Optique : applications Introduction

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1 Optique : applications Introduction I. Introduction Au premier semestre nous avons abordés l'optique géométrique, nous avons vu les lois de Snell Descartes qui décrivent comment la lumière est réfléchie et réfractée. Cela nous a conduit à l'étude de la propagation de la lumière à travers une lentille mince convergente ou divergente. Dans le cours de physique appliquée nous allons nous servir de ces bases pour considérer les applications de l'optique en biologie. Nous verrons que l'œil est un système optique qui peut être étudié à partir de considération d'optique géométrique. Puis nous nous intéresserons à la structure du microscope qui est sans doute l'un des outils les plus fondamentaux du biologiste. Dans une dernière partie nous nous intéresserons aux méthodes de spectroscopies. Ce domaine est trop vaste pour que nous puissions l'aborder dans ce cours de manière exhaustive, nous décrirons donc quelques exemples simples. II. Rappels A. Interaction lumière matière La lumière peut être réfléchit, absorbée ou réfractée par le milieu matériel dans lequel elle se propage. Dans la plupart des cas c'est une combinaison des trois mécanismes qui se produit. 1

2 Figure 1 : Réflexion, Réfraction et Absorption de la lumière à la transition entre deux milieux différents. B. Les lois de Snell-Descartes Les deux lois de Snell-Descartes décrivent respectivement la réflexion et la réfraction d'un rayon sur une surface incidente. (a) (b) Figure 2 : Trajectoire d'un rayon réfléchit (a) et d'un rayon réfracté (b) La première loi énonce que lors d'une réflexion, l'angle incident est égal à l'angle réfléchit : i = r (1) Où i et r sont respectivement les angles d'incidence et de réfraction. La seconde loi énonce que lors d'une réfraction la valeur de l'angle réfracté est définit par l'équation : n i sin i = n r sin r (2) Où n i et n r sont respectivement les indices optiques des milieux incident et réfractant. Attention! Les angles sont toujours pris entre la normale à la surface considérée et le rayon. 2

3 C. Formation des images (a) (b) Figure 3 : Trajectoire des rayons lumineux à travers une lentille convergente (a) et divergente (b) Les trois règles à retenir quel que soit le type de lentille sont : Un rayon incident parallèle à l'axe optique passera par le foyer objet de la lentille Un rayon incident qui passe par le centre de la lentille ne sera pas dévié Un rayon incident passant par le foyer image de la lentille sortira parallèle à l'axe optique D'un point de vue analytique nous retiendrons la formule de conjugaison des lentilles : (3) Le grandissement d'une lentille est donné par la formule : (4) III. L'Œil Figure 4 : Anatomie de l'œil Les éléments transparents de l œil humain (cornée, humeur aqueuse, cristallin, corps vitrée) constituent un système optique convergent qui permet la formation d une image nette sur une surface 3

