelle : absence ou anomalies de l'acrosome akinesie totale du flagelle b) Facteurs féminins Microenvironnement défavorable pour le spermatozoïde Exemple mucus cervical acide, contient des cellules inflammatoires endométriose infection génitale présence d'anticorps antispermatozoïdes Obstruction des voies génitales féminines 23

24 Aspects cliniques de la fécondation 2. Fécondations anormales Exemple parthénogenèse caractérisée par une activation prématurée de l'ovocyte, sans pénétration de spermatozoïde. Elle aboutit à la formation d'un œuf contenant un seul pronucleus d'origine maternelle. Triploïdie : caractérisée par la présence de 3 pronucleï elle peut être d'origine digynique (non expulsion du 2ème GP) ou dispermique (pénétration simultanée de 2 spermatozoïdes par échec de la réaction corticale) Fécondation dispermique Image 9 : Embryon diploïde mais tous les chromosomes sont d'origine paternelle Fécondation monospermique Image 10 : Fécondation monospermique Embryon triploïde : 3 PN (digynique ou dispermique) 24

25 Aspects cliniques de la fécondation Image 11 : Fécondation par deux spermatozoïdes ou un spermatozoïde diploïde B. La fécondation in vitro (FIV) et les techniques d'assistance médicale à la procréation (AMP) Définition La PMA ou AMP comprend l'ensemble des techniques destinées à pallier à l'infertilité en court-circuitant les obstacles à la fécondation naturelle par rapport sexuel. Environ 20% des couples éprouvent une difficulté (hypofertilité) ou une impossibilité (stérilité) à concevoir. La technique la plus simple et la moins coûteuse est l'insémination artificielle avec sperme du conjoint (IAC). 1. Insémination Artificielle avec sperme du Conjoint (IAC) Elle est indiquée en cas de : Mucus cervical de mauvaise qualité Insuffisance du nombre de spz mobiles Troubles sexuels (handicap physique ou troubles de l'éjaculation) Après traitements stérilisant en cas de conservation de sperme Cette technique consiste à déposer directement dans la cavité utérine des spermatozoïdes mobiles après élimination du plasma séminal et sélection par migration, leur nombre devrait être au moins ). 25

26 Aspects cliniques de la fécondation Image 12 : Insémination intrautérine 2. La fécondation in vitro conventionnelle ou FIVETTE (fécondation in vitro et transfert embryonnaire) Elle permet la rencontre des gamètes à l'extérieur des voies génitales féminines. Etapes : 1. La stimulation ovarienne: augmente le nombre de follicules recrutés. Les inducteurs les plus utilisés sont la FSH et les analogues de GnRH. 2. Ponction et recueil des ovocytes sous échographie. 3. Insémination des ovocytes matures par des spermatozoïdes capacités. 4. Culture à 37 C dans des conditions très soigneusement contrôlées. 5. L'observation microscopique après 24 heures permet de confirmer la fécondation qui est attestée par la présence de 2 pronucléï, Les zygotes à 1 pronuleus ou à trois pronuclei sont systématiquement jetés. 6. Transfert intra-utérin à J2 (embryon à 2 ou 4 cellules) ou à J5 après culture prolongée (stade de blastocyste). Le taux de réussite de cette méthode varie de 10 à 25%. 26

27 Aspects cliniques de la fécondation Image 13 : Etapes de la FIV conventionnelle 3. La fécondation in vitro par micro- injection ou ICSI (injection intra-cytoplasmique de spermatozoïde) Définition L'ICSI consiste à injecter à l'aide d'une micropipette et sous microscope inversé un spermatozoïde dans le cytoplasme d'un ovocyte mature (1er globule polaire visible). Remarque Cette technique court-circuite plusieurs étapes dont la fixation à la zone pellucide et 27

28 Aspects cliniques de la fécondation la fusion avec la membrane ovocytaire Image 14 : L'injection intracytoplasmique de spermatozoïde (ICSI) L'ICSI utilise généralement des spermatozoïdes éjaculés matures, ou des spermatozoïdes épididymaires ou testiculaires ou encore des cellules germinales immatures. Les résultats de cette technique sont très satisfaisant (allant jusquà 50% si utilisation de spermatozoïdes matures), ceci explique son utilisation de plus en plus répandue malgré l'existence de données soulignant des risques sur la progéniture. 28

29 V - AUTO EVALUATION V Exercice 1 La fécondation est opérable en première étape par l'apparition : du premier globule polaire dans l'espace perivitellin du 2ème globule polaire dans l'espace perivitellin du pronucleus male du pronucleus femelle du flagelle dans l'espace perivitellin Exercice 2 Les étapes de la fécondation qui se déroulent après la rencontre des gamètes sont les suivantes sauf une : - La fixation à la zone pellucide et la réaction acrosomique La traversée du cumulus oophorus - La formation des deux pronucleï - La fusion gamètique la capacitation Exercice 3 La fixation à la zone pellucide : est spécifique d'espèce intéresse un seul spermatozoïde est de type ligand-récepteur déclenche la réaction acrosomique peut être reproduite in vitro Exercice 4 Donner la définition correspondante 29

30 AUTO EVALUATION i - l'insémination intra utérine ii - ICSI iii - congélation des spermatozoïdes iv - Fécondation in vitro conventionnelle v - Sélection lavage du sperme in vitro Est une technique qui reproduit les étapes de la fécondation in vitro n'est pas une technique qui reproduit les étapes de la fécondation in vitro Exercice 5 La conséquence d'une pénétration simultanée de 2 spermatozoïdes dans un ovocyte par échec de la réaction corticale est : Exercice 6 Dans la fécondation in vitro, la fécondation est confirmée par l'observation microscopique après 24 heures de l'insémination de : 30