Les Cellules Souches. Matthieu ROULEAU. INSERM U898 Université de Nice-Sophia Antipolis - FRANCE
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- Louise Rochefort
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1 Les Cellules Souches Matthieu ROULEAU INSERM U898 Université de Nice-Sophia Antipolis - FRANCE
2 Plan de la présentation 1ere partie : Introduction générale Définitions, concepts Propriétés des cellules souches Les différents types de cellules souches 2ieme partie : Focus sur les cellules souches embryonnaires et adultes au travers d exemples Les cellules hématopoiétiques adultes Les cellules souches épidermiques adultes Les cellules souches embryonnaires Les cellules pluripotentes induites ips Conclusion / Débat
3 Qu est-ce qu une cellule souche? Quelle est sa fonction au sein d un tissu ou d un organe? Une cellule souche va assurer: l homéostasie à long terme du tissus/organe Maintien tout au long de la vie de l individu de la fonction du tissu/organe la réparation du tissus en cas de lésion
4 Plasticité des cellules souches Invertébrés: hydre Regénère même sa tête!! Persistence d une niche de Cnidaires: méduses, les coraux, les anémones de mer et autres polypes. cellules pluripotentes, recrutées en cas de lésion. Coupé, formera autant de vers complets!! plathelminthe: vers plats
5 Vertébrés: Plasticité des cellules souches Cicatrisation (Days 1-2) amphibiens nocturnes, de l ordre des urocèles salamandre régénère tous ses membres (mais aussi œil, queue, portions de cœur) Dé-differenciation (Days 3-12) Formation du blastème (Days 13-21) Les cellules à proximité de la lésion (surtout fibres musculaires) se dé-différencient pour former un blastème régénératif contenant des progéniteurs mésenchymateux. Re-differenciation (Days 22-40)
6 Plasticité des cellules souches Morphallaxis (allaxis= exchange) La régénération d une partie du corps se fait par une réorganisation cellulaire et structurale avec un nombre restreint de nouvelles cellules (pas de prolifération) De-differenciation Differenciation Cellules souches ou progénitrices Hydre Proliferation Differenciation La régénération se fait par recrutement de néoplastes en dehors de l organe bléssé (forte prolifération) Epimorphosis Salamandre Tissus des mammifères
7 Plasticité des cellules souches A quoi est due cette incapacité régénératrice chez les Mammifères à l âge adulte? Absence de persistence de cellules pluripotentes? (Hydre) Limitation du niveau de dé-différenciation? (Salamandre) Mais conservation d un certain nombre de caractéristiques typiques des cellules souches
8 Qu est-ce qu une cellule souche? Une cellule souche possède les caractéristiques uniques de: s auto-renouveler indéfiniment ou de manière prolongée se différencier c est à dire produire différentes cellules spécialisées (différenciées) Notion de Plasticité
9 Différents niveaux de plasticité Totipotence : capacité à générer toutes les cellules d un organisme y compris le tissu extra-embryonnaire = œuf fécondé Pluripotence : capacité à générer toutes les cellules d un organisme = les cellules souches embryonnaires (ES) Multipotence : capacité à générer certaines cellules constitutives d un organe = cellules souches adultes tissulaires Unipotence : capacité à générer un seul type de cellules = progéniteurs unipotents (maturation fonctionnelle d une cellule)
10 Notion d Auto-renouvellement Homéostasie tissulaire : division symétrique vs asymétrique Division cellulaire symétrique Division cellulaire asymétrique 2 SC 2 cellules engagées SC Cellule engagée Auto-renouvellement symétrique Différenciation symétrique La division d une cellule souche est asymétrique : les cellules filles ne sont pas identiques, et seule une des deux est identique à la cellule mère Maintien d un nombre constant de cellules souches (SC)
11 œuf fécondé (jour 1) stade 8 cellules (3 jours) embryon pré-implantatoire cellules souches embryonnaires (ES) Pluripotentes Evans and Kaufman Nature Thomson et al Science cellules souches fœtales Pluripotentes (?) ou multipotentes Embryon de 6 semaines cellules souches germinales Embryonnaires Pluripotentes Les différents types de cellules souches Nouveau-né cellules souches de sang de cordon Pluripotentes (?) ou multipotentes adulte cellules souches Adultes Multipotentes et unipotentes
12 Ovule fécondé (jour 1) Totipotentes (> 200 types cellulaires) blastocyste ( cellules (jour 4) stade 8 cellules (3 jours) Bouton embryonnaire (ICM = intern cell mass) Cellules souches embryonnaires Pluripotentes 1981 épiderme Neurones Ectoderme coeur muscles Lymphocytes, Mésoderme Pancréas Thyroïde Poumon Endoderme
