Cellules souches hématopoïétiques: biologie et applications cliniques Jérôme Moreaux

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1 Cellules souches hématopoïétiques: biologie et applications cliniques Jérôme Moreaux CHRU de Montpellier Institut de Génétique Humaine CNRS UPR 1142

2 Hématopoïèse Plaquettes Les cellules du sang ont une durée de vie courte: - 1 journée pour les polynucléaires - Quelques jours pour les monocytes - 7 jours pour les plaquettes jours pour les globules rouges - De quelques jours à plusieurs années pour les lymphocytes ð Les cellules du sang sont produites par des cellules souches présentes dans la moelle osseuse

3 Hématopoïèse : Production des cellules du sang Plaquettes Chaque jour, l organisme doit produire Érythrocytes 200 x 10 9 /j Neutrophiles 40 x 10 9 /j Plaquettes 200 x 10 9 /j TOTAL: 440 x 10 9 /j ð Les cellules du sang sont produites par des cellules souches présentes dans la moelle osseuse

4 Intérêt des cellules souches hématopoïétiques: restaurer l hématopoïèse après chimiothérapie Comment cette réparation est possible?

5 L hématopoïèse a lieu dans la moelle osseuse Dans la moelle osseuse Dans tous les os (extrémités os longs, vertèbres, bassin, sternum, etc.)

6 Les cellules souches hématopoïétiques survivent et prolifèrent au contact des travées osseuses

7 OS, fémur OS trabéculaire Les cellules souches hématopoïétiques survivent et proliférent à proximité des travées osseuses

8 LES CELLULES SOUCHES Totipotence : capable de générer un être vivant multicellulaire Pluripotence : capable de donner naissance aux cellules issues des 3 feuillets embryonnaires Multipotence : capable de donner naissance à plusieurs types cellulaires mais déjà engagées dans une direction

9 LES CELLULES SOUCHES Blood

10 Cinq semaines d expansion et de différenciation Cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques CD34 Cellule souche multipotente Progéniteurs myéloïdes Progéniteurs Lymphoïdes Cellules du sang

11 Cellules souches et progéniteurs Une cellule souche est une cellule indifférenciée (cellule jeune, sans fonction physiologique) qui a pour propriétés : - l'auto renouvellement : la cellule souche se divise en deux cellules filles dont au moins une reste indifférenciée, avec les mêmes propriétés que la cellule mère, en particulier la propriété d'auto-renouvellement. Ainsi la cellule souche se renouvelle constamment. - la génération des cellules différenciées, c est à dire capables d'assurer la fonction d'un tissu ou d'un organe. Une cellule souche peut être capable de générer plusieurs types de cellules différenciées. Un progéniteur peut avoir une grande capacité de prolfération et de différenciation, mais a perdu la capacité d autorenouvellement Cellule souche Progéniteurs Cellules différenciées

12 Cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches hématopoïétiques 6. Utilisation de cellules souches hématopoïétiques 7. Modifications génétiques

13 Bradley et Metcalf, 1966: Premier test de mise en évidence des progéniteurs CULTURE EN MILIEU SEMI-SOLIDE Progéniteurs MOELLE OSSEUSE CULTURE EN MILIEU SEMI-SOLIDE ET FACTEURS DE CROISSANCE HÉMATOPOIÉTIQUES Fréquence = 1/1000 dans la moelle osseuse Test clonogénique identifie les CFU (colony forming unit) test fonctionnel CFU-GM 14 jours BFU-E CFU-GEMM

14 Cellules souches hématopoiétiques Cellule souche multipotente CFU-GEMM 1/10000 dans la moelle osseuse BFU-E 1/1000 dans la moelle osseuse CFU-GM 0,5/1000 Cellules du sang

15 De 50 à plusieurs milliers de cellules par colonie: de 6 à 12 divisions BFU-E Rouge: comprenant des cellules produisant de hémoglobine BFU-E Colonies générées par des progéniteurs de globules rouges CFU-GEMM Colonies mixtes Colonies générées par des progéniteurs immatures CFU-GM Comprenant des polynucléaires, monocytes Colonies générées par des progéniteurs de globules blancs