4 sensible, la rétine. La lumière qui rentre dans l œil subit trois réfractions, chacune avec un effet convergent. Il est donc possible de simuler un œil par une lentille convergente, c'est qui est fait dans certains montages optiques pour pouvoir projeter une image sur un écran. La cornée permet de protéger l'œil. La pupille est tout simplement le trou par lequel la lumière passe pour pénétrer dans l'œil et toucher la rétine. La taille de la pupille est maitrisée par la présence de l'iris (partie colorée de l'œil) qui s'ouvre lorsque l'éclairage est faible et se ferme quand l'intensité lumineuse augmente. La lumière passe ensuite par le cristallin qui est la véritable lentille convergente de l'œil. La lumière pénètre ensuite dans l'œil pour toucher la rétine où des récepteurs photochimiques vont transformer l'information lumineuse en signale chimique. C'est ce signal qui est perçu par le nerf optique qui communique avec le cerveau. La fovéa est une petite zone de la rétine particulièrement riche en récepteurs. La possibilité qu'à l'œil de bouger à l'intérieur de son orbite permet à la lumière d'impressionner particulièrement la fovéa plutôt que d'autres zones de la rétine. A. Accommodation La vision d un objet se fait en premier lieu par la formation d une image nette sur la rétine où résident un grand nombre de cellules sensibles à la lumière. Les liquides qui remplissent l œil ont des indices de réfraction plus élevés que l air (cornée, humeur aqueuse n = 1,34, cristallin n = 1,42, humeur vitré n = 1,34) et agissent comme des lentilles convergente en raison de leur forme convexe. La distance entre les éléments optiques et le fond de l œil où l image est formée est cependant fixe (environ 22 mm entre le cristallin et la rétine). Pour pouvoir former une image nette d objets situés à distances différentes, il faut que l œil accommode, c est à dire qu il change de distance focale. Cela est assuré par l action des muscles oculaires qui déforment le cristallin en changeant sa courbure et ainsi sa distance focale. La distance focale de l ensemble de l œil change et s adapte à la nouvelle distance. Cette action musculaire est l'accomodation. B. Champ Le champ de l œil est le volume dans lequel l œil est capable de faire la mise au point. Sur l axe optique on distingue le punctum proximum, point le plus proche où l œil peut produire une image nette en accommodant au maximum, et le punctum remotum, point le plus éloigné auquel l œil peut produire une image nette sans accommoder. Pour un œil normale on considère que le punctum proximum se situe à une distance d environ 25 cm, tandis que le punctum remotum se situe à l infini. L image donnée par l œil doit tomber sur la fovéa, la partie la plus sensible de la rétine, située sur l axe optique de l œil. Etant données les dimensions de la fovéa, l œil voit sous un angle d à peine 1 degré. 4

5 C. Défauts de la vision (a) (b) (c) (d) Figure 5 : La myopie (a), l'hypermétropie (b), la presbytie (c) et l'astigmatisme (d) (http://www.drcoullet.com/) Un œil myope est un œil trop convergent : le punctum proximum est situé à moins de 25 cm et le punctum remotum est situé à une distance finie. Ce défaut est corrigé par une lentille divergente. Un œil hypermétrope est un œil qui n est pas assez convergent : le punctum proximum est situé à plus de 25 cm et il faut accommoder pour voir un objet situé à l infini. Ce défaut est corrigé par une lentille convergente. La presbytie est la diminution de la capacité d accommoder en raison de la perte de souplesse du cristallin. Le punctum proximum s éloigne et il faut corriger par une lentille convergente la vision de près. 5

6 IV. Microscope 7 Figure 6 : Schéma du microscope et sa modélisation optique Un microscope est constitué de deux systèmes optiques centrés c est à dire ayant le même axe optique : l objectif et l oculaire. Pour la compréhension du principe de fonctionnement du microscope les deux systèmes optiques peuvent être assimilés à deux lentilles minces convergentes. L objectif est un système optique de distance focale faible (généralement autour de 2 mm) qui donne une image réelle fortement agrandie de l objet. L image fournie par l objectif est formée au foyer objet de l oculaire (distance focale environ 15 mm) ou légèrement plus près pour en obtenir une image virtuelle à l infini. La distance entre le foyer image de l'objectif et le foyer objet de l'oculaire et est appelée longueur optique du microscope. Pour tracer la trajectoire d'un rayon lumineux à travers un microscope (c est-à-dire l'agencement de deux lentilles convergentes) il faut agir en deux étapes. On trace d'abord l'image de l'objet par l'objectif. Puis cette image devient l'objet de l'oculaire. Un exemple est présenté sur la figure 7. 6

7 Figure 7 : Trajet de la lumière à travers un microscope. Ici l'image de AB est formée au foyer objet de l'oculaire si bien que l'image est formée à l'infini, elle est donc virtuelle. A. Latitude de mise au point L écart entre la position de l objet donnant lieu à une image située au punctum remotum et celle donnant lieu à une image située au punctum proximum de l observateur est appelée latitude de mise au point. La latitude de mise au point est la mesure de l intervalle des positions de l objet qui permettent la formation d une image nette. L'expression de la latitude de mise au point est : (5) Avec et d m = 25 cm 7