13 Potentiel de différenciation des cellules ES cardiomyocytes Cellules gliales Neurones Muscles kératinocytes mélanocytes Cellules de la rétine Hépatocytes Îlots de Langherans adipocytes spermatogonies Cellules endothéliales ovocytes Globules rouges chondrocytes macrophages lymphocytes
14 - Auto-renouvellement: Cellules souches tissulaires - Renouvellement tissulaire:
15 Caractéristiques ristiques typiques des cellules souches tissulaires Auto-renouvellement : division cellulaire qui engendre au moins une cellule fille qui conserve le potentiel souche Multipotence : capacité à engendrer des cellules progénitrices de tous les types cellulaires composant le tissus Caractéristiques clefs pour assurer l homéostasie/le renouvellement du tissu/réparation tissulaire Quiecence in vivo, mais parfois fort taux prolifératif in vitro Notion de holo-, méro- et para-clones (Barrandon & Green PNAS 1985)) Très faible nombre in vivo Absence de marqueur spécifique Cellules difficiles à analyser Notion de «niche» une structure responsable du maitien de la CS dans un état de non différenciation
16 Concept de niches Environnement stable pour les cellules souches Les niches sont des tissus et/ou des matrices extracellulaires qui peuvent indéfiniment héberger des cellules souches et contrôler leur autorenouvellement et leur production cellulaire in vivo.
17 Les niches des cellules souches: des environnements ultra-spécialisés Follicule pileux Moelle osseuse Crypte intestinale Shofield (1978): 1) Site anatomiquement défini 2) Maintien des fonctions des CSH 3) Inhibition de la différenciation 4) Contrôle nombre de CSH 5) Capacité de réversion (?)
18 Potentiel médical des cellules souches La thérapie cellulaire réparatrice Aujourd hui : lymphome, leucémie. Transplantation de möelle osseuse, source de cellules souches hématopoiétiques Quelques essais de transplantation de cell.souches neuronales fœtales (Maladie de Huntington) Un essai clinique en cours transplantation de précurseurs neuronaux issus de la différenciation in vitro de cellules ES humaines (USA, 2009) Demain? Parkinson, maladies cardiaques, diabète
19
20 Les cellules souches adultes Renouvellement tissulaire et réparation Multipotence
21 Les différent types de cellules d origine hématopoiétique Auto-renouvellement Multipotence cellules/jours
22 Caractéristiques marquantes Choix possible entre autorenouvellement et differenciation Peuvent s expandre temporairement mais continuent à se différencier Cellules matures différenciées fonctionnelles Multipotence Auto-renouvellement Unipotence Pas d auto-renouvellement
23 Test de reconstitution in vivo Capacité à régénérer un système hématopoïétique complet à long-terme chez une souris irradiée Irradiation létale Moelle osseuse/csh 2-5 mois 1) Survie (progéniteurs), 2) Prise de greffe (% chimérisme) 3) Transplantation en serie Seul test des CSH les plus pluripotentes!! Seule 1 sur cellules de moelle osseuse possède cette capacité de reconstitution à long terme
24 Structure de l épiderme Les différentes strates de kératinocytes différenciés (épithélium pluristratifié) C est un tissu qui se renouvelle en permanence Le renouvellement de la peau se fait en 2-3 semaines Comment assurer à la fois le renouvellement et la différenciation?
25 Homéostasie épidermique : Plutôt division asymétrique Développement embryonnaire précoce Épithelium buccal mb basale Stratification durant la morphogénèse protéines de polarité Follicule pileux SC intégrines, fact. de croissance Homéostasie de l épiderme adulte Asymetric spindle orientation Numb 1 2 D après s C Blanpain & E Fuchs Nature Rev Mol Cell Biol,, 2009
26 Homéostasie cutanée : Modèle de l EPU (Epidermal proliferative unit) Stratum corneum epidermis Basement membrane Dermis TA cell Stem cell TA cell Mesenchymal connective tissue Dermal cells Granular layer Spinous layer K1, K10 Basal Layer (K5/K14) Auto-renouvellement Cell. souche transient amplifying (TA) cells Potten C. et al. (1979) BBA MacKenzie IC (1997) JID
27 Identifier les cellules souches épidermiques > In vivo : quiescence > LRC (BrdU, 3 H-Thy, Hist H2B, ) LCR = labelled retaining cells > In vitro : fort potentiel prolifératif Utilisation clinique >20 ans pour traiter les grands brûlés (Expantion d un facteur de l ordre de ) Surface : 6 bright CD71 dim ß1 bright MTS-24 (UI cells) Nucléaire : Np63 Blimp1 (GS) Cytoplasmiques : CD34 (bulge) K19, K15, Lgr5 Cellules souches ou progéniteurs?