16 LTC- IC : LONG TERM CULTURE INITIATING CELL, contient les cellules souches 1/ cellules dans la moelle osseuse FACTEURS HEMATOPOIETIQUES CELLULE STROMALES MEDULLAIRES 5 SEMAINES DE CULTURE CFU-GM BFU-E 14 JOURS DE CULTURE Boîte de culture (milieu semi-solide)

17 Cellules souches hématopoïétiques Cellules du sang Cellule souche multipotente LTC-IC 1/ des cellules de la moelle osseuse CFU-GEMM 1/10000 des cellules de la moelle osseuse BFU-E 1/1000 des cellules de la moelle osseuse CFU-GM 0,5/1000 Progéniteurs hématopoïétiques

18 Les cellules souches hématopoïétiques portent l antigène CD34 Ø Sialomucine (glycoprotéine) Ø Fonction inconnue (KO viables) Ø Exprimée par: Cellules souches hématopoïétiques Progéniteurs engagés dans la différenciation hématopoïétique Cellules endothéliales

19 Les cellules souches hématopoïétiques portent l antigène CD34 BFU-E CFU-GM STEM CELL LTC-IC CFU-GEMM CD34+, CD38-, HLA-DR- 5% DES CELLULES CD34 CFU-MEG CD34 CFU-mast CELLULES CD34 = 0.5% DES CELLULES MEDULLAIRES 10% CFU-GM CD34 20% BFU-E 1% CFU-GEMM

20 5 SEMAINES 14 JOURS CD34 Polynucléaires neutrophiles GM- CFU CD34 CD34 CD34 BFU- E Globules rouges CD34 CD34+ CD % DES CELLULES CD34 CD34 CFU- MEG Plaquettes DIVERSITÉ DU COMPARTIMENT DES CSH

21 Bien comprendre: différence entre cellules souches et progéniteurs Cellule souche multipotente Cellule souche Progéniteurs Cellules différenciées Les cellules souches hématopoïétiques ne se reproduisent pas de façon illimitée en culture: comment démontrer que ce sont des cellules souches?

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24 Notions clefs Les cellules du sang sont en constant renouvellement à partir d un petit contingent de cellules souches et progéniteurs hématopiétiques localisés dans la moelle osseuse Nous avons 0.5% de cellules portant l antigène CD34, compartiment qui contient tout un cône de différenciation de cellules souches hématopoïétiques capables d autorenouvellement (cellules rares, 10-6 ) et les progéniteurs hématopoïétiques (5 x 10-3 ). L identification des progéniteurs hématopoïétiques est faite à l aide des antigènes CD34, CD38 et des tests de croissance et différenciation en milieu semi solide in vitro Les cellules souches hématopoïétiques ne sont pas capables d autorenouvellement in vitro, du fait de la nécessité d une niche complexe.

25 Cellules souches hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches 6. Utilisation de cellules souches 7. Modifications génétiques

26 Les cellules souches hématopoïétiques survivent et prolifèrent dans une niche hématopoïétique associant les ostéoblastes et cellules endothéliales Cellule perivasculaire CL Celso et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi: /nature07434

27 The calvarium endosteal niche is perivascular Microscopie intravitale chez la souris Rouge: anti CD31 = vaisseau Bleu : Os Vert : Ostéoblastes CL Celso et al. Nature 000, 1-5 (2008) doi: /nature07434

28 Osteoblasts CXCR4 β3-adrenergic receptor Nestin + CXCR4 VLA4 VCAM1 VLA4 Tie-2 CAR BONE Ang SCF Tie-2 C-kit C-kit Niche complexe

29 Régulation complexe et dynamique des CSH La CSH est capable de migrer vers le sang périphérique et d y circuler pour un jour revenir se loger dans la M.O. «Homing» : retour des CSH vers la niche hématopoïétique Entrée, installation («lodgement») des CSH dans la niche hématopoïétique et reprise des fonctions, notamment différenciation en cellules sanguines matures («engrafment») Propriété capitale en médecine régénératrice : bases des greffes de CSH Remarque : conservation des propriétés après congélation/décongélation Wang and Wagers Nat. Rev. Mol. Cell. Biology 2011

30 Niche complexe

31 Présence chez la souris de cellules Lin- Sca1+ ckit+ CD150+ CD48- qui sont capable de régénérer l hématopoïèse à long terme. Cette population est quiescente avec 1/7eme de cette population qui ne se divise qu une fois tous les 145 jours chez la souris ce qui représente 5 divisions par vie des souris. Ces cellules souches dormantes peuvent être activées par du G- CSF ou par un signal de stress de la moelle osseuse.

