Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour les ARN interférents et des microarn
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- Yolande Ratté
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1 Mise au point de vecteurs permettant une expression fiable de gènes codant pour les ARN interférents et des microarn Coordinateur-Equipe 1: Fabienne LE PROVOST, LGbC Equipe 2: Geneviève JOLIVET, BDR, Equipe 3: Hubert LAUDE, VIM, INRA, Jouy-en-Josas
2 But du projet Définir la meilleure stratégie de vecteur pour produire un ARN interférent en transgénèse permettant l inhibition d un gène cible.
3 Modèles d étude Gène IE18 (immediate-early gene) du virus de la maladie d Aujeszky. Gène Prnp impliqué dans les maladies à Prion.
4 ARN interférent Petits ARN simples brins nt Induit inhibition d un gène cible Soit dégradation de l ARNm si appariement parfait Soit inhibition de le traduction si appariement imparfait Issue de Structure en épingle à cheveux shrna : artificiel U6 promoter 21 nt sense 21 nt antisense TTTTT microarn : endogène prémir UGAAG A UC G C CGGAAUUCCG GGCUUUGGUGG CUACAUGUUCU C GGC CCGGAACCACC--GAUGUACGAGG A CCUAUAG C GUAGAC
5 Construction d un transgène Le promoteur : Type pol III : fort, ubiquitaire, production de shrna Exemples : U6, H1 Type pol II : tissus spécifiques, polyadénylation, production de microarn Le transgène : ARN interférent : shrna (seul, + 5T) microarn La cible : 3 UTR ou codant pol II cell Tg shr mir Auj PrP Auj PrP pol III cell Tg
6 Promoteur pol III : U6 shrna promoteur U6 shrna pol II pol III cell Tg cell X Tg shr mir Auj PrP Auj PrP Vecteur M1 isolateur Promoteur EF1α Intron - Activateur de transcription terminateur promoteur IE IRES luciférase PCH11 β-galactosidase + RNAi promoteur IE IRES luciférase xpch11 β-galactosidase RNAi 12 1 % d inhibition du gène IE 8 (luciférase/β-galactosidase) 6 4 Inhibition > à 9% 2 M pu6-shrna pbs-u6- RNAi M1-BsaBI- RNAi M1-BssHII- RNAi M1-AatII- RNAi
7 Promoteur pol III : U6 Transgénèse pol II pol III cell Tg cell X Tg X shr mir Auj PrP Auj PrP shrna promoteur U6 1 2 shrna 3 Vecteur M1 isolateur Promoteur EF1α Intron - Activateur de transcription terminateur M1-pU6- shrna : 3 animaux TG sur 18 analysés: pas d expression de shrna, transgène tronqué.
8 Promoteur pol III : U6 pol II pol III cell Tg shr mir Auj PrP Auj PrP cell X X Tg X X FPR pcmv GFP pu6 shrna antiprp Vecteur PrP ovin Promoteur Prnp souris E1 Intron 1 3 UTR Prnp souris ORF Prnp ovin In vitro : Inhibition protéique > 8% En transgénèse : pas inhibition (7 lignées)
9 Moutons transgéniques obtenus à l aide de lentivirus porteur d un shrna anti PRP Construct RNAi GFP Injected Blastocysts Transferred Born 27 5 Transgenic 1 2 6, Not diluted Sheep blood PrPC levels 1:5 dilution 1:1 dilution 5, PrPc levels ( pg) 4, 3, 2, 1, 6min 12min, D D5-325 Samples D5-416 D D D1-325 D1-416 D Collaboration avec Bruce WHITELAW, Roslin Institute,
10 Promoteur pol II : EF1α promoteur U6 shrna A ou TTTTTshRNATTTTT B pol II pol III shr mir Auj PrP Auj PrP cell X Tg X cell X X Tg X X Vecteur M1 isolateur Promoteur EF1α Intron - Activateur de transcription terminateur 12 % d inhibition du gène IE (luciférase/β-galactosidase) A B M1 M1-AatII-RNAi M1-pU6- M1-5T-RNAi shrna En transgénèse: 5T-shRNA-5T dans M1 : 2 animaux TG sur 15 analysés: pas d expression, transgène tronqué.
