Responsable scientifique: Petronela Ancuta Responsable technique: Dominique Gauchat

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1 Responsable scientifique: Petronela Ancuta Responsable technique: Dominique Gauchat

2 Analyse de cellules: Jusqu à 16 paramètres 1 LSR II 4 lasers (4V-2B-5Y-3R) 16 paramètres (14 couleurs) 2 LSR II 3 lasers (2V-5B-3R) 12 paramètres (10 couleurs) Les cytomètres sont disponibles tous les jours 24h sur 24h en libre service sur réservation pour les utilisateurs formés. La réservation se fait sur le site GRR/Plateforme. Ils peuvent aussi être utilisés avec l assistance de la responsable de la plateforme, sur rendez-vous.

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4 Quelles informations un cytomètre peut-il nous donner sur une cellule Sa taille relative (lumière diffractée, Forward scatter - FSC) Sa granulosité ou sa complexité interne relative (lumière réfléchie, Side Scatter - SSC) SSC Détecteur latéral de lumière Mesure de la compléxité cellulaire Source de lumière incidente Détecteur frontal de lumière Mesure de la taille de la cellule FSC

5 SSC Granulocytes Lymphocytes Monocytes FSC

6 Quelles informations un cytomètre peut-il nous donner sur une cellule Son (ou ses) intensité(s) de fluorescence relative(s) FITC FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC FITC FITC FITC Log scale of Fluorescent Intensity

7 Applications scientifiques Immunophénotypage anticorps couplés à des fluorochromes Détection-quantification de cellules exprimant une protéine fluorescente Infection, transfection, activation d un promoteur spécifique GFP, YFP, m-cherry, etc

8 Applications scientifiques Détection de protéines intracellulaires et intranucléaires anticorps couplés à des fluorochromes inhibiteurs de sécrétion, fixation, perméabilisation T regs (Foxp3) Th1 /Th2/Thxx (cytokines) Études de voies de signalisation Phosflow Anti phospho-protéines

9 Apoptose nécrose Annexin V - 7AAD PI Applications scientifiques Interactions de protéines - FRET P1 P2 P2 P1 YFP CFP CFP YFP 475 nm

10 Applications scientifiques Mesures de la prolifération cellulaire Dye dilution: CFSE CellTrace violet DNA incorporation: BrdU EdU (Click-it Plus Edu) anti-ki67 Études du cycle cellulaire PI (DAPI) -Vybrant DyeCycle stains

11 Applications scientifiques Quantifications de cytokines CBA Secretion assay

12 Applications scientifiques Mesures du stress oxydatif DHE - CellROX Deep Red Mesures du potentiel de membrane mitochondriale ( ψ ) JC-1

13 Logiciels d analyse de données: BD FACSDiva 6 et 7 Statistiques, rapport, FlowJo (PC) (phénotype - cycle cellulaire prolifération) Statistiques, rapports, présentation graphiques diverses, superpositions, etc BD FCAP Array (CBA) ModFit LT (cycle cellulaire - prolifération)

14 Tri cellulaire Tri en haut débit (50 millions cells /h) Jusqu à 4 sous-populations de cellules infectieuses ou non Tri effectués par la responsable de la plateforme, sur rendez vous 1 BDAria IIu (2V-5B-3R) 3 Lasers -12 paramètres (10 couleurs) 1 BDAria IIu au NC3 (2V-5B-2R) 3 Lasers - 11 paramètres (9 couleurs) ACDU (Automated Cell Deposition Unit)

15 Les deux ARIA II sont dans des hottes biologiques, les tris sont donc faits dans des conditions aseptiques

16 Applications scientifiques Tri pour mise en culture des sous-populations pour différentes études comparatives. Purification d ARN pour microarrays ou RT-PCR depuis des cellules purifiées. Préparation de cellules pour injecter des souris Isolation de lymphocytes infiltrant des tumeurs.

17 Tri de cellules reconnaissant un complexe CMH-peptide donné Clonage Clonotypage Applications scientifiques 1,6% Tri en plaques de 1 cellule par puits Clonage 99,2% Tri pour isolation/purification de cellules transfectées ou de cellules ayant un ARN rendu silencieux par sh RNA Tri pour préparation de protéines pour western-blot depuis des cellules purifiées

18 Séparations immunomagnétiques 2 RoboSep, dont un dans le NC3, placés dans des hottes biologiques sont à disposition pour enrichir vos populations cellulaires. Le RoboSep permet l automatisation des séparations immunomagnétiques en utilisant les réactifs de StemCell technologies Ces appareils sont actuelllement en libre service sous certaines conditions et vous devez fournir vos réactifs.

19 Les performances de nos cytomètres sont contrôlées régulièrement grâce au logiciel CS&T et aux billes qui y sont liées. La linéarité, l efficacité des détecteurs, le bruit de fond optique et le bruit électronique sont mesurés puis leur évolution est suivie au cours du temps. Pour chaque détecteurs de fluorescence ce logiciel va vérifier et ajuster ces paramètres permettant ainsi de toujours travailler dans des conditions optimales. Ce suivi permet aussi de visualiser rapidement les défaillances de nos appareils et d y remédier.

20 Les services offerts par la plateforme de cytométrie du CRCHUM permettent de réaliser des protocoles de recherche dont les résultats sont publiés dans des journaux scientifiques de renommée internationale. Veillette M et al Interaction with Cellular CD4 Exposes HIV-1 Envelope Epitopes Targeted by Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity JVI 2014 Bernier A et al Transcriptional profiling reveals molecular signatures associated with HIV permissiveness in Th1Th17 cells and identifies Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma as an intrinsic negative regulator of viral replication. Retrovirology 2013 Wacleche VS et al The colocalization potential of HIV-specific CD8+ and CD4+ T-cells is mediated by integrin β7 but not CCR6 and regulated by retinoic acid PLoS One 2012 Monteiro P et al Memory CCR6+CD4+ T cells are preferential targets for productive HIV type 1 infection regardless of their expression of integrin β7 J Immunol. 186: Pelletier S et Al Increased degranulation of natural killer cells during acute HCV correlates with the magnitude of virus-specific T cell responses J Hepatol Said, E.A. et al. Programed death-1-induced interleukin-10 production by monocytes impairs CD4+ T cell activation during HIV infection. Nat Med. 16, (2010). Gosselin, A. et al. Peripheral blood CCR4+C CR6+ and CXCR3+CCR6+CD4+ T cells are highly permissive to HIV-1 infection. J Immunol. 184, (2010). Chomont, N. et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nat Med. 15, (2009). Fontaine, J. et al. HIV infection affects blood myeloid dendritic cells after successful therapy and despite nonprogressing clinical disease. J Infect Dis. 199, (2009). Badr, G. et al. Early interferon therapy for hepatitis C virus infection rescues polyfunctional, long-lived CD8+ memory T cells. J Virol. 82, (2008). Lajoie, J. et al. Differences in immunoregulatory cytokine expression patterns in the systemic and genital tract compartments of HIV-1-infected commercial sex workers in Benin. Mucosal Immunol. 1, (2008). Van Grevenynghe, J. et al. Transcription factor FOXO3a controls the persistence of memory CD4(+) T cells during HIV infection. Nat Med. 14, (2008).

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22 Questions? Contacts Dominique Gauchat, PhD, poste Petronela Ancuta, PhD, poste 35744