E. Daudigeos 1, V. Rouffiac 2,3, V. Clayette 4, Paule Opolon 5, G. Vassal 1, N. Lassau 2,3.

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1 CARACTERISATION DE LA CROISSANCE TUMORALE D UN MODELE DE GREFFE ORTHOTOPIQUE DE NEUROBLASTOME METASTATIQUE PAR ECHOGRAPHIE DE CONTRASTE ET BIOLUMINESCENCE. E. Daudigos 1, V. Rouffiac 2,3, V. Claytt 4, Paul Opolon 5, G. Vassal 1, N. Lassau 2,3. 1 UPRES EA 3535, Institut Gustav Roussy, Villjuif 2 Laboratoir d Imagri du Ptit Animal, Institut Gustav Roussy, Villjuif 3 UPRES EA 4040, Univ Paris-Sud, Orsay F-91405, Institut Gustav Roussy, Villjuif, F INSERM U790, Institut Gustav-Roussy, Villjuif 5 UMR 8121, Institut Gustav-Roussy, Villjuif

2 Introduction L nuroblastom st l un ds tumurs solids ls plus fréqunts chz l nfant. Dans 60% ds cas, il y a ds métastass dès l diagnostic. La détction d cs métastass st ssntill car lurs présncs conditionnnt l pronostic, t lur évolution sous chimiothérapi st un élémnt fondamntal pour ls décisions théraputiqus ultériurs. L étud d cs cancrs métastatiqus impliqu la nécssité : 1/ d établir ds modèls animaux prmttant d rproduir puis d analysr in situ ls procssus à l origin d la prolifération tumoral ; 2/ d découvrir t dévloppr ds théraputiqus anti-angiogèns, afin d limitr voir stoppr l évolution d la maladi. Dans ls dux cas, ls tchniqus d imagri in vivo sont donc ds outils d évaluation ssntils. Objctif d l étud L objctif d la présnt étud a été d évalur in vivo la cinétiqu d croissanc d un modèl métastatiqu d nuroblastom simultanémnt par échographi d contrast t par bioluminscnc.

3 Modèl tumoral Après incision d la paroi abdominal gauch, clluls d la ligné IMR32-GFP-Luc ont été dirctmnt injctés dans la surrénal d 9 souris (J0). La ligné sauvag IMR32 a été génétiqumnt modifié d sort à xprimr la Grn Fluorscnt Protin (GFP) t la Luciféras (Luc) pour détction d l xprssion tumoral n bioluminscnc t n fluorscnc.

4 Protocol n bioluminscnc Examn ds animaux pndant 2 mois, un fois/smain dès J8 après la grff. L suivi n bioluminscnc a été conduit sur un IVIS 50 (Xnogn) slon l protocol ci-dssous : 1- injction d 10 µl/g d un solution d luciférin préparé à la concntration d 15 mg/ml 2- maintin ds animaux n position décubitus vntral sous ansthési par isofluran dans la chambr d acquisition d l IVIS50 3- nrgistrmnt, 5 mn après injction d la luciférin, du signal bioluminscnt au nivau d la tumur primair t ds évntulls métastass détctés. Ls donnés ont été traités a postriori sur un logicil dédié prmttant d quantifir l nombr d photons émis au sin d un région d intérêt défini par l opératur comm étant la tumur t ss évntulls métastass.

5 Protocol n échographi (1/2) L lndmain ds xamns n bioluminscnc, ansthési ds animaux par inhalation d isofluran afin d êtr xaminés avc un échograph ATL HDI5000 (Philips Ultrasound) équipé d un sond linéair 12 MHz. L protocol pour chaqu xamn a été l suivant : 1- n mod B SonoCT : localisation d la gland surrénal t msur ds dimnsions (longuur : L ; profondur : P) sur la coup longitudinal maximal pour l calcul du volum suivant la formul : Volum = ( L x P 2 ) /2 2- n mod harmoniqu par invrsion d phas (IM=0.16) : nrgistrmnt d la cinétiqu d pris d contrast après injction d 100 µl d Sonovu n sinus rtro-orbital. Ls donnés (raw datas) ont été nrgistrés sur un échll linéair avant lur comprssion logarithmiqu pour lur rprésntation sur l écran d visualisation d l échograph.

6 Protocol n échographi (2/2) Ls donnés échographiqus ont été traités a postriori ds xamns sous l logicil HDILab afin d calculr l intnsité moynn ultrasonor intra-tumoral définissant la courb d pris d contrast. Sur cs courbs d priss d contrast, dux indics ont été quantifiés manullmnt : L rhaussmnt maximal défini comm la différnc d intnsité (Imax- I0) où : Imax= maximum d intnsité I0 = intnsité avant l arrivé du produit d contrast dans la tumur L tmps d monté défini comm l tmps pour attindr l maximum d rhaussmnt dpuis l arrivé du produit d contrast dans la tumur

7 Résultats : Volum tumoral Valurs médian t moynn Courbs individulls Volum tumoral (mm3) Volum tumoral (mm3) Jour après grff Jour après grff Un croissanc tumoral a pu êtr mis n évidnc dans 83.3% ds cas. L volum moyn détcté n échographi a augmnté d 3.5 à 1062 mm 3 ntr J7 t J62.

8 Résultats (1/3) Confrontation ds volums msurés n échographi (fig.1) t du signal bioluminscnt (fig.2) diffusé par ls clluls tumorals ntr J13 t J56 pour un souris. J14 J24 J28 J49 J56 Figur 1 J13 J20 J27 J46 J55 Figur 2 Signal bioluminscnt (ss unité) 1,E+09 1,E+09 t n s c 1,E+09 in m8,e+08 lu io b 6,E+08 l a n 4,E+08 ig S 2,E+08 0,E Jour après grff

9 Résultats (2/3) Evolution du rhaussmnt t du tmps d monté moyns (figs. 4 t 5) au cours du tmps pour un souris ntr J14 t J56. C signal a été quantifié à partir ds acquisitions n imagri échographiqu d contrast (fig.3). avant J14 avant J28 avant J49 avant J56 pndant pndant Figur 3 pndant pndant 10 6 Rhaussmnt (db) ) B (d t n m s u a h R Jour après grff Jour après grff Figur 4 Figur 5 Tmps d monté (s) ) (s té n o m d s p m T Jour après grff Jour après grff

10 Résultats (3/3) Ls résultats obtnus sur l nsmbl d la cohort montrnt qu : 1- la pris tumoral st confirmé systématiqumnt n échographi t n bioluminscnc 2- ls paramètrs, issus ds signaux bioluminscnt t échographiqu, sont modifiés au cours du dévloppmnt tumoral 3- bin qu ls volums détctés n échographi continunt d augmntr, ls signaux ultrasonor t bioluminscnt décroissnt (plus précocmnt n échographi), probablmnt dû au dévloppmnt d la nécros intra-tumoral.

11 Conclusion La bioluminscnc st complémntair d l échographiqu prmttant un imagri corps ntir d l animal plus adapté pour la détction ds métastass. L échographi d contrast prmt, quant à ll, un caractérisation ds modifications d la prfusion au cours du dévloppmnt tumoral via ds paramètrs plus dirctmnt rliés à la physiopathologi ds tumurs. L association d cs dux tchniqus prmt un caractérisation in situ du dévloppmnt tumoral d un modèl orthotopiqu d nuroblastom t d son potntil métastatiqu.

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