MISES A JOUR. Apport de l'examen direct dans les mycoses superficielles et profondes. Le direct en mycologie : les méthodes. D.

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1 MISES A JOUR Apport de l'examen direct dans les mycoses superficielles et profondes D. Chabasse Laboratoire de Parasitologie Mycologie, Institut de Biologie en Santé. CHU Angers 49933, France Les mycoses ont pris ces dernières années une place importante en dermatologie et en maladies infectieuses. L'incidence des maladies fongiques ne cesse de croître tant en pratique de ville (teignes, dermatophyties cutanées, onychomycoses,...) qu'hospitalière (candidoses, cryptoccocose, aspergilloses, pneumocystose,...), du fait de la prise en charge des patients précaires ou immunocompromis. Ce contexte place naturellement le laboratoire de mycologie au centre de la démarche diagnostique. L'examen direct du produit pathologique, qui peut être fait immédiatement après le prélèvement, en est l'étape incontournable après le prélèvement [1]. D'emblée, il oriente vers une mycose et permet d affirmer la présence du champignon à l état parasitaire dans le "produit biologique", justifiant la mise en route (sans attendre le résultat des cultures) du traitement spécifique [2-4]. Le direct en mycologie : les méthodes Il convient de situer son intérêt et sa pratique selon les situations anatomiques (origine du prélèvement) [3, 4]. Peau et phanères L'examen des produits d un grattage superficiel (squames épidermiques, fragments d ongles, cheveux, poils, ) sont habituels dans un laboratoire qui pratique les prélèvements pour la recherche d'un dermatophyte, d'une levure, ou d'un autre kératinophile. Pour se faire, on réalise souvent un "état frais" en utilisant des éclaircissants (Tableau 1), contenant le plus souvent de la potasse à 10 ou 20 % ou d'autres liquides comme le chlorolactophénol d'amann, qui va ramollir la kératine dans le cas des prélèvements unguéaux (Figure 1). Ces produits peuvent être associés à un colorant et ont l'avantage d'imprégner immédiatement la paroi des structures fongiques facilitant la lecture. A titre d'exemple, citons le rouge Congo (Mycétocolor ) (Figure 2), le noir chlorazol et l'encre Parker (blue black super QUINCK). L'utilisation d'un fluorochrome est indiquée si l'on réalise de grandes séries et si on dispose d'un microscope à fluorescence, citons le blanc de calcofluor (Sigma) ou le blankofluor (Bayer) à 0,1 % [2, 5]. Tableau I : Différents éclaircissements pour l'examen des produits d'un grattage superficiel Solution de potasse et de noir Chlorazole E Dissoudre 100 mg de noir chlorazole E (Sigma) dans 10 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) Les ajouter à 90 ml d eau contenant 5 g d hydroxyde de potassium (KOH) Conserver au réfrigérateur en flacon brun Éclaircit et colore en bleu-vert les éléments fongiques Fluorochrome (lecture au microscope à fluorescence avec un filtre bleu nm) KOH 1 g Eau distillée 7,5 ml Ajoutés à : Blankophor P Flüssig (Bayer) ou Calcofluor, ou Uvibio 10μl Ethanol à 90 2,5 ml Conserver au réfrigérateur en flacon brun Éclaircit et rend fluorescents tous les éléments fongiques Chloral-lactophénol d Amman Il permet l éclaircissement à froid et la conservation des examens directs (cheveux) Intéressant quand le résultat de l examen direct n est pas demandé sur le champ Acide phénique 10 g Acide lactique 10 g Glycérine 20 g Eau distillée 10 g Conserver en flacon brun Figure 1 : Squames cutanées issues d'un ongle pathologique : filaments mycéliens arthrosporés (Etat frais dans du Chlorolactophénol au contraste de phase (gr x 250) (D. Chabasse) 250

