Les anti-rétroviraux, mécanismes d action et mécanismes de résistance virale

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1 Les anti-rétroviraux, mécanismes d action et mécanismes de résistance virale Professeur Patrice ANDRE Laboratoire de Virologie Nord, Hospices Civils de Lyon. INSERM unité U1111, CIRI «Biologie cellulaire de l infection virale» patrice.andre@chu-lyon.fr patrice.andre@inserm.fr

2 Virus = Parasites Cellulaires Obligatoires Interactions avec les protéines/fonctions cellulaires Immunité innée / apoptose / autophagie Voies de biosynthèse Métabolisme énergétique IDA «Indirect Acting Antiviral»

3 Les anti-rétroviraux Rappel des cibles accessibles à la thérapeutique. Les inhibiteurs d entrée et de fusion. Les inhibiteurs de la transcriptase inverse. Les inhibiteurs de la protéase virale. Les inhibiteurs de l intégrase L evolution des virus résistants. Les méthodes d études de la résistance virale.

4 Origines du VIH Famille Retroviridae : oncovirus, lentivirus et spumavirus Tous les primates sont infectés par un lentivirus. Origine des VIH-1 et -2. singe singe Gorille Mangabé SIVrcm SIVgsn SIVsm chimpanzé P. troglodytes SIVcpz H. hominis H. hominis H. hominis H. hominis H. hominis HIV-1 M HIV-1 O HIV-1 N HIV-1 P HIV-2 sous types : A, B, C, D, classification sur env F, G, H, J, K variations nucléotiques inter-groupes : 20-50% RCF-AG, variations nucléotiques intra-groupes : 10-15% quasi espèce : 5 %

5 Rappel du cycle de réplication virale Variabilité : Erreur de la polymérase DAA Direct Acting Antiviral

6 Les cellules de la réplication -1-

7 virus/jour Les cellules de la réplication -2-1 à 100 x10 6 LT CD4 infectés 1 LT CD4 infecte 20 LT CD4 10 à 100 x10 6 LT CD4 détruits/jour 5 à 50 x10 9 virions liés au CDF Latence : CDF T-CD4 quiescents macrophages L infection par le VIH est une infection active, génératrice de diversité, chronique et persistante avec latence et sauvegarde de l information.

8 Participation cellulaire à la charge virale NB. Les cellules infectées sont présentes dans les organes lymphoïdes mais aussi dans d autres sites comme le SNC qui constituent des réservoirs de virus.

9 Les inhibiteurs d entrée et de la fusion Structure et fonction des glycoprotéines d enveloppe. Structure de la gp41. Les trois étapes de l entrée. Inhibition du docking. Inhibition de la liaison aux co-récepteurs. Inhibition de la fusion.

10 Les trois étapes de l entrée I-Docking II-Liaison aux corécepteurs III-Fusion Insertion Phénomène très rapide dont la cinétique dépend : de la qualité des boucles variables V1 et v3, de la concentration et de la qualité des corécepteurs.

11 I - Inhibition du docking : inhibiteurs de CD4 et de la gp120 Inhibiteurs de CD4 : TNX-355, anticorps monoclonal anti-cd4, phase 1-2, IV, effet dose dépendant. Inhibiteurs de la gp120 : CD4 soluble, peu d activité in vivo. PRO 542, molécule hybride CD4-Ig, phase -2, IV. BMS-806, molécule de synthèse se liant au site CD4 de la gp120, spectre relativement restreint, pré-clinique.

12 II Inhibition de la liaison aux corécepteurs RANTES, MIP-1α, -1β CXCR4 CCR5 Les chimiokines, ligands naturels des récepteurs CXCR4 et CCR5, bloquent la fixation du site, la boucle V3 (11, 24, 25, lysine, arginine X4) dévoilée lors du docking, de la gp120 à ces récepteurs. L inhibition de cette étape est réalisée par masquage des récepteurs.

