PhotoPhysique des Protéines Fluorescentes (P3F)

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1 PhotoPhysique des Protéines Fluorescentes (P3F) BIO (F. Merola, M. Erard, A. Espagne, H. Laguitton-Pasquier) Spectroscopie d émission de fluorescence résolue en temps CTM (I. Demachy, J. Ridard, B. Levy, G. Vallverdu) Etats électroniques et dynamique moléculaire TEMiC (I. Lampre) Spectroscopie d absorption transitoire CTM (P. Pernot) Analyse Bayésienne des données Objectif de l axe transversal P3F : Compréhension des relations structure dynamique photophysique d un chromophore dans une structure protéique Journées scientifiques LCP 1 février 28

2 Contexte biologique : besoin pour l imagerie de fluorescence Sondes fluorescentes : Intense Coefficient d absorption molaire ( ) Sensibilité environnementale Photosensibilité : Faible Rendement quantique d émission de fluorescence ( ) Faible ou Spécifique élevé De telles sondes idéales n existent pas Amélioration des sondes fluorescentes disponibles (protéines fluorescentes, )

3 La Cyan Fluorescent Protein (CFP) 238 acides aminés 28 g.mol -1 Fluorescence de la GFP dans la méduse Aequorea Victoria 2 Å Structure 3D Chromophore O 2 Å Cavité et réseau de liaisons hydrogènes autour du chromophore N H N N Demachy et al., 25, J. Phys. Chem. B

4 Propriétés d émission de fluorescence de la CFP Faible coefficient d absorption molaire Faible rendement quantique d émission defluorescence Forte sensibilité au ph et à la T Hétérogénéité du spectre d émission Hétérogénéité de la cinétique de désactivation de l état excité PLUSIEURS ETATS EMISSIFS : conformations du chromophore ou de la protéine? répartitions des H +? états électroniques? Spectres distincts Efficacités différentes des processus non radiatifs

5 SOMMAIRE Spectres d émission résolus en temps : relation 1 spectre 1 durée de vie? (Stage Bertrand Cinquin, janv-juin 27) Rôle d une rotation interne au chromophore à l état excité sur sa constante de désactivation (Thèse de Germain Vallverdu)

6 Spectres d émission de fluorescence résolus en temps LOLITA (F. Merola, M. Erard, A. Espagne, H. Laguitton- Pasquier) Luminescence Observation by Laser Induced Transient Analysis Spectroscopie d émission de fluorescence résolue en temps Nbre de photons émis S 1 k ISC Autres états excités Déclin d émission temps Haute résolution temporelle Haute qualité statistique S k r k nr Voies de désactivation non radiative de l état excité (réactions chimiques, rotations internes, isomérisation, ) Analyse Durée (s) de vie de fluorescence F = 1 k r + k ISC + k nr

7 < > (ns) Amplitude Résidus Nombre de coups (u.a)15 Fonction instrumentale 5 Spectres d émission de fluorescence résolus en temps Déclin d'émission 1 15 Temps (ns) 2 25 CFP purifiée, 1 M ; ph 7, ; 2 C Analyse Amplitude i = f( émission ) Distribution de durée de vie ph (ns) Durée de vie moyenne : (A i. i < >= (A i Stage M2 PCM Bertrand Cinquin émission 52 5

8 Amplitude Spectres d émission de fluorescence résolus en temps 1 8 ph (ns) 1 Durée de vie 3 2 1???? État émissif E E 3 E 2 E 1

9 Intensité de fluorescence (u.a.) Spectres d émission de fluorescence résolus en temps 16x Spectre d émission de la CFP émission 55 (nm) 6 i j n Spectres résolus en tps Déclins d émission = f( émission ) Stage M2 PCM Bertrand Cinquin

10 Intensité d'émission de fluroescence (u.a) Intensité d'émission de fluorescence (u.a) Intensité d'émission de fluorescence (u.a) Amplitude (u.a) Amplitude (u.a) Amplitude (u.a) 1 8 ph 6,15 Spectres d émission de fluorescence résolus en temps 1 8 ph 7, ph x (ns) Un état émissif ph (nm) (ns) 11 spectres avec t [ ns, 21 ns] 16x t 8 ph (nm) 16x1-3 Stage M2 PCM Bertrand Cinquin 1 Plusieurs états 12émissifs t (ns) 8 ph 11 5 (nm) 52

11 Spectres d émission de fluorescence résolus en temps Méthode d analyse Maximum d Entropie Analyse Globale Laplace-Bayes (P. Pernot) Modèle Distribution de durée de vie (multiexponentiel) 11 spectres avec t [ ns, 21 ns] Multiexponentiel Exponentielle étirée Nbre de composantes de tps obtenu En cours

12 SOMMAIRE Spectres d émission résolus en temps : relation 1 spectre 1 durée de vie? (Stage Bertrand Cinquin, janv-juin 27) Rôle d une rotation interne au chromophore à l état excité sur sa constante de désactivation (Thèse de Germain Vallverdu)

13 Etude théorique d une rotation intra-chromophore de la GFP Structure chimique du chromophore de la GFP GFP : études théoriques et expérimentales nombreuses Mise en place de méthodologies applicables à d autres Protéines Fluorescentes : CFP Protéines Fluorescentes photoactivables

14 Etude théorique d une rotation intra-chromophore de la GFP = : chromophore plan, conjugué fluorescent = 9 : chromophore twisté non fluorescent (Probabilité de désactivation non radiative importante) Quantification du temps caractéristique de rotation intra-chromophore : Simulations de dynamique moléculaire Echelle de temps? < ns qqs ns >> ns f (GFP) = 3,3 ns Processus en compétition avec l émission de fluorescence Influence sur f Pas d influence sur f

15 Etude théorique d une rotation intra-chromophore de la GFP Paramétrage du champ de force utilisé dans Amber : E p ( ) (kcal/mol) Littérature Amber Energie potentielle intra-chromophore dans le vide 15 (degrés)

16 F( ) (kcal/mol) Etude théorique d une rotation intra-chromophore de la GFP Simulation de dynamique moléculaire à l état excité Energie libre F( ) protéine eau (degrés) Tps caractéristique Dans l eau, géométrie twistée : thermodynamiquement la + stable à l état excité qqs ps Dans la protéine, géométrie twistée non atteinte durant une dynamique moléculaire de 1ns > 1 ns qqs ns? ou >> ns? Changement d échelle de temps simulé (dynamique de Langevin)

17 P3F Réunions régulières Sous-groupe de travail sur l analyse des déclins Thèse de Germain Vallverdu (étude théorique des processus de désactivation non radiatif à l état excité) Recrutement CR2 groupe Bio équipe photobiologie : Agathe Espagne (dimérisation de la CFP) Candidature CR2 : Francesca Ingrosso (Etudes théoriques des protéines fluorescentes : développements méthodologiques et applications à des protéines photoactivables)

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