32 Après réparation, ces cellules reconstituent un pool de cellules souches hématopoïétiques dormantes.

33 Cellules souches hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches 6. Utilisation de cellules souches 7. Modifications génétiques

34 Collection des cellules souches hematopoïétiques 1- Moelle osseuse Anesthésie générale (500 ponctions) Plus de un litre de moelle osseuse Prélèvement souvent limité en vol. Nombre limité de précurseurs Transfusion autologue de 2 culots globulaires (donneur volontaire) 2 - Possibilité des les induire à circuler dans le sang périphérique

35 Mobilisation des progéniteurs hématopoïétiques dans le sang périphérique et collection MOELLE OSSEUSE Molécules d adhésion VLA4, VCAM1, SCF BIO5192 inhibe axe VCAM1/VLA4 SANG PERIPHERIQUE Elastase Catepsin G CXCR4 CD34 SDF-1 CD34 Polynucléaire neutrophile Prolifération Modulation des molécules d adhésion Mobilisation des cellules CD34 dans la circulation CD34 Collection par cytaphérèse G-CSF Mozobil (Plerixafor): Inhibiteur de CXCR4/SDF-1

36 Cytaphérèse Cellules souches (cellules mononuclées) patient 4 5 heures (2h pour don plaquettes) 1 à 3 séances

37 Congélation et stockage en azote liquide Congélation en DMSO 10% et albumine humaine 4% Descente en température contrôlée : NiCool Stockage en azote liquide (-196 C) ou en vapeur d azote (-140 C) Pendant plusieurs années (>10 ans) Décongélation: Au bain marie dans l UTC puis lavages pour éliminer le DMSO (nouvelle législation : interdiction de réinjecter le DMSO)

38 L unité de thérapie cellulaire Réceptionne le greffon, filtre et conditionne Congèle Effectue les contrôles de qualité Infectieux Nb de cellules souches du greffon ( 2 millions CD34 viables/kg de poids de receveur)

39 Cellules souches hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches 6. Utilisation de cellules souches 7. Modifications génétiques

40 PURIFICATION DES PROGENITEURS HÉMATOPOÏETIQUES Anticorps anti-cd34 1% Cellules CD 34 Cellules tumorales 50 Milliards Aimant Cellules CD 34 Cellules tumorales 500 Millions

41 Purification sur billes Automacs

42 % CD34+ AVANT PURIFICATION % CD34+ APRES PURIFICATION CD34: 2,01% CD34: 99,63% CD34: 1,12% CD34: 98,61%

43 HSC et autogreffe : contrôle qualité - Contrôle qualité et numération des HSC avant congélation Marqueur de viabilité CD45 + leucocytes CD34 + HSC Objectif : 4 Millions de HSC / kg à réinjecter au patient. Congélation

44 Cellules souches hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches 6. Utilisation de cellules souches 7. Modifications génétiques

45 Deux types de greffes Autogreffe : greffe de ses propres cellules souches hématopoïétiques Allogreffe : donneur

46 Cellules souches hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches 6. Utilisation de cellules souches 7. Modifications génétiques

47 Une chimiothérapie intensive et greffe de cellules souches hématopoïétiques permet de doubler la survie dans certains cancers Moelle osseuse qui produit les cellules du sang Chimiothérapie Intensive détruit La moelle osseuse

48 Indications Autogreffe Myélome au diagnostic Augmentation d un facteur cinq du taux de rémission complète Doublement de la survie Lymphome (de mauvais pronostic ou en rechute) LAMde mauvais pronostic sans donneurs Environ 2500 autogreffes en France par an (100 à Montpellier)

49 Exemple du Myélome Multiple - B cell neoplasia characterized by the accumulation of malignant plasma cells within the bone marrow - 10 to 15% of hematological malignancies - Major clinical signs: - Anemia - Renal failure - Bone lesions Multiple Myeloma remains an incurable disease

50 Myélome Multiple Homing Survie et prolifération SDF- 1 Chimiokines CXCR4 Cellule de MGUS/MM IL- 6, IGF- 1, APRIL Facteurs de croissance CCR2 Cellules stromales CCL2, CCL7, CCL8, CCL13 Vaisseaux sanguins ostéoblastes Lésions osseuses OS ostéoclastes