28 Différentes localisations des Cellules Souches (CS) épidermiques Epiderme interfolliculaire Jaks, Nature Gen, 2008 Germe folliculaire IIaire (début d anagène) CS multipotentes (Lgr5+ cells) Isthme supérieur Nijhof, Development, 2006 Jensen, J Cell Science, 2008 CS multipotentes (qq évidences) (MTS24+ cells) Matrice Bulge Glande sébacée Progéniteurs (Blimp1+ cells) CS multipotentes (très nb évidences) Progéniteurs (TA cells - amplification transitoire) Ghazizadeh, Embo J, 2001 Horsley, Cell, 2006 Oshima, Cell, 2001 Blanpain, Cell, 2004 etc Et différents niveaux de «stemness» (potentiel souche).
29 Homéostasie épidermique : destinée des Cellules Souches du bulge pendant la cicatrisation Expérience de tracabilité à long-terme (marquage génétique) Epiderme interfolliculaire (IFE) Migration des cellules marquées dans l épiderme inter-folliculaire blessé, puis disparition progressive une fois la plaie refermée. Tumbar et al, Science, 2004 Ito et al, Nature Med, 2005 Levy et al, Faseb J, 2007
30 Home sweet niche Exemple de la niche épidermique SCE SCE Progéniteur multipotent épiderme Follicule pileux Notch Wnt (ß-catenin/LEF1) c-myc Cell. différenciées Glande sébacée Gat et al. (1998) Cell Lowell et al. (2000) Curr Biol
31 Les Cellules ES humaines (hues) 1ère publication : cellules Projet parental (surnuméraire) 5 jours Projet de recherche oeuf fécondé in vitro embryon pré-implantatoire ( cellules) Cellules embryonnaires issues de FIV
32 Pluripotence des cellules souches embryonnaires Différenciation in vivo intestin rein os neuroectoderm e Tératome: Tumeur bénigne ou maligne formée à partir de tissus multiples étrangers à la région qui l'entoure
33 Les Cellules ES humaines (hues) Cellules souches embryonnaires kératinocytes cardiomyocytes Neurones Muscles adipocytes mélanocytes lymphocytes chondrocytes Hépatocytes Cellules endothéliales ovocytes Îlots de Langherans spermatogonies Modèle cellulaire: Tests pharmacologiques Toxicologie Développement embryonnaire Thérapie cellulaire Allogénie Correction génique possible
34 Conditions d utilisation des cellules ES en thérapie - Savoir et pouvoir cultiver durablement les cellules ES humaines - Contrôler leur différenciation de manière sélective - Pureté cellulaire: FACS, sélection génique, clones - Contrôler le rejet de tissus - Eviter les tératomes (indiff. cells?) - Problème d éthique lié à l utilisation d embryons surnuméraires
35 Différences entre cellules souches adultes et cellules souches embryonnaires Adultes Différenciation limitée : multipotence au mieux Embryonnaires Différenciation illimitée: pluripotence Rares dans les tissus matures Présentes en grand nombre Difficiles à cultiver in vitro Faciles à cultiver in vitro Plus éthiques que les cellules souches embryonnaires
36 Les cellules souches pluripotentes induites ips Reprogrammation Induced pluripotent stem cells Avantages: Cellules différenciées Pas de pb éthique ( hes) autologues Problèmes à résoudre pour la thérapie: Utilisation de virus Protocoles de différenciation
37 Utilité et perspectives d utilisation des cellules pluripotentes Etude des stades précoces du développement: - Déterminer les conditions de différenciation - Comprendre les pathologies congénitales. Tests pharmacologiques: - Remplacer en partie essais de toxicité sur l homme (phase 1). - Tests des effets tératogènes de produits (Thalidomide). Utilisation en thérapie cellulaire: - Neurodégénératrices: Parkinson, sclérose en plaque, Alzheimer, chorée de Huntington, para-tétraplégie. - Déficit cellulaire: diabète de type I; infarctus du myocarde; hépatite. - Manipulation génique des ES avant transplantation pour corriger un phénotype pathologique,. Délivrance de médicaments - Production massive de protéines recombinantes ou endogènes Regénération tissulaire contre le viellissement Thérapie des cancers?
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