8 B. Puissance Figure 8 : Les angles importants dans la trajectoire des rayons lumineux. La puissance P du microscope est définie comme le rapport entre l angle α' sous lequel l image est vue à travers l oculaire et la taille de l objet : (6) La puissance intrinsèque Pint du microscope est la puissance calculée dans les conditions de formation de l image à l infini par l oculaire. C. Grossissement Le grossissement G pour un microscope est le rapport entre l angle α' sous lequel l image formée à l infini est vue à travers l oculaire et l angle α sous lequel l objet est vu, sans microscope, quand il est positionné au punctum proximum de l œil. G (7) Le grossissement commercial est défini comme : (8) V. Spectroscopies A. Introduction La spectroscopie est un ensemble de techniques expérimentales qui étudie l absorption, l émission ou la diffusion de la lumière par un échantillon. Le terme spectroscopie rassemble 8

9 en outre l absorption, l émission ou la diffusion par un échantillon des neutrons ou des électrons. Dans une expérience de spectroscopie d absorption ou de diffusion, une source de lumière éclaire un échantillon, dans une expérience d émission l échantillon est excité par une décharge électrique, de la chaleur ou même de la lumière. Dans tous les cas, la radiation provenant de l échantillon est détectée, enregistrée et analysée. En biologie, les principales techniques spectroscopiques utilisées sont : Emission : la fluorescence Absorption : l'uv-visible, Infra-Rouge (IR) Diffusion : De plus en plus la diffusion Raman Il existe d'autres types de spectroscopies le plus souvent non optique telles que la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN), la spectroscopie de plasmons de surface, la spectroscopie de masse. La RMN est extrêmement rependue dans l'étude du protéome. Il faudrait sans doute plusieurs séances pour en décrire les mécanismes, je renvoie donc les étudiants vers les liens internet pour de plus amples informations. La spectroscopie de masse est également un grand classique des laboratoires de biologie. Il s'agit de fragmenter des molécules et de remonter à leur composition en analysant la masse de chaque fragment. La spectroscopie de plasmon de surface a fait son entrée dans les laboratoires de biologie il y a quelques années et est devenue extrêmement populaire. Elle permet de mesurer le degré d'affinités entre différente protéines. B. La fluorimétrie La fluorescence est un phénomène qui apparait lorsqu'un matériau émet de la lumière après avoir reçu une excitation lumineuse. Il ne faut pas confondre fluorescence et phosphorescence. Dans ce dernier cas, l'émission lumineuse continue bien après que l'excitation ait cessé. La chimiluminescence décrit quant à elle le phénomène d'émission lumineuse au cours d'une réaction chimique. 9

10 Figure 9 : Principe de la fluorimétrie En pratique, la fluorimétrie nécessite une instrumentation telle que celle décrite sur la figure 9. Une source de lumière monochromatique arrive sur l'échantillon. L'émission de fluorescence est alors détectée, soit directement par un système d'imagerie soit par une caméra CCD munie d'un filtre qui permet de mesurer la longueur d'onde d'émission de fluorescence. Certains composés biologiques sont naturellement fluorescents (environ 5 à 8%). Cependant, dans la majorité des cas, la molécule biologique d'intérêt est chimiquement modifiée pour être attachée à un fluorophore. Ces composés chimiques dérivent le plus souvent d'une protéine fluorescente : la GFP (Green Fluorescent Protein) qui donne aux méduses leur aspect. La modification de la GFP a permis d'obtenir des fluorophores émettant dans de nombreuses longueurs d'ondes (figure 10). Figure 10 : A gauche la protéine GFP et à droite les fluorophore auxquels elle a donné naissance (http://www.tsienlab.ucsd.edu/images.htm) La fluorimétrie est utilisée de deux principales manières : La fluorimétrie à rapport de fluorescence. Dans ce cas, la fluorescence est observée à une longueur d'onde donnée et comparée à un étalon. La spectrofluorimétrie, où le spectre entier de fluorescence est enregistré 10

