Plateforme Métabolisme-Métabolome, IFR87, Bâtiment IBP, Université Paris Sud XI, Orsay cedex, France
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- Andrée Cormier
- il y a 8 ans
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1 Référence Qualité--- PROCEDURE _ PMM PCRE_PO Injection des échantillons en GC/TOF-MS SOMMAIRE I. OBJET ET DOMAINE D APPLICATION II. REFERENCES III. TERMES, ABREVIATIONS ET DEFINITIONS IV. SECTIONS DE PROTOCOLE 1. Contact 2. Hygiène et sécurité 3. Principe de la méthode 7. Matériels nécessaires 8. Réactifs (chimiques et biologiques) 9. Etape 1 : Préparation du réactif de méthoxymation et du mélange d alcanes 10. Etape 2 : Vérifications et réglages du GC-TOF 11. Etape 3 : Dérivation de l échantillon 12. Etape 4 : Injection de l échantillon 13. Etape 5 : Vérifications et exportation des données V. CHANGEMENT DU PROTOCOLE VI. ANNEXES 1. Méthode du passeur automatique d échantillons 2. Méthode de chromatographie en phase gazeuse 3. Méthode du spectromètre de masse DIFFUSION Comité exécutif Direction Responsable qualité Ingénieurs Techniciens Thésards Rédacteur Date Lecteurs Approbateurs Visa Mme GILARD 12/05/10 M. TCHERKEZ Melle. MAUVE M. TCHERKEZ Melle. MAUVE Indice/Version Nature de l évolution Responsable de l évolution Date 2 Ajout des méthodes AS, GC et MS Mme GILARD 12/08/10
2 I. OBJET ET DOMAINE D APPLICATION Protocole d injection des échantillons en GC/TOF-MS pour l analyse quantitative des métabolites polaires. II. REFERENCES Ce protocole est basé sur une méthode publiée dans : Metabolomics 2007, 3 : Protocole d extraction des échantillons PCRE_PO Fiche de suivi d injection GC/TOF-MS PCRE_PO3005_EN Procédure de récupération des données PCR_PO Traitement des données GC/TOF-MS PCR_PO3006 III. TERMES, ABREVIATIONS ET DEFINITIONS GC : Gas chromatography (Chromatographie gazeuse) MS : Mass Spectrometry (Spectrométrie de masse) TOF : Time Of Flight (temps de vol) GC/TOF-MS : Spectrométrie de masse avec analyseur à temps de vol couplée à la chromatographie gazeuse IV. SECTIONS DE PROTOCOLE 1. Contact Pilote procédé : Françoise Gilard poste : mail : francoise.gilard@u-psud.fr 2. Hygiène et sécurité Manipulation de produits corrosif, irritant, inflammable, toxique, nocif. Les préparations de solutions et la manipulation de l échantillon se réalisent sous la hotte et avec gants. 3. Principe de la méthode Cette méthode s applique aux aliquots obtenus suite au protocole d extraction (PCRE_PO7024), appliqué à une série d échantillons d un même projet et à un «blanc de mortier». Elle a pour but l identification et la quantification de tous les métabolites présents dans les échantillons, sans à priori sur la nature des composés à rechercher. Elle consiste à : 4. rendre les métabolites volatilisables par dérivation, 5. introduire une solution d alcanes pour le calcul des indices de rétention,
3 6. injecter les échantillons en GC/TOF-MS Au cours d une journée, le protocole pourra être appliqué successivement à un, deux ou trois lots ne dépassant pas 4 échantillons. En effet, les dérivés préparés ne sont plus stables au-delà de deux heures et l analyse d un échantillon dure environ 30 minutes. La fiche de suivi d injection GC/TOF-MS PCRE_PO3005_EN3007 sera complétée lors de chaque journée d injection. Les données obtenues par cette méthode d analyse seront : récupérées selon la procédure de récupération des données PCR_PO7055 traitées selon la méthode traitement des données GC/TOF-MS PCR_PO3006. Contenu du mode opératoire Etape 1 : Préparation du réactif de méthoxymation et du mélange d alcanes (la veille de l injection) Etape 2 : Vérification et réglages du GC-TOF (à commencer en début de matinée) Etape 3 : Dérivation de l échantillon Etape 4 : Injection de l échantillon 7. Matériels nécessaires - gants - hotte - plaque chauffante - vortex - incubateurs à 30 et 37 C. - balance de précision - spectromètre de masse LECO Pegasus III - GC Agilent 6890N 8. Réactifs (chimiques et biologiques) -Méthoxyamine, -Pyridine, -Hexane -MSTFA, -Adonitol, -Decane -Pentadecane, -Octadecane, -Nonadecane, -Docosane, -Octacosane, -Dotriacontane, -Hexatriacontane. 9. Etape 1 : Préparation du réactif de méthoxymation et du mélange d alcanes Préparation du réactif de méthoxymation 1) Utilisation des produits suivants : Méthoxyamine (Aldrich ; CAS ) MM=83.52 Pyridine (Fluka ; CAS ) MM=79.10 Les produits sont stockés à l air ambiant. 2) Solution de méthoxyamine à 20 mg/ml dans la pyridine. 3) Stocker à l air ambiant. La solution sera repréparée à chaque nouveau projet ou toutes les 2 semaines. Noter la date de préparation de la solution. Préparation d une solution d alcanes pour le calcul des indices de rétention 1) Utilisation des alcanes suivants : Decane (Fluka ; CAS ) MM= Pentadecane (Fluka ; CAS ) MM=212.42
4 Octadecane (Fluka ; CAS ) MM= Nonadecane (Fluka ; CAS ) MM= Docosane (Fluka ; CAS ) MM= Octacosane (Fluka ; CAS ) MM= Dotriacontane (Fluka ; CAS ) MM= Hexatriacontane (Fluka ; CAS ) MM= Hormis l octadécane qui est dans le réfrigérateur de la salle 2.50 (boîte GC-C-IRMS), les produits sont stockés à l air ambiant. 2) Préparer des solutions mères dans l hexane pour chaque alcane : 100 mm pour le Decane, le Pentadecane, l Octadecane, le Nonadecane et l Octacosane 20 mm pour le Dotriacontane et l Hexatriacontane. (Chauffer au bain-marie jusqu à complète dissolution) 3) Préparer un mélange d alcanes à une concentration de 7 mm pour le décane et 1.4 mm pour chaque autre alcane. Protéger les tubes par un parafilm et stocker les solutions d alcanes dans le réfrigérateur de la salle 2.50 sur le portoir «GC/MS-TOF» Alcanes Formule S0 (mm) FW (g/mol) mthéo (mg) pour 1000 µl Préparation des solutions mères S0 mpesée (mg) V (µl) Préparation du mélange d'alcanes V de S0 (µl) Melange Final Decane C10H Pentadécane C15H Octadécane C18H Nonadecane C19H Docosane C22H Octacosane C28H Dotriacontane C32H Hexatriacontane C36H Somme 280 Hexane 720 La solution sera repréparée à chaque nouveau projet ou toutes les deux semaines. Noter la date de préparation de la solution. 10. Etape 2 : Vérifications et réglages du GC-TOF Compléter la fiche de suivi d injection GC/TOF-MS PCRE_PO3005_EN3007 à chaque étape de ce protocole. A : Vérifications 1) Rallumer les écrans s ils sont éteints. Si le logiciel LECO n est pas ouvert