2 Une technique simplifiée de coloration PAS (selon Hotchkiss et MacManus), proposée par nos collègues de Montpellier [6], a l'avantage de se faire directement sur des fragments d'ongles disposés dans un verre à montre où baigne le colorant. Plus simplement encore, pour un laboratoire moins équipé, l utilisation du contraste de phase du microscope facilite, en l'absence de colorant, l'observation des éléments fongiques. cette lame "porte objet", avant de lui recoller le ruban adhésif transparent facilite aisément la lecture dés l'objectif X 10 (Figure 4). Figure 4 : Scotch test ou test à la cellophane adhésive sur lésion de Pityriasis versicolor. Levures disposées en "grappe" du Genre Malassezia coloration au bleu lactique (Gr 400) Laboratoire de Parasitologie Mycologie (CHU Angers) Figure 2 : Fragments d'ongles colorés au rouge Congo (Mycetcolor ) filaments mycéliens arthrosporés (Gr X 250) sr2b@unimedia.fr Pour les cheveux ou les poils, l'éclaircissant de choix est le lactophénol d'amann qui permet très rapidement d'apprécier le type de parasitisme pilaire (Figure 3). Type favique (Wood +) Trichophyton schoenleinii Type endothrix (Wood -) -Trichophyton tonsurans -Trichophyton violaceum - Trichophyton soudanense Type ecto-endothrix (Wood +) Microsporique : - Microsporum canis - Microsporum audouinii - Microsporum ferrugineum Endo-ectothrix microïde : (Wood -) -Trichophyton mentagrophytes -Trichophyton erinacei Endo-ectothrix mégaspore : (Wood -) -Trichophyton verrucosum Figure 3 : Le parasitisme pilaire chez les dermatophytes agents de teignes (d'aprés Guy Badillet) Pour le diagnostic de Malasseziose cutanée ou précisément du pityriasis versicolor, la technique du scotch-test (ou test à la cellophane adhésive) qui consiste à appliquer un morceau de Scotch transparent directement sur les lésions, puis ensuite le fixer sur une lame de verre, est très performante pour objectiver les levures du genre Malassezia. Le dépôt au préalable d'une goutte de bleu lactique sur Pus d abcès et/ou sérosités issues des lésions fistulisées ou ulcérées Un état frais (décrit précédemment) et un étalement sur lame (frottis) avec coloration au May-Grünwald-Giemsa (MGG) ou Gomori Grocott, seront de préférence réalisés dans ce type de prélèvement. Ces techniques simples permettent d objectiver les formes levures, les filaments mycéliens et plus anecdotiques, les grains issus de mycétomes ou encore les cellules fumagoïdes des agents de chromomycoses. Les produits issus des muqueuses Un écouvillonnage buccal, anal, nasal, auriculaire, ou vaginal est particulièrement recommandé pour objectiver la présence d'un champignon à ces niveaux. Un écouvillon sera destiné à l examen direct après dilution dans un soluté physiologique puis étalement (frottis) et coloration (MGG) du produit étalé sur une lame "porte objet". Un deuxième écouvillon sera utilisé exclusivement pour la culture. Les liquides pathologiques Ce sont essentiellement des produits issus de prélèvements profonds : liquide céphalorachidien (LCR), urines, selles, leucorrhées, produits du lavage bronchiolo alvéolaire (LBA), d expectoration induite et autres liquides de ponction ou d'aspiration (sinusienne, gastrique pleurale ou péritonéale). Sur le produit de centrifugation, ces liquides feront l objet d un examen à l'état frais, d un frottis sur lame "porte objet " avec coloration de préférence au MGG ou à l imprégnation argentique selon Gomori-Grocott. 251

3 MISES A JOUR Les tissus pathologiques Tout produit de biopsie ou d exérèse, issu de tissu profond, peut être broyé (dans un Potter) puis étalé, fixé, et coloré (MGG, Gomori-Grocott). Le direct en mycologie : résultats et interprétation Quelque soit le site du prélèvement, l infection fongique est affirmée par la présence du mycète à l état parasitaire dans le produit pathologique. Le champignon peut se présenter sous différentes formes parfois très typiques, ce qui permet déjà une orientation diagnostique sur la famille ou le genre de l'espèce incriminée [3, 7]. Peau et phanères Poils et cheveux L'étude du parasitisme pilaire est une étape clé dans le diagnostic d'une teigne. Le type endothrix et le type ecto-endothrix microsporique sont en pratique les plus rencontrés. Dans le type endothrix, toutes les spores sont à l'intérieur d'un fragment de cheveux, il signe toutes les teignes dues à des Trichophyton anthropophiles; les cheveux sont habituellement cassés et très courts (Figure 5). Figure 5 : Cheveux. Teignes de type endothrix (Etat frais dans du Chlorolactophenol au contraste de phase. Gr x 400) Laboratoire de Parasitologie Mycologie (CHU Angers) Le type ecto-endothrix se définit par des filaments intrapilaires internes et une gaine régulière de spores en périphérie, il correspond aux teignes dues à des Microsporum qu'ils soient anthropophiles ou zoophiles. Les cheveux se cassent facilement mais restent volontiers rectilignes et la gaine de spore est bien visible. Les stades "microïde" et "mégaspore" du parasitisme ecto-endothrix sont plus rarement et difficilement observés. Il convient de mettre à part la teigne favique (ou favus) due à Trichophyton schoenleinii, anthropophile, qui est devenu rare aujourd'hui, les filaments restent intra pilaires et il n'y a pas de spores produites. Plus anecdotiques sont les lésions de Piedra, soit de Piedra blanche avec ses nodules blancs, mous, disposés en chapelet sur les poils de la moustache et des plis inguinaux, soit de Piedra noire, où les nodules durs et foncés sont bien fixés sur les cheveux. Peau et ongles Les filaments mycéliens régulièrement septés, au diamètre régulier, orientent vers une hyalohyphomycose due à des champignons hyalins (lorsque la paroi reste claire) ou une phaeohyphomycose (mycose à champignons noirs ou dématiés) si cette paroi est foncée d'emblée sans coloration. Pour visualiser ces filaments "arthrosporés", et si on ne dispose pas d'un microscope équipé d'un plateau permettant le contraste de phase, il est utile de disposer de colorants. Les filaments larges, peu ou pas septés, correspondent aux Zygomycètes (agents de mucor mycoses). Des spores arrondies disposées en grappe et associées à du fin mycélium signent, dans un contexte de lésions cliniques évocatrices d'un pityriasis versicolor, la présence de levures du genre Malasssezia (Figure 4). Dans les lésions croûteuse ou verruqueuses de chromomycose, l'examen direct des fragments superficiels révèle les cellules fumagoïdes pathognomoniques de cette mycose quelque soit l'espèce isolée en culture. Pus d abcès et/ou sérosités issues des lésions fistulisées ou ulcérées D'une fistule, on peut recueillir des grains issus de mycétomes fongiques (principalement noirs ou blancs), les grains rouges étant actinomycosiques. Des lésions ulcérées issues de nodules cutanées, la présence de levures allongées de 2 à 6 µm de long en forme de "cigare", évoque le diagnostic d'une sporotrichose. Les produits issus des muqueuses Digestives Les spores bourgeonnantes ou blastospores observées orientent sur une levurose, si elles sont associées à un pseudo mycélium plus précisément une candidose. Respiratoires (arbre aérien, sinus) Les filaments mycéliens réguliers arthrosporés, à ramification dichotomique, à angle aigu, évoquent une 252

4 aspergillose, (Figure 6) tandis que les ramifications à angle droit plaident pour une fusariose. Les filaments siphonnés ou coenocytiques signent, en revanche, pour une mucor mycose. On peut aussi observer dans les produits de sécrétions bronchiques ou des sinus : des "têtes" aspergillaires ou des sporocystes de mucorales. Des éléments allongés de petites tailles (formes trophiques) et des kystes de Pneumocystis jirovecii assurent exclusivement le diagnostic d'une pneumocystose (Figure 7). véritable signature de Cryptoccocus neoformans (Figure 8). Figure 8 : Liquide céphalo rachidien, centrifugation examen à frais dans une goutte d'encre de Chine (GR X1000) levure capsulée : Cryptoccocus neoformans Cdrom 4 ANOFEL (F. Persat Laboratoire de Parasitologie Mycologie CHU Lyon) Figure 6 : Liquide broncho alvéolaire. Centrifugation. Filaments d Aspergillus fumigatus (Coloration au May-Grünwald-Giensa. Gr x 400) Cdrom 4 ANOFEL (MD Linas Laboratoire de Parasitologie Mycologie CHU Toulouse) Les autres liquides pathologiques la présence d'un élément mycélien (spore, blastospore, mycélium, pseudo mycélium) dans un milieu habituellement stérile, en dehors de tout risque de souillure du prélèvement, plaide en faveur d'une mycose. Le biologiste sera attentif a ce résultat pour l'interprétation dés l'isolement en culture et l'identification de l'espèce responsable. Synthèse : les principales mycoses et résultats du direct L'apport de l'examen direct varie selon que la mycose est superficielle, sous-cutanée, ou profonde [2]. Les mycoses superficielles Figure 7 : Liquide broncho alvéolaire Cyto-centrifugation Coloration argentique : kystes en amas de Pneumocystis jirovecii (GR x 1000) Cdrom 4 ANOFEL (Laboratoire de Parasitologie Mycologie CHU Rennes) Liquide Céphalo Rachidien La recherche de cryptocoques dans le culot de centrifugation du LCR est largement facilitée par l'utilisation à frais" d'une goutte d'encre de Chine mélangée avec le LCR, permettant de visualiser rapidement la présence d'une capsule (par le halo clair), Candidoses (Candida spp) Malasseziose ou Pityrosporoses (Malassezia spp) Dermatophyties à Epidermophyton Trichophyton. Microsporum Levures de 3 à 5 μm de diamètre ± associées à des filaments (pseudo filaments) Levures arrondies, parfois ovalaires de 2 à 3 μm de diamètre, disposées en «grappes» ± associées à des filaments Squames et fragments d ongles : Fragments de filaments mycéliens arthrosporés de 2 à 3 μm de diamètre Cheveux (et/ou) poils. Spores de 2 à 3 µm dans les cheveux, parasitisme pilaire type endothrix. Spores de 2 à 3 μm autour des cheveux : parasitisme pilaire type ecto-endothrix. Filaments mycéliens intra pilaires parasitisme pilaire de type favique 253

5 MISES A JOUR Pseudo dermatophytes.à Scytalidium hyalinum.à Neoscytalidium dimidiatum.à Onychocola canadensis Autres moisissures d intérêt médical parasites de l ongle : Fusarium sp Acremonium sp Aspergillus sp. Scopulariopsis brevicaulis Piedra noire (Piedraia hortae) Piedra blanche (Trichosporon spp) Les mycoses sous-cutanées Filaments tortueux segmentés clairs (S. hyalinum) ou parfois foncés (N. dimidiatum) dans les squames ou fragments d ongles Filaments individualisant des arthrospores en forme de "tonnelet" Filaments souvent irréguliers mais régulièrement cloisonnés, parfois simulant la forme saprophytique en culture; Exemple : Scopulariopsis : spores globuleuses, arrondies en forme de montgolfière Cheveux (ou poils) parasités : autour des cheveux ou poils non attaqués on observe des nodules fermes de consistance pierreuse, noirs, faits de cellules polygonales correspondant aux formes sexuées (ascospores du champignon) Cheveux (ou poils) parasités : mais non attaqués. Autour on observe des nodules mous grisâtres, constitués d un amas de blastospores (levures) Les mycoses profondes et/ou systémiques Les mycoses cosmopolites Candidoses à Candida spp Cryptococcose (Cryptococcus neoformans) Pneumocystose à Pneumocystis jirovecii Aspergillose à Aspergillus spp Blastospores ou levures ovoïdes de 3 à 6 μm de long parfois associées à du pseudo mycélium Levures arrondies de taille variable, parfois bourgeonnantes, associées à une capsule. La taille de l ensemble levure + capsule mesure de 5 à 20 μm de diamètre. La capsule est bien mise en évidence à l état frais par l encre de Chine. Avec la coloration de May-Grunwald- Giensa, les formes végétatives (formes trophiques) d aspect punctiformes sont difficilement distinguables au sein des amas spumeux. Les kystes (ou asques?) de 5 à 9 μm apparaissent sous forme de corps intra kystiques au nombre de 8 avec une paroi claire non colorée. L imprégnation argentique est la coloration idéale pour colorer la paroi des kystes. Ceux-ci prennent souvent un aspect froissé, plissé donnant aussi des images de "parenthèses". Dans l aspergillose invasive ou semi invasive, les filaments sont réguliers à bords parallèles, septés, avec des embranchements à angle aigu. Sporotrichose à Sporothrix schenckii Formes levures (assez rares) aspect de cigare ou navette de 3 à 5 μm de long sur 2 à 3 μm de large Fusariose à Fusarium spp Dans les fusarioses invasives et dans les tissus, les filaments se dichotomisent à angle droit, ils prennent aussi un aspect vésiculeux. Chromomycoses (Phialophora spp, Fonsecaea sp) Cellules fumagoïdes caractérisées par Une paroi brune épaisse Des divisions transversales. Parfois associées à des filaments de 6 à 12 μm de diamètre Phaeohyphomycoses (dématiés ou champignons noirs) Les filaments septés, de 3 à 5 μm de diamètre sont souvent irréguliers boudinés voire vésiculeux (Alternaria sp). La paroi peut être d emblée pigmentée mais c est inconstant. Phaeohyphomycoses (Alternarioses) (Alternaria spp) Zygomycoses Cosmopolites ou Mucormycoses Mycétomes fongiques Eléments vésiculeux ± pigmentés en brun de 6 à 12 μm de diamètre (sans cloisons ni divisions internes) Filaments larges (coenocytiques) irréguliers de 5 à 20 μm de diamètre, peu ou pas cloisonnés Les grains fongiques (noirs ou blancjaunâtre) issus de fistules, sont écrasés entre lame et lamelle, ils sont constitués de filaments mycéliens de 2 à 5 μm de diamètre agglomérés en amas. Ils se distinguent des grains actinomycosiques de diamètre moindre < 1 μm Les mycoses tropicales ou d importation Elles sont dues à des champignons dimorphiques. C'est la forme parasitaire (levures, sphérules ) totalement différente de la forme saprophytique habituellement observée en culture. Histoplasmoses à Histoplasma capsulatum var capsulatum Histoplasma capsulatum var duboisii Levures intracellulaires (cellules à fonction macrophagique) de 1 à 3 μm de diamètre, bourgeonnantes, à paroi réfringente. Levures extra ou intra cellulaires (cellules géantes) de 7 à 15 μm de diamètre, à paroi épaisse bourgeonnante, à base étroite, contenant une ou deux corpuscules de nature lipidique. 254

6 Penicilliose à Penicillium marneffei Blastomycose à Blastomyces dermatitidis Coccidioïdomycose à Coccidioïdes immitis et C. posadii Paracoccidioidomcose à Paracoccidioïdes brasiliensis Conclusion Spores allongées intracellulaires (cellules à fonction macrophagique) de 3 à 8 μm de long sur 2-3 μm de large, rondes ou ovales contenant une cloison centrale "aspect en saucisse cloisonnée". Levures extracellulaires de 6 à 15 μm de diamètre, à paroi épaisse, à bourgeonnement unique avec une base large d implantation. Sphérules de 20 à 60 μm de diamètre à paroi fine contenant à maturité des endospores de 3 à 6 μm de diamètre. Levures de grande taille extracellulaires, de 10 à 60 μm de diamètre, multi bourgeonnantes (bourgeons à base fine), aspect typique en "roue de gouvernail" ou de "timonier". L'examen direct est l'étape incontournable dans la démarche du diagnostic mycologique. En cas de positivité, il confirme la présence du champignon, de ce fait il signe la mycose. Négatif, il n'exclut cependant pas une infection fongique. La mise en évidence du champignon avec toutes ses formes parasitaires, surtout quand les éléments sont nettement évocateurs (Parasitisme pilaire, levures capsulées, kystes de Pneumocystis, têtes aspergillaires et plus anecdotiques les cellules fumagoïdes, les spores en "cigare" ou encore les nodules de Piedra), contribue rapidement au diagnostic permettant ainsi la mise en route d'un traitement antifongique adapté. Références 1-Penn P, Bouchara JP, Cimon B, de Gentile L, Chabasse D. L'étape préanalytique en Parasitologie-Mycologie, approche synthétique. Rev Fr Lab. 1998;317: Chabasse D, Contet-Audonneau N, Examen direct et place de l histologie en mycologie. Rev Fr Lab. 2003;357: Chabasse D, Contet-Audonneau N, Bouchara JP, Basile AM. Moisissures Dermatophytes Levures. Du prélèvement au diagnostic. Bio Mérieux EDUCATION, 190 pages. 4-Hennequin C, Rôle du laboratoire dans le diagnostic et la prévention des infections fongiques. Ann Fr Anesth Reanim. 2001;20(4): Robert R, Pihet M. Conventional methods for the diagnosis of dermatophytosis. Mycopathologia. 2008;166(5-6): Rispail P, Bourgeois N, Lachaud L. Diagnostic biologique des onychomycoses : prééminence de l'examen direct. Intérêt d'une technique simplifiée de coloration PAS selon Hotchkiss et Mac Manus. Rev Fr Lab. 2011;432: Cederom ANOFEL (4 éme version)- Association Française des Enseignants et Praticiens Hospitaliers de Parasitologie et de Mycologie Médicale. Silk informatique. Angers