13 Les cibles du VIH-1 CD4 T-cells Naives CXCR4 Mémoires CCR5/CXCR4 Les naives dominent en début d infection et décroisent ensuite tandis que les mémoires croissent durant l infection L activation des cellules augmente l expression de CD4 et CCR5 CD4 T EMRA sont CCR5 ++ mais ne sont infectables que par des virus X4 (Oswald-Richter, PLoSPatho 07); quand les CD4+ Tcells sont-elles susceptibles à l infection par X4 ou R5? D où proviennent les cellules mémoires? Des effectrices ou des resting naives? Macrophages / cellules dendritiques CCR5 / CXCR4 (monocytes) Réservoir (stade tardif sous HAART?) Autres cellules

14 Classification des VIH-1 T-X4 D-X4 D-R5X4 M-R5 CXCR4 Berger, Nat, 98 CD4 T EMRA sont CCR5 ++ mais ne sont infectables que par des virus X4 (Oswald-Richter, PLoSPatho 07) Yi, J Virol 05; Ghaffari, J Virol 05; Oswald-Richter, PLoSPath, 07; Xu, J Inf Dis, 08; Yi, J Virol, 09

15 Le switch des co-récepteurs Stade précoce R5: réplication dans un site riche en CCR5, le tractus intestinal Evolution de la quasi espèce virale de R5 vers X4? Contrôle immunitaire? Evolution des populations cellulaires cibles? Souches X4 sont plus virulentes (plus cytopathogènes ou plus grand nombre de cellules infectées), plus fréquentes pour les sous types B que C, A que D Regoes, Trends in Microbiol, 05

16 Les populations virales Table 1. The prevalence of both R5 and X4 viruses in treatment naive and treatment experienced HIV-1 infected patients STUDY POPULATION NO. PATIENTS R5 VIRUS DUAL/MIXED VIRUS X4 VIRUS Homer cohort 7 Naive % 18% <1% Chelsea Cohort 8 Naive % 18% <1% ACTG Experienced % 46% 4% MOTIVATE 1 & 2 10 Experienced 2,560 56% 41

17 Les mécanismes du switch T-X4 D-X4 D-R5X4 M-R5 CXCR4 Phénomène complexe passant par des intermédiaires R5X4 moins performants, plus sensibles aux inhibiteurs d entrée et aux anticorps neutralisants. Participations de plusieurs domaines de la gp120 dont notamment les boucles variables, V3 mais aussi V1,2, 5, mais aussi de gp41. Regoes Bonhoeffer, Trends in Microbiol, 05;Ghaffari, J Virol, 05; Tasca, J Virol, 08; Huang, J Virol, 08

18 2,9% de virus X4

19 Une structure de gp120 Huang, Science, 05

20 Liaison de la gp120 à CCR5 Huang, Science, 07

21 La boucle V3 résidus 11, 25, 30 (règle 11-25) charge nette globale; faible R5 (<5), forte X4 (>5) score spécifique des aa (glycosylation, N301, absence en faveur de X4) modèle de structure tridimensionnelle MAIS rôle d autres domaines de gp120 et gp41. Huang, Science, 05 et 07

22 Agonistes et antagonistes de CCR5 Agonistes Activent CCR5 Internalisation Absence d expression Transduction? Résistance? PSC-RANTES Antagonistes Occupent le site Pas d internalisation Bloqués à la surface Pas de transduction Résistance? MVC, VVC

23 Les antagonistes

24 Fixation des antagonistes (MVC) MARAVIROC VICRIVIROC APLAVIROC aa CCR5 IC 50 si A aa CCR5 IC 50 si A aa CCR5 IC 50 si A E283 (H7) 2000x E283 (H7) 700x F109 (H3) 158x I198 (H5) 89x Y108 (H3) 60x E283 (H7) 61x Y108 (H3) 70x I198 (H5) 25x W86 (H2) 39x Y251 (H6) 12x Y251 (H6) 18x I198 (H5) 35x Kondru, Mol Pharmacol, 08

25 Les tests de phénotypage Test Société Amplicon Vecteur Trofile Monogram TRT VirAlliance Antivirogram Virco BVBA PhenX-R InPheno Région Gp160 V1-V3 NH2-V4 V2-gp41 Taille (pb) PCXAS-env + HIVgenomic-luc pnl4-3 delta V phxb2 egfp dans Nef pnl4-3 Stock viral défectif repliquant repliquant repliquant Construction du vecteur Enzyme de restriction Recombinaison Recombinaison Recombinaison Cellules productrices 293T 293T 293T Dérivé d'hela Cellules cibles U87-CD4-CCR5 U87-CD4-CXCR4 U373-CD4-CCR5 U373-CD4-CXCR4 HIV LTR-lacZ U87-CD4-CCR5 U87-CD4-CXCR4 SX22-1 Gène reporter luciférase β-galactosidase egfp β-galactosidase U87, U373, SX22: glioblastome, ostéosarcome