11 L'application principale de la fluorimétrie est le dosage de certains composés chimiques. C'est ce qui est fait dans les tests ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Une solution (sang, urine, salive ) est passée sur une surface décorée par un anticorps spécifique. Pour savoir si un antigène a été capté par l'anticorps on rince l'échantillon puis on le soumet à une solution d'anticorps. Enfin, un anticorps anti-anticoprs est injecté. Ce dernier anticorps est marqué par un fluorophore. Il ne sera attaché à la surface que si un antigène a été détecté. L'intensité lumineuse sera donc directement liée à la quantité d'antigènes détectée. VI. Spectroscopie UV-visible Le principe de la spectroscopie UV-visible est d'éclairer avec un rayonnement monochromatique de longueur d'onde variable une solution contenant une molécule d'intérêt. Les longueurs d'ondes parcours de manière continue tout le spectre du proche ultra-violet et du visible. Une solution témoins ne contenant pas cette molécule est éclairée simultanément (figure 11). A l'issue de ce trajet lumineux les rayons issus de l'échantillon et du témoin sont comparés. On en déduit un spectre caractéristique de la molécule étudiée. Figure 11 : Principe de la spectroscopie UV-visible Cette technique est essentiellement utilisée pour doser une molécule dans une solution. Il est possible d'établir une courbe d'étalonnage (cf. TD) à partir d'une solution dont la concentration est connue puis de comparer la valeur donnée par l'échantillon à la courbe d'étalonnage. Une deuxième technique consiste à utiliser la loi de Beer-Lambert. Elle indique que l'absorbance d'une solution à une longueur d'onde donnée est proportionnelle à sa concentration et la distance parcouru par la lumière dans celle-ci. 11

12 A est l'absorbance à la longueur d'onde l, est le coefficient d'extinction molaire (l.mol -1.cm -1 ), l est la longueur du trajet optique dans la solution d'intérêt et C est la concentration de la solution. La loi de Beer Lambert est donc extrêmement utile à condition de connaître le coefficient d'extinction molaire. Dans certains cas, celui-ci est connu. Il faut tout de même se méfier des sources bibliographiques, car ce coefficient dépend de la température ou du solvant dans lequel se trouve la molécule à doser. Dans les cas où il n'est pas connu, il faut utiliser une courbe d'étalonnage pour le retrouver! VII. Spectroscopies IR et Raman Les spectroscopies Infra Rouge et Raman sont deux techniques de spectroscopies vibrationnelles. La spectroscopie IR est d'avantage utilisée dans les laboratoires de biologie. Le principe des deux spectroscopies est le même : le rayonnement incident sur la molécule va entrainer une vibration de la molécule. Dans le cas de la spectroscopie IR, cette vibration entraine l'absorption de certaines longueurs d'ondes. Dans le cas de la spectroscopie Raman, la lumière ne n'est pas absorbée mais ressort de la molécule avec une longueur d'onde différente. On dira qu'elle a été diffusée. Dans les deux cas, le spectre récolté est une signature de la molécule. Autrement dit, il est théoriquement possible de déterminer avec exactitude la composition d'une solution inconnue à partir de ses spectres IR ou Raman. Le tableau de la figure 12 permet de comparer les avantages et les inconvénients de chacune des deux spectroscopies. Les spectres des molécules biologiques sont souvent extrêmement complexes car les modes de vibrations sont très nombreux. Cela dit, il est possible grâce à différents traitements numériques de savoir exactement de quoi est composée une solution. Raman Est due à la diffusion de la lumière par des molécules en vibration Une vibration est visible en Raman si elle entraine un changement de polarisabilité. La molecule doit posséder un moment dipolaire permanent. L'eau peut être utilisée comme solvent La preparation de l'échantillon est quasiment nulle. Tous les types d'échantillon peuvent être étudiés Donne une indication sur les liaisons covalentes. IR Est due à l'absorption de la lumière par des molécules en vibration. Une vibration est visible en IR si elle entraine un changement de moment dipolaire. La vibration en question doit avoir un changement de moment dipolaire dû à la vibration. L'eau ne peut pas être utilisée car elle absorbe trop. La preparation des échantillons est complexe. Les gaz ne peuvent pas être étudiés Donne une indication sur les liaisons ioniques. 12

13 Un spectrometer Raman coute entre Un spectromètre IR coute quelques milliers d' et Figure 12 : Tableau de comparaison des techniques Raman et IR. (http://www.chemvista.org/ramanir4.html) 13

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