51 Ly B post centre germinatif MGUS Smoldering Myeloma Myélome Multiple Leucémie à plasmocytes Evènements génétiques primaires Translocations IgH@ Hyperdiploidie Délétion Cyclin D1-3 Perte de Rb Mutations de Ras Evènements génétiques secondaires: t(4;14) Variation du nombre de copies géniques Mutations Délétion de P53 NF- Kappa B Surexpression de Myc Hypométhylation de l ADN < 10% plasmocytes tumoraux > 10% plasmocytes tumoraux Apparition de signes cliniques CRAB Indépendance vis à vis de l environnement médullaire Diversité des cellules tumorales Cycle cellulaire Bloqué en G1 Bloqué en G1 0 à 4% de cellules en phase S Médiane 0,4% Puissant facteur pronostic Forte prolifération

52 Myélome Multiple Diagnosis Induction Bortezomib/Imids/Dexamethasone Mobilisation (G- CSF ± Cyclophosphamide) High dose Melphalan+ Autograft Autogreffe Relapse

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54 HSC et autogreffe Chimio intensive Aplasie et reconstitution Chimiothérapie de réduction tumorale Réinjection Cytaphérèse Collecte HSC Congélation

55 Autogreffe de Cellules souches hématopoïétiques Collecte (cytaphérèse) Stockage en vapeur d azote (-140 C) G-CSF 5000 PNN (log) 500 Aplasie Neutropénie sévère 50 Décès 10 jours

56 Apport de HDM + autogreffe dans le traitement du MM 2014

57 Apport de HDM + autogreffe dans le traitement du MM Essais cliniques: HDM + autogreffe Cohorte TT1: 231 patients avec un follow- up de 17 ans. 23 patients toujours en vie et sans progression avec un plateau sur la courbe d OS vers 14 ans de suivi. Cohorte espagnole de 344 patients avec un follow up de 13 ans. Plateau de la courbe d OS à 11 ans de suivi 10 à 15% de patients avec une survie supérieure à 10 ans.

58 Apport de HDM + autogreffe dans le traitement du MM Amélioration de l efficacité avec l amélioration du traitement d induction avec les nouveaux agents: Inhibiteurs du protéasome et IMiDs

59 Allogreffe de CSH Remplacement d'une moelle et/ou d'un système immunitaire par des cellules souches hématopoïétiques et des lymphocytes T Remplacement définitif de toutes les cellules myéloïdes et lymphoïdes du receveur. Donc l immunosuppression n'est pas définitive (différent de la greffe d organe).

60 Origine du greffon Donneur HLA compatible: Fratrie (1/4 est compatible) Donneur compatible non apparenté : fichier de typage HLA Compatibilité ABO non nécessaire Moelle osseuse ou cytaphérèse

61 Allogreffe de Cellules souches Hématopoïétiques après chimiothérapie intensive Volontaire sain 5000 PNN (log) 500 Aplasie Neutropénie sévère jours Immunosuppresseurs : ciclosporine, corticoïdes, etc.

62 Chambre stérile Chambre une personne Flux laminaire : air stérile Nourriture stérile Décontamination digestive Personnel soignant: surblouse stérile, masque, bonnet, gants stériles Surveillance +++ Attention : isolement + stress + long séjour (1 mois) è dépression

63 En 2000, une équipe a une l idée d éliminer la chimiothérapie intensive pour limiter la toxicité de l allogreffe. Immunosuppression Chimiothérapie modérée Lymphocytes Cellules souches hématopoïétiques Destruction des cellules hématopoïétiques du receveur Greffe des cellules souches du donneur Donneur identique ou proche (HLA) Destruction des cellules tumorales par les lymphocytes du donneur Résultats cliniques très prometteurs

64 Augmentation des allogreffes chez les patients de plus de 50 ans

65 Une limite majeure à l allogreffe de cellule souche est le nombre de donneurs compatibles (1 million de donneurs dans le monde) ð Sang de cordon: une nouvelle source de cellules souches

66 Le sang de cordon contient des cellules jeunes au premier jour de la vie - des lymphocytes (défense de l organisme) - des cellules souches du sang - des cellules souches multipotentielles

67 Une limite majeure est le nombre de cellules souches dans le sang de cordon, qui rend la greffe souvent impossible chez l adulte. Comment avancer?