26 Analyses génotypiques GENOMIACS geno2 G C4.5 PART SVM 11/25 net PSSM ToulouTROF ADA_FAI B C T R P S N N T R R G I H I G P G R A F Y A T G D I I G D I R Q A H C R5 R5 R5 R5 5 R5 R5 R5 R5 JAN_CYR B C T R P N N N T R R S I H I G P G K A F Y T T - D I V G D I R Q A H C R5 R5 R5 R5 5 R5 R5 R5 R5 LAU_FRA B C T R P N N N T R R G I N M/V G P G R A F Y T T G E/G V I/V G D I R K A Y C R5 R5 R5 R5 4 X4 R5 R5 R5 SAM_RAP B C T R P N N N T R K G I H I G P G R A V Y V R D R I I R/G D I R K A H C R5 X4 X4 X4 9 X4 X4 X4 DM ROU-and B C T R P N N N T R K S I H/P I A/G P G R A F Y A T G Q/E I I G N I R Q A H/Y C R5 R5 R5 R5 7 R5 R5 R5 R5 CHA-mar B C I R P S/G N N T R K G I H I A/G P G R A/S F Y T/A T G D I/V I G D I R K A H C R5 R5 R5 R5 6 R5 R5 R5 R5 NOI-dom B C T R P N N N T R K G I H I G P G S T F Y A T G E I I G D I R K A H/Y C R5 R5 R5 R5 5 R5 R5 R5 R5 ALI-hen AG C T R P G N N T R T S I H M G P G K A F Y A T G D I V G N I R Q A H C R5 R5 R5 R5 5 R5 R5 R5 R5 OUD-dom B C A R P N N N T R K S I S M G P G R A L Y A T G A I I G D I R Q A H C R5 R5 X4 R5 5 R5 R5 R5 R5 GER-jea B C I R P G N N T R K S I S I G P G R A F Y T T G Q I I G D I R Q A H C R5 R5 R5 R5 5 X4 R5 R5 R5 AND-dom B C I R P N N N T R K S V P/S I G P G R A I Y A T G A I I G D I R R A Y C R5 R5 X4 R5 5 X4 R5 R5 R5 FLO-hen B C T R P S/G N N T S K G I H I G P G R A F Y A T R H I I G D I R K A H C R5 R5 R5 X4 8 X4 R5 R5 R5 BRA-seb B C T R P N N N T R K G I H I G P G G A F F T T G Q I I G N I R K A Y C R5 R5 R5 R5 6 R5 R5 R5 DM IOR-sar F C T R P N N N T R T S I N/S I G P G R A F Y A T D T/A I I G D I R K A H C R5 R5 R5 R5 4 R5 R5 R5 DM VIL-joe B C T R P N/S N N T R R S I N I G P G R A F Y T T G H I I G N I R Q A H C R5 R5 R5 X4 7 R5 R5 R5 DM MIL-jac B C T R P Y N N T R K S I H I G P G R A F F T T G S V I G D I R Q A Y C R5 R5 R5 R5 5 X4 R5 R5 DM PEG-gui B C T R P S N N T R K R/G I H/R I/M G I G R A/G F Y T T KREG E/G I I/V G D I R Q A H C X4 X4 R5 X4 7 X4 R5 X4 DM DUC-ala B C T R P N N N T R R S I H I G P G R A/V F D A I G K I V G D I R R A H C R5 R5 X4 X4 7 X4 X4 X4 DM Toulouse: 11K/R et/ou 25K ou 25R + ch nette>=5 ou ch nette>=6 charge (+) K R (H), (-) D E Règle (24): de charge (D, E) à + (K, R, N) en 25 > R5 à X4 ou si en 11 charge + (K, R) charge nette globale < 5 ou > 5, R5 et X4 respectivement glycosylation en N301, absence > X4 Neural network, matrice de score spécifique PSSM, support vector machine SVM = supports informatiques POUR LES SOUS-TYPES B (sauf PSSM)

27 III Inhibition de la fusion T20 se fixe ici bloque là T20 et T1249 sont des peptides, homologues de HR2, qui se fixent sur HR1 et qui empêchent le repliement ultérieur de la gp41. L inhibiteur à 5 hélices est un autre inhibiteur de fusion qui se fixe sur HR2 et bloque le repliement de la gp41.

28 Structure et fonction des glycoprotéines d enveloppe Les GP sont des hétéropolymères constitués de 3 gp120 et de 3 gp41 fichés dans l enveloppe virale. L ensemble réalise un moteur moléculaire capable de changer deux fois de conformation. Ces changements de conformation, en rapprochant les peptides de fusion des domaines transmembranaires, amènent les membranes virales et cellulaires au contact et entraînent la fusion de celles-ci.