11 Promoteur pol II : EF1α Hsa-mir-3a A GAGUG GUCAU C GCG CGU promoteur U6 shrna A A OU UC CCGACGAUCCUUUUG ACUUCA CU A GUG GGCUGCUAGAGAAAC UGAAGU GG CAC C -- GUAGA C 3 A G pol II pol III shr mir Auj PrP Auj PrP cell X X Tg X cell X X Tg X X D Vecteur M1 isolateur Promoteur EF1α Intron - Activateur de transcription terminateur % d inhibition du gène IE (luciférase/β-galactosidase) Quantification des RNAi par PCRQ (RNAi/βgal) A D 1 5 A D M1-pU6- M1 M1-AatII-RNAi M1-miRNA shrna M1 M1-AatII-RNAi M1-pU6- mirna 3 shrna
12 A Luciferase/β-gal (%) Inhihitionof IE mrna sirna/β-gal (arbitrary units) Effet de la 4quantité de shrna / cible 4 2 pm1 U6-sh mirna B sirnaexpression pm1 U6-sh mirna C Luciférase/β-gal (%) , sirna/β-gal (arbitrary units) U6-Sh (ng plasmid/well) Corrélation entre le niveau de shrna exprimé et le niveau d inhibition de la cible
13 Promoteur pol II : EF1α En transgénèse : mir dans M1 : 7 lignées sur 5 animaux dont 2 transmettent et expriment le Tg. pol II pol III shr mir Auj PrP Auj PrP cell X X Tg X X cell X X Tg X X Line 15 Line 31 B L B L CHO 1 pb 2 pb mirna B: brain, L: liver mirna quantification Challenge Total mice alive control 24 7 L B L L B L B L Line 15 Line 31 days of weigth loss before death Let7c control L15 *p<,4 *
14 Promoteur pol II : PrP M13 pprp Pré-miRNA antiprp pol II pol III shr mir Auj PrP Auj PrP cell X X X Tg X X X cell X X Tg X X Vecteur PrP ovin Promoteur Prnp souris E 1 Intron 1 3 UTR Prnp souris ORF Prnp ovin Lignées transgéniques : Obtention de 8 lignées : 4 expriment le Tg à des niveaux variables
15 Promoteur pol II : PrP pol II pol III shr mir Auj PrP Auj PrP cell X X X Tg X X X cell X X Tg X X Détection du mirna mature par RT-PCR quantitative. Détection du mirna produit par la construction M13 dans le cerveau de 3 lignées de souris transgéniques QRT-PCR GenoGnome - Western blot Quantification de la diminution du transcrit (QRT-PCR) et de la protéine (Western blot) PrP observée dans les différentes lignées de souris M13. F+/- : souris contrôle FVB/N Prnp+/-.. F+/
16 Différentes régions cibles RNAi choisis sur la partie traduite ASSR1 SH RNAi choisis sur la partie non traduite 3 UTR RNAi-3 UTR RNAi-3 UTR
17 % d inhibition du gène IE (luciférase/β-galactosidase) Quantification des RNAi par PCRQ (RNAi/βgal) % 1 8 SH M1 SH 1/1e SH 1/1e SH 1/1e SH 1/1e SH 1 SH 4 M1 SH 1 SH 1/1 SH 1/1e % ASSR M1 A 1/1e A 1/1e A 1/1e A 1/1e A 1 M1 A 1 A 1/1 % 1 8 RNAi-3 UTR M1 3'UTR 1/1e 3'UTR 1/1e 3'UTR 1 M1 3'UTR 1 3'UTR 1/1 3'UTR 1/1
18 Inhibition en présence de 2 ARN interférents: Luciferase/β-galactosidase M1 RNAi-3'UTR 1 ng M1 1 ng ASSR1 1ng ASSR1 1ng SH 1 ng SH,1 ng
19 Perspectives Obtention de Souris Tg M1-RNAi-3 UTR sur fond sauvage. Ces souris seront croisées avec les souris Tg L15 (qui exprime le mir). Double transgénique
20 Conclusions Promoteur pol III Forte inhibition en ture cellulaire Non adapté en transgénèse : Toxicité du shrna: concentration trop forte, effet off-target Saturation du système de maturation (Dicer/Drosha/RISC). Promoteur pol II Inhibition importante en ture cellulaire Inhibition partielle en transgénèse. Choix des cibles Le % inhibition varie selon les cibles. shr mir Auj PrP Auj PrP pol II cell X X X Tg X X X pol III cell X X Tg X X
21 Valorisation Thèse de Micaela Gallozi, Analysis of the role of specific cell types in the propagation of the TSE infectious agent, soutenue le 4 février 28, financement RIVAGE, Action Marie Curie. Thèse Ashraf Sawafta Design of vector for the expression of shrna in transgenic animal, soutenue en mai 28. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. M. Gallozzi, J. Chapuis, F. Le Provost, A. Le Dur, C. Morgenthaler, C. Peyre, N. Daniel-Carlier, E. Pailhoux, M. Vilotte, B. Passet, L. Herzog, V. Beringue, J. Costa, P. Tixador, G. Tilly, H. Laude and J.-L. Vilotte, Transgenic Res (28) 17: Inhibition of IE (Immediate Early) 18 gene from pseudorabies virus in transgenic mice by RNA interference. N. Daniel-Carlier, A. Sawafta, Fr. Lefèvre, M. Leroux-Coyau, D. Thépot, S. Prince, B. Passet, G. Jolivet, L.-M. Houdebine, 8th Transgenic Technology Meeting (TT28) October 28, Toronto, Canada (poster).
22 Laboratoire de Génétique Biochimique et Cytogénétique Fabienne LE PROVOST* Micaela GALLOZZI Gaëlle TILLY José COSTA Marthe VILOTTE Caroline MORGENTHALER Bruno PASSET Jean-Luc VILOTTE * coordinateur Laboratoire de Biologie du Développement et Reproduction Ashraf SAWAFTA Dominique THEPOT Nathalie DANIEL-CARLIER Sonia PRINCE Geneviève JOLIVET Louis-Marie HOUDEBINE Laboratoire de Virologie et Immunologie Moléaires Jérome CHAPUIS Vincent BERINGUE Annick LE DUR Hubert LAUDE INRA JOUY-EN-JOSAS
23 Méthode de détection des ARN interférents en PCR en temps réel 1 Polyadénylation 5 P 3 -OH 2 Transcription inverse + Poly(A) Polymérase + ATP 1h à 37 C 5 P AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA. 3 -OH 5 P AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA. 3 -OH + amorce poly(t) 3 - *NVTTTTTTTTTTTTGGATATCACTCAGCATAATTAAGACACGAGCG-5 + dntp + Transcriptase reverse (multiscribe) 2H à 37 C TTTTTTTTTTTTGGATATCACTCAGCATAATTAAGACACGAGCG 3 -OH 5 P AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA. 3 -OH 5 P 3 PCR en temps réel 3 -OH TTTTTTTTTTTTGGATATCACTCAGCATAATTAAGACACGAGCG 5 P Technique du SYBR Green Amorce Universelle 3 -OH TTTTTTTTTTTTGGATATCACTCAGCATAATTAAGACACGAGCG 5 P Amorce spécifique du RNAi «Facile means for quantifying microrna expression by real-time PCR»(25) R. Shi and V.L.Chiang Biotechniques 39:
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