68 Immunosuppression Chimiothérapie modérée Destruction des cellules hématopoïétiques du receveur Cordon 1 Greffe des cellules souches du sang de cordon Cordon 2 Destruction des cellules tumorales par les lymphocytes du sang de cordon

69 Augmentation très rapide du nombre d allogreffes de sang de cordon aux Etats-Unis. Similaire en Europe Nombre de greffes Anné e

70 Allogreffe: ex du MM Chimio modérée Chimiothérapie de réduction tumorale Injection Donneur collecte

71 Stratification des patients Score de risque (transcriptome) Reme et al. Bioinformatics, 2013 a b c % patients % survival at 48 months Median Overall survival Rs1 45% 81 NR Rs2 45% Rs3 10% d High risk patients: Del 17 ISS3, High LDH and cytogenetic abnnormality

72 Stratification des patients Score de risque (transcriptome) Reme et al. Bioinformatics, 2013 VAD+HDM+relapse VD(T)+HDM+relapse VAD+HDM+T+relapse VD+HDM+T+relapse Patients à haut risque quelque soit le traitement

73 Allogreffe: ex du MM Principe actif : système immunitaire du donneur

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76 Cellules souches hématopoïétiques 1. Caractérisation 2. Niche hématopoïétique 3. Collection et congélation 4. Purification 5. Greffe de cellules souches 6. Utilisation de cellules souches 7. Modifications génétiques

77 Transfert de gènes dans les progéniteurs hématopoïétiques IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 Chaîne gamma Science, 288: , 2000

78 CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES Cellule souche multipotente

79 γc γc Cellules souches hématopoïétiques CD34 Séminaires Ketty Schwartz

80 CD34 5 x 10 5 /ml SCF, TPO, IL-3, Flt3-L + retrovirus-γc 3 jours Cellules CD34 Exprimant la chaîne gamma Incubateur: 37 C, CO2 5%

81 Octobre patients survivants sur neuf à 10 ans

82 LMO2- associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID- X1. Hacein- Bey- Abina et al., Science, Oct 2003 We have previously shown correction of X- linked severe combined immunodeficiency [SCID- X1, also known as gamma chain (gamma(c)) deficiency] in 9 out of 10 patients by retrovirus- mediated gamma(c) gene transfer into autologous CD34 bone marrow cells. However, almost 3 years after gene therapy, uncontrolled exponential clonal proliferation of mature T cells (with gammadelta+ or alphabeta+ T cell receptors) has occurred in the two youngest patients. Both patients' clones showed retrovirus vector integration in proximity to the LMO2 proto- oncogene promoter, leading to aberrant transcription and expression of LMO2. Thus, retrovirus vector insertion can trigger deregulated premalignant cell proliferation with unexpected frequency, most likely driven by retrovirus enhancer activity on the LMO2 gene promoter. retrovirus retrovirus LMO2 Oncogène

83 RISQUE DE CANCER: MUTAGÉNÈSE INSERTIONNELLE 5 Patients/20 : prolifération de lymphocytes T incontrôlée («leucémie») 1 décès 4 patients traités avec succès par chimiothérapie retrovirus retrovirus LMO2 Oncogène Séminaires Ketty Schwartz

84 RISQUE DE CANCER: MUTAGÉNÈSE INSERTIONNELLE 5 Patients/20 : prolifération de lymphocytes T incontrôlée («leucémie») 1 décès 4 patients traités avec succès par chimiothérapie Séquences inactivatrices retrovirus LMO2 Oncogène Séminaires Ketty Schwartz

85 ADRENOLEUCODYSTROPHIE Mutation dans le gène ABCD1 Correction ex vivo par lentivirus (HIV) La forme cérébrale infantile se manifeste entre 4 et 8 ans. Les premiers signes sont des signes déficitaires: diminution progressive de l'audition, de la vision, diminution des fonctions cognitives et motrices aboutissant en moins de deux ans à une infirmité totale.

86 UN BLOCAGE DANS LA FONCTION DES CELLULES MICROGIALES (MACROPHAGES) entraînant une perte de myéline qui recouvre les axones

87 ABCD1 Cellules souches hématopoïétiques CD34 ABCD1

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