29 Structure de la gp41 Les deux domaines HR1 et HR2 s organisent en hélice α. Cette structuration rigidifie chaque molécule du trimère et projette les domaines de fusion, hydrophobes, dans la membrane de la cellule cible. Les deux domaines des gp41 se replient ensuite pour faire coïncider les résidus hydrophobes de chaque hélice ce qui réalise un faisceau à 6 éléments et entraîne la fusion des membranes.

30 Facteurs influençant l efficacité du T20 La nature de la gp120 et la concentration en corécepteurs influent sur la cinétique de l entrée du virus dans la cellule. Les variations de la gp120 (V3) et des concentrations en corécepteurs modulent l activité du T20. Reeves JD, et al, 2002, PNAS, 99 : 16249

31 Mutations de résistance au T20

32 Conclusions Il paraît judicieux de bloquer le virus avant son entrée dans la cellule. Les inhibiteurs d entrée sont actifs sur les souches virales résistantes aux INRT et aux anti-protéases. Les inhibiteurs d entrée du VIH dans la cellule sont une classe très attendue d antirétroviraux. L affinité de Env pour les récepteurs, le niveau d expression des corécepteurs et la nature de la cellule sont des facteurs qui peuvent influencer la réponse clinique à cette classe de médicament.

33 Les inhibiteurs de la transcriptase inverse

34 Structure et fonctions de la RT

35 Les analogues nucléosi(ti)diques AZT zidovudine 3TC lamivudine ddi didanosine ABC abacavir D4T stavudine emtricitabine tenofovir

36 Analogues nucléosidiques et nucléotidiques

37 ( 1 )

38 ( 2 )

39 P P P O OH dntp ( 3 OH absent chez INs/INT ddntp ) ( 3 )

40 dntp K65 R72 K219 Q151 Y183 M184 Repliement des doigts qui forment une poche ( 4 ) D113 F116 D110 T160 D185 D186 Y115

41

42 Elongation dnmp P P ( 5 ) ( 6 ) Libération de pyrophosphate et ouverture des doigts.

43 Natural Substrate (dntp) ATP CTP TTP GTP Nucleosides and Nucleotides analogs ( ddntp ) ATP ddi TDF ddc 3TC FTC AZT d4t ABC

44 Excision Le ddntp est incorporé mais il subit un phénomène d excision. Le dntp peut alors prendre sa place.

45 Cause : affinité ( Kd) La RT mutée présente une affinité beaucoup plus grande pour les dntp que pour les ddntp M184V

46 Incorporation (kpol) L affinité pour le ddntp n est pas modifiée, mais la liaison 3-5 phosphodiester avec le ddntp est nettement moins efficace qu avec le dntp K65R L74V Q151M

47 RT résistance : I-pyrophosphorolyse Les TAMs : 70R, 215Y/F, 41L, 210W, 67N, 219Q Diminuent la processivité de la RT. Favorisent la pyrophosphorolyse. AZT, ABC, et d4t, ddi.

48 RT résistance : -II- discrimination des analogues. La mutation T215Y, AZT La mutation T69D/N/S/A, ddi La mutation V75TMA, d4t, ddi La mutation K65R, TDF, ABC,3TC ddi La mutation L74V, ddi et ABC La mutation 115F, ABC La mutation M184V, 3TC : augmente la fidélité et diminue la processivité. Les mutations multi-nucléosides : Q151M (A62V, V75I, F77L, F116Y) ou insertion SS

49 RT résistance : -III- augmentation des RT.

50 Inhibiteurs non nucléosidiques 1) Butterfly like, interaction aile avec résidus aromatiques, 181,188,227,229, 318 2) Hydrophobic site, collapsed, elastic 3) Y181C et Y188L =>défaut des interactions aromatiques, L100I G190A encombrement stérique, K103N hydrogen bond Y188 4) Stabilisation possible par F227 W229

51 Résistance aux non nucléosidiques Mutations aux codons K103N, DLV, NVP et EFZ V106A, NVP et +/- DLV K101I, EFZ A98G, K101E, V108I, +/- DLV, NVP et EFZ Mutations aux codons Y181C/L, NVP et DLV Y188C/L/H et G190A/S, NVP et EFZ Mutations aux codons

52 TMC125 Etravirine

53

54 Les inhibiteurs de la protéase

55 Fonction de la protéase du VIH

56 Structure de la protéase

57 Mutations associées à la résistance aux IP Le volet : Mutations majeures, 48VM, 50V/L Mutations compensatoires, 46I/L, 47A/V, 54* Les mutations compensatoires ou accessoires : Non polymorphes : 23, 24, 32, 33, 73, 76, 88 Polymorphes : 10, 20, 36, 63, 71, 77, 93 Le site catalytique : le sillon Mutations majeures qui induisent une résistance à un ou plusieurs IP.

58 Mécanismes de résistance

59 Résistance aux inhibiteurs de la protéase Les mutations du site catalytique : V82A/T/F/S IDV, LPVet contribue à la résistance aux autres IP I84V tous les IP, DRV, sauf NFV D30N NFV I54V tous les IP (46, 47, 53) (I54L) L90M SQV, NFV, IDV et RTV G48V, V84A/F/T, I84V et L90M sont les déterminants majeurs associés à une résistance aux IP. Les mutations «compensatoires» : 10, 20, 36, 63, 71, 77, 93 contribuent à la résistance aux IP mais sont aussi des codons polymorphes. Boost avec le ritonavir

60 Anti-intégrases

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62 Structure de l intégrase Zn Mg/Mn aa: NTD (HHCC) CDD (DDE) CTD W131 et Q168 (LEDGF p75) Q148 (ADN viral) K186 (Tetramère)

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65 Figure 35: Structure des Inhibiteurs

66 Mécanismes de résistance -Trois voies : - Y143R/C - Q148K/R/H - N155H exclusives - Cinétique d apparition: - N155H puis Q148K/R/H qui sont les plus fréquentes des trois voies de résistance - Mécanisme: dépend des mutations compensatoires; N155H + L74M, E92Q, G163R Q148K/R/H + E138K, G140R Cette dernière association de mutations confère un plus haut degré de résistance que la première - Faible barrière génétique (moins vrai pour Y143R/C)

67 * 1 seule mutation ( ou un très faible nombre) suffit pour la Résistance * Résistance croisée RAL / ELV évidente * Pas de relation entre la puissance d un ARV et la «barrière génétique»

68 L evolution des virus résistants

69 Mécanisme de la sélection des mutations associées à la résistance P rés = Nx rép x Tx erreur x C méd La probabilité de sélectionner une mutation associée à la résistance à un anti-rétroviral dépend de trois facteurs: le niveau de réplication du virus le taux d erreur de la transcriptase inverse la présence d un agent de sélection, l anti-rétroviral.

70 Mécanisme de la sélection des mutations virus/jour 1 à 100 x10 6 LT CD4 infectés 1 LT CD4 infecte 20 LT CD4 10 à 100 x10 6 LT CD4 détruits/jour 5 à 50 x10 9 virions liés au CDF La réplication Une erreur toutes les 5x10 3 bases, soit environ deux erreurs par réplication du génome. La probabilité de mutation, une base donnée à une position donnée, est (2 x 10-4 ) / 4 = 5 x 10-5 Soit P ~ 10 4 / jour Le taux d erreur (estimation grossière)

71 Notion de barrière génétique M184V M ATG V GTN L10I, M36I, M46I/M, A71V/A Faible barrière Forte barrière

72 Evolution des quasi-espèces AR ar ar AR

73 Evolution des mutations de résistance

74 Quelques règles virologiques d usage des antirétroviraux Préférer utiliser une combinaison de molécules agissant sur des cibles différentes. Sur la même cible, éviter, jusqu à preuve du contraire, d utiliser des molécules très proches susceptibles d avoir les mêmes voies métaboliques et d entrer en compétition sur leur cible. Empêcher le virus d essayer des solutions d échappement aux anti-rétroviraux; bloquer totalement la réplication virale. Taper fort et bien.

75 Les méthodes d étude du traitement antirétroviral Mesure de la charge virale. Génotypage : Phénotypage : -séquençage des gènes de la protéase, de la RT et de la gp41, -intérêt prédictif de l évolution de la résistance (gp41?), -atteint ses limites en cas de mutations multiples. - ultra deep sequencing -méthode complexe faisant appel à l amplification des génomes, création d un virus recombinant dans une lignée cellulaire définie et la transduction dans une lignée cellulaire réceptive permettant d apprécier l infection sur un seul cycle de réplication virale. -intérêt pour les virus avec de multiples mutations et pour déterminer la «fitness» du virus.

76 Conclusion Thérapeutique complexe faisant appel à des techniques encore lourdes pour un usage optimal. Thérapeutique active uniquement sur la réplication. Besoin de thérapeutiques actives sur le réservoir

77 Le vrai visage du VIH

78 Données de tomo-cryo-électromicroscopie Roux, Science, 07

79 Rappel du cycle de réplication virale Variabilité : Erreur de la polymérase DAA Direct Acting Antiviral

80 Structure et fonction de la RT

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