Rapport de Stage d Excellence :

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1 VASSEUR Julien UJF- L1 Rapport de Stage d Excellence : Caractérisation de la structure du Pilus Maître de stage : Anne-Marie Di Guilmi Directeur de Laboratoire : Thierry Vernet 1

2 Remerciements En premier lieu, je souhaite remercier ma maître de stage, Anne- Marie Di Guilmi ainsi que le Directeur du groupe pneumocoque Thierry Vernet, pour avoir accepté ma proposition de stage et m avoir ainsi permis de me faire une première expérience professionnelle en laboratoire. Je suis aussi reconnaissant de la confiance qu ils m ont accordée, me permettant ainsi de pouvoir maniper et participer aux projets en cours. Je remercie particulièrement Anne-Marie, Guillaume, Rémi et Jules pour leur patience ainsi que pour toutes leurs explications, conseils ou remarques qui ont été très enrichissantes et d une grande aide. Aussi, je remercie tout le laboratoire du groupe pneumocoque pour m avoir accueilli et intégré à leur équipe pendant ce mois de stage. 2

3 Table des matières Remerciements.. 2 Sommaire..3 Présentation de l IBS, 2. du laboratoire, 3. généralités sur le pneumocoque Présentation du projet projet global 2. mon projet Principales méthodes utilisées PCR 2. digestion 3. ligation 4. transformation 5. purification Protocole expérimental.12 Résultats et perspectives...17 Conclusion...18 sur le stage sur le dispositif des stages d excellence 3

4 Présentation 1. L Institut de Biologie Structurale : J ai effectué mon stage d Excellence au sein de l Institut de Biologie Structurale (IBS). Cet Institut regroupe une quinzaine de groupes de travail ayant pour vocation le développement de recherches en biologie structurale. Il s appuie donc sur une multidisciplinarité permettant une recherche fondamentale et le développement de techniques innovantes. 2. Le Groupe Pneumocoque : Le Groupe Pneumocoque (PG) dirigé par Thierry Vernet au sein duquel j ai effectué mon stage s intéresse à la biologie du pneumocoque et notamment aux relations entre la bactérie et son hôte, au métabolisme de la paroi, à la division cellulaire ou encore à la résistance aux antibiotiques. 3. Le pneumocoque : Streptococcus pneumoniae, plus communément appelé pneumocoque, est une bactérie appartenant au genre streptococcus. Appelé initialement Diplococcus pneumoniae il a ensuite été rebaptisé Streptococcus pneumoniae au vue de sa croissance en chaine. C est une bactérie GRAM+, se présentant sous la forme de diplocoques ovoïdes possédant une capsule pour les souches pathogènes. Le pneumocoque est la cause la plus commune de méningites bactériennes et un des principaux agents responsable d otites. Il peut aussi conduire à différentes maladies telles que sinusites, conjonctivites ou septicémies. Cette bactérie est commensale de voies respiratoires supérieures chez l homme mais présente un caractère pathogène chez les jeunes enfants, les personnes âgées et immunodefiscientes. Il existe plus de 90 sérotypes liés au pneumocoque. La lutte contre cette bactérie comporte deux facettes : - le traitement : post-infection avec des antibiotiques contenant de la pénicilline ou des macrolides agissant sur la synthèse du peptidoglycane de la paroi cellulaire. - la prévention : vaccins immunisant contre 13 (Prevenar13) ou 23 (Pneumo23) sérotypes. Malheureusement, les vaccins n immunisent pas contre l ensemble des sérotypes et l utilisation abusive des antibiotiques ajoute une pression de sélection à l origine de l émergence de souches résistantes aux traitements. 4

5 Présentation du projet 1. Projet global: Le pilus est un des facteurs de virulence des bactéries, donc du pneumocoque. Celui du pneumocoque se compose de trois types de pilines: RrgA, RrgB, RrgC. Ces trois protéines sont codées par trois gènes différents rrga, rrgb, rrgc. Ilot de pathogénicité rlra de S. pneumoniae d après (Mandlik et al., 2007). Les gènes codant pour les sortases sont représentés en noir, ceux codant pour les pilines mineures en bleu et celui codant pour la piline majeure en rouge. Le gène rlra code pour un régulateur positif. Les protéines sont ensuite assemblées entre elles par des sortases qui sont aussi codées par des gènes localisés en aval de ceux des pilines. Chaque piline est composée de 4 domaines (à part pour RrgC dont la structure cristallographique n a pas encore été résolue) Ainsi chaque sortase a un rôle: - C1: polymérisation de RrgB - C2: lie RrgA et RrgB - C3: lie RrgB et RrgC 5

6 Chaque piline RrgA, RrgB est composée de 4 sous-domaines numérotés de 1 à 4 : 2. Mon projet: Mon projet consiste au clonage du gène alpha2-i d une intégrine au sein d'un plasmide et de réintégrer ce plasmide dans une bactérie par transformation. Le gène alpha2-i code pour une protéine présente au niveau des intégrines et permettant une adhésion à la matrice extra-cellulaire. Ce domaine est également présent dans le domaine D3 de RrgA (en jaune ci-dessus) code aussi pour une protéine contenue dans le domaine D3 de RrgA. En étudiant le domaine alpha2-i de l'intégrine et le mécanisme d adhésion d alpha2-i intégrine à la MEC, on peut le comparer à l'adhésion du pilus par le biais d alpha2-i pneumocoque à la MEC. 6

7 Principales méthodes utilisées TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE : 1. La PCR : La PCR (ou polymerase chain reaction) est une méthode d amplification ciblée in vitro. Elle permet d'obtenir, à partir d'un échantillon complexe et peu abondant, d'importantes quantités d'un fragment d'adn spécifique et de longueur définie. La PCR d amplification : Elle permet l amplification d un fragment d intérêt d un plasmide matrice. Il s'agit de réaliser une succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'adn. Ainsi, chaque réaction nécessite deux amorces oligonucléotides fixées avant et après le brin à amplifier dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre : - oligofor (Forward) - oligorev (Revers) Nous obtenons ainsi de nombreuses fois la séquence désirée. Les produits de chaque étape de synthèse sont utilisés comme matrices pour les étapes suivantes. De ce fait, l'amplification obtenue n est pas linéaire mais exponentielle. 7

8 La mutagénèse par PCR: Le principe de toute mutation introduite par PCR repose sur l'observation qu'une stricte complémentarité de l'amorce nucléotidique avec la séquence de l'adn cible n'est pas absolument nécessaire sur toute la longueur considérée. Elle est obligatoire du côté 3' pour l'amorçage de la réaction, mais pas du côté 5'. Il est alors possible d'imaginer des mutations : on peut ainsi modifier une des extrémités ou les deux extrémités du segment d'adn à amplifier à l'aide d'une ou de deux amorces mutées. Les portions en rouge représentent les régions apportant une mutation. Cette mutation se retrouve, in fine, dans le produit d'amplification. La PCR peut donc aussi être considérée comme une méthode de modification de l'adn. La possibilité d'obtenir simplement, rapidement et en grande quantité des ADN mutés fait de la PCR l'une des stratégies de mutagénèse les plus puissantes. 2. La digestion : La digestion permet de former des extrémités présentant des séquences complémentaires sur une chaine de nucléotides. Pour ce faire, la digestion s effectue grâce à des enzymes qui agissent au niveau de sites de restriction qui leur sont spécifiques. Ces enzymes reconnaissent une séquence particulière et coupent le brin d ADN. Action de BamH1 Lorsqu on intègre un insert à un plasmide ou qu on lui fait subir une PCR, on incorpore de part et d autre de la séquence d intérêt 2 sites de restriction 8

9 différents spécifiques à 2 enzymes qui sont également présents dans le vecteur dans lequel le vecteur sera ensuite introduit. 3. La ligation : Grâce à la digestion, l insert et le plasmide de destination digérés possèdent tout 2 des extrémités compatibles. La ligation permet la réunion du plasmide de destination et de l insert. Normalement le plasmide de destination ne peut pas se recirculariser seul, il faut qu il incorpore la séquence d intérêt digérée pour que la ligation se fasse.la ligase permet la liaison covalente entre les bouts cohésifs complémentaires de l insert et du plasmide. 4. La transformation : L étape de transformation consiste en l intégration d un plasmide recombiné, contenant ou non l insert d intérêt, dans une bactérie. Cette bactérie (par exemple DH5α) a la particularité d intégrer facilement de l ADN extérieur, par contre elle ne possède pas de polymérase pour le plasmide intégré ; il n y aura donc pas de transcription de ce plasmide. Les plasmides à transformer possèdent un gène de résistance à un antibiotique (Ampicilline, Chloramphénicol..). Ainsi, lorsqu on fait pousser nos bactéries sensées avoir intégré le plasmide, on ajoute l antibiotique dans le milieu ; deux cas son alors possibles : - on n obtient aucune colonie de bactéries : la transformation n a pas marché donc les bactéries n ont pas intégré le plasmide et ne portent donc pas la résistance à l antibiotique. 9

10 - on obtient des colonies : la transformation s est bien déroulée, le plasmide s est intégré, la bactérie est viable et peut donc se développer normalement sur un milieu de culture contenant l antibiotique. 5. La purification : Il existe différents types de purification en fonction de ce que l on souhaite purifier : - purification pour obtenir de l ADN plasmidique issu d une culture liquide - purification pour obtenir de l ADN plasmidique après une PCR - purification sur gel d agarose - purification sur colonne Les deux premières méthodes se font toutes les deux sur colonne de silice. Elles permettent l élution sélective des différents constituants de la solution. Ainsi par actions successives de tampons, on peut récupérer l ADN plasmidique dans une solution d eau. La purification sur gel fait intervenir un gel d agarose. En faisant migrer la fraction déposée dans le puits grâce à un courant, on obtient différentes bandes (révélées au BET) séparées en fonction de leur taille apparente. En prélevant les morceaux de gel contenant les bandes et en dissolvant l agarose à 50 on peut en extraire le fragment d ADN sur la colonne de silice. TECHNIQUES DE BIOCHIMIEDES PRTEINES : Concernant les purifications de protéines sur colonne, j en ai utilisé deux : la chromatographie d exclusion de taille et celle d affinité : - la chromatographie d exclusion de taille : Les grosses molécules ne sont pas incluses, elles sortent donc les premières de la colonne. Les petites molécules sont incluses dans les billes de gel et mettent donc plus de temps à traverser la colonne. En relevant l absorbance dans les UV à 280 nm en sortie de colonne on peut récupérer les fractions 10

11 d élution d intérêt contenant la protéine. - la chromatographie d affinité : Dans un premier temps, la solution est passée sur la colonne. Les molécules d intérêt se lient au métal (Ni ou Co parfois) fixé dans la colonne. Ainsi, celles n ayant pas d affinité ne sont pas retenues et se retrouvent dans les fractions de lavage. Enfin, on élue les molécules fixées à la colonne par une solution contenant une molécule compétitive (molécule d imidazole) qui prend la place de la protéine d intérêt et on récupère ces dernières en sortie de colonne. 11

12 Protocole expérimental 1. Etape de PCR (amplification): a. Polymerase chain reaction : Cette étape de PCR d amplification permet la création d un nombre important de copies d une séquence d ADN (10^9 copies). Programme de PCR: 30'' 98 C dénaturation des brins d ADN 10'' 98 C dénaturation des brins d ADN 20'' 50 C 35 cycles hybridation ADN simple brin- amorces 10'' 72 C élongation d ADN par la Taq-pol (élongation) 8' 72 C élongation par la Taq-pol b. Gel de migration : On coule un gel d'agarose et on dépose: Marqueur de taille Echantillon pour BET Echantillon à purifier Cette étape doit permettre d identifier, par imprégnation au BET et révélation aux UV, les fragments à purifier dans le n 2 et de couper la bande d agarose correspondante dans le n 3. Le fragment d ADN à purifier ne contient pas de BET ce qui évite la création de mutations suite à la modification de l ADN par le BET soumis aux UV. La bande d agarose est fondue à 50 C avec du tampon NT (200µl pour 100mg de gel) puis : Mise sur colonne d élution et centrifugation 11000g/min, élimination du filtrat. Ajout de 700µl de tampon NT3 qui élimine les sels et les macromolécules solubles (composé d éthanol), centrifugation 1 minute, élimination du filtrat et 2 ème centrifugation pendant 2 minutes. 12

13 On met un tube de récupération sous le filtre et on ajoute dans la colonne 35µl d eau, permettant l élution par centrifugation (1minute) de l ADN fixé sur la membrane de silice. Nous avons donc récupéré le produit de notre PCR purifié sur gel. 2. Etape de digestion : Nous digérons à la fois la matrice issue de la PCR et celle qui accueillera le domaine d intérêt par les mêmes enzymes. *Digestion du produit PCR : *Digestion du vecteur petduet : -15 µl de produit PCR -10 µl de petduet -1.5 µl de BamHI -1.5 µl de BamHI Enzymes -1.5 µl de HindIII -1.5 µl de HindIII -2µl de tampon d enzyme -1.5 µl de tampon d enzyme E µl d eau 1 heure à 37 C soit la température optimale de l enzyme 5 minutes à 70 C pour inactiver les enzymes. 3. Etape de ligation : La ligation permet la réunion du vecteur petduet digéré et de α2-i digéré. Pour nous assurer de la validité de la ligation, nous effectuons différents témoins positifs ou négatifs. 13

14 La ligation se fait à 22 C pendant 30 minutes puis 5 minutes à 70 C pour inactiver l enzyme. Chaque condition a une fonction bien particulière. Nous pourrons ainsi vérifier notre ligation une fois la transformation faite et la mise en boite des clones effectuée. 1. Le tube n 1 est le premier contrôle, c est le contrôle positif de la transformation. A priori, nous devrions obtenir des colonies puisque le vecteur petduet est circulaire. 2. Ce tube est un premier témoin négatif, en effet il ne possède que le vecteur petduet digéré sans ligase ni insert, il ne peut donc pas se recirculariser. On ne devrait donc pas obtenir de colonies. 3. Ce tube est un second témoin négatif car il contient le plasmide digéré et la ligase. Les deux sites de restriction n étant pas complémentaires, la ligation ne devrait pas avoir lieu et donc aucun transformant ne devrait être obtenu. Ce tube permet de vérifier s il y a bien eu digestion, auquel cas les deux extrémités du vecteur sont non complémentaires et ne peuvent se rabouter. Nous ne devrions pas obtenir de colonies après transformation. 4. Ce tube comportant à la fois le vecteur et l insert digérés par les mêmes enzymes ainsi que la ligase, petduet devrait pouvoir se recirculariser en intégrant l insert. 5. Le tube n 5 est le même que le 4 mais avec des rapports insert/plasmide différents. 4. Transformation : Grâce cette étape, on souhaite réintégrer les vecteurs recircularisés dans des cellules compétentes. Pour ce faire, on ajoute aux 10 µl des tubes de ligation : 50 µl de cellules compétentes (rendues compétentes par traitement au CaCl2) DH5-α dans lesquelles doivent entrer les vecteurs. 30 min dans la glace les vecteurs se fixent aux phospholipides de la paroi. 45 secondes à 42 C la température augmente la fluidité des phospholipides membranaires, les vecteurs entrent dans les cellules 2 minutes dans la glace. 400 µl de SOC (milieu nutritif qui fait repartir les cellules compétentes, restaure le métabolisme et la croissance des bactéries et permet l expression du gène qui code pour la protéine qui dégradera 14

15 l antibiotique. Cette étape permet l expression de la résistance à l antibiotique de sélection, ici l ampicilline) 1 heure à 37 C sous agitation. A la suite de la transformation, on étale le contenu du tube sur une boîte de culture contenant du LB-agar/ampicilline. L ampicilline permet la sélection des bactéries ayant intégré le vecteur recircularisé. L incubation se fait pendant une nuit à 37 C. 5. Minipréparation d ADN : a. Mise en milieu liquide des colonies : Dans une plaque de culture on met 3 ml de mélange LB-ampicilline par puits. On y dépose ensuite un cône ayant été au contact d une colonie obtenue lors de la transformation. On utilise uniquement les colonies obtenues dans les conditions 4 et 5 soient les conditions d intérêt. On répète la manipulation 6 fois pour chaque condition, par souci de reproductibilité (4.1 à 4.6 et 5.1 à 5.6). b. Purification des cultures pour obtenir de l ADN : On prélève 2 ml de chaque culture, que l on centrifuge pour culotter les bactéries et donc éliminer le surnageant. On élimine le surnageant et on re-suspend les bactéries grâce à 250 µl de tampon A1 (contient de la RNAse). Ajout de 250 µl de tampon A2 qui lyse les bactéries puis agitation «douce». Ajout de 300 µl de tampon A3 qui fait précipiter les protéines et l ADN génomique, et laisse donc en suspension l ADN plasmidique d intérêt ; puis agitation «douce». Centrifugation 5 minutes à 11000g. Mise sur colonne d élution de 700 µl du surnageant obtenu (contenant l ADN plasmidique). Centrifugation 1 minute qui lie l ADN plasmidique à la membrane de silice, élimination du filtrat. Ajout de 450 µl de tampon AQ (éthanol) éliminant les sels, puis centrifugation 3min et élimination du filtrat. Ajout de 50 µl d eau qui élue l ADN fixé à la membrane de silice. 15

16 Nous avons donc purifié et récupéré de l ADN plasmidique issu de la transformation. C est la minipréparation. Il faut maintenant vérifier la présence de l insert α2-i dans le plasmide récupéré lors de cette purification. 6. Digestion et migration de contrôle : a. Digestion contrôle : La digestion se fait sur une fraction du produit de purification (5µL). Elle fait intervenir les enzymes BamHI (1 µl) et HindIII (1µL) ainsi que le tampon spécifique (1µL) et de l eau (2µL). La digestion se réalise à 37 C pendant 1 heure. b. Migration de contrôle : Nous faisons migrer le produit de digestion additionné de 2 µl de bleu de charge. Puis passage au BET et révélation grâce à une lampe à UV. Puits 1 Puits 2 à 7 Puits 8 à 14 Marqueur de taille ADN plasmidique 4.1 à 4.6 ADN plasmidique 5.1 à à à

17 Profil de migration des produits de digestion Résultats et perspectives 1. Résultats : Sur le profil de migration obtenu, nous observons que les puits 4.1 à 4.6 ainsi que ceux de 5.1 à 5.6, n ont pas le profil escompté. En effet, nous voyons qu il existe une bande révélée avec un poids apparent de 6000 Da et cela pour tous les puits (sauf le 5.5). Notre vecteur petduet faisant 5420 Da et notre insert 543 Da, nous aurions dû avoir une bande à chacune de ces deux tailles. Cette unique bande visible peut s expliquer, entre autre, par la non digestion du vecteur recombiné, ou une digestion partielle d une seule des deux enzymes produisant un ADN linéaire. Ces profils inattendus ont été obtenus à plusieurs reprises, même en changeant de matrice de ligation. 2. Perspectives : Une fois le clonage dans petduet effectif, nous devrons transférer ce vecteur contenant alpha2-i dans une autre bactérie, la bactérie BL21. En effet, DH5-α avec laquelle nous faisons les transformations est une souche d E.coli qui a la particularité d intégrer facilement de l ADN extérieur, mais elle ne possède pas la polymérase permettant la transcription de α2-i. La souche BL21 possède cette polymérase indispensable pour obtenir la protéine α2-i. Quand la transformation de BL 21 sera réalisée, il suffira de faire produire par la bactérie la protéine α2-i et d isoler cette dernière par purification, puis concentration successives. Nous pourrons ainsi étudier des cristaux de α2-i et comparer sa structure à celle de la protéine α2-i isolée à partir du pilus du Pneumocoque. 3. Complément : Pendant mon stage, j ai effectué ce projet principal mais j ai aussi participé à d autres projets. Ainsi j ai pu mettre en œuvre des tests Elisa, des techniques de Western Blot, ou encore de purifications de protéines par chromatographie. 17

18 Conclusion Sur le stage : Ce stage d un mois au sein du laboratoire a été pour moi une première expérience professionnelle très enrichissante. Cela m a permis d acquérir de nombreuses connaissances théoriques sur les bactéries en général et sur le pneumocoque plus particulièrement. Il m a aussi permis de manipuler et de pratiquer des expériences qui sont quotidiennes dans les laboratoires et donc d utiliser du matériel et des dispositifs qui ne sont pas forcément disponibles à l université à mon niveau d études. Cette expérience m a aussi permis de découvrir et de vivre au sein d un laboratoire pendant un mois et donc d intégrer de nombreuses notions en ce qui concerne le travail de groupe, ainsi que sur le fonctionnement plus pratique d un laboratoire comme le traitement des déchets, l hygiène, la sécurité Sur le dispositif des stages d Excellence : En ce qui concerne le dispositif «Stage d Excellence», je pense que cette expérience, qui est pour la plupart des participants une première expérience, dans un laboratoire ou dans un cadre professionnel est très bénéfique. Ce stage est à mon avis indispensable, même au niveau L1. Ce n est qu en faisant ce type de stage que l on peut réellement établir un premier contact avec le monde professionnel que l on souhaite intégrer et donc affiner ou éliminer certains choix d orientation. Il permet de découvrir un monde dans lequel on peut ou veut ultérieurement travailler. Donc le stage d excellence est un très bon dispositif même au niveau L1. Il conviendrait, pour l améliorer, d augmenter le nombre de propositions de stage et d instaurer un suivi des étudiants stagiaires et une valorisation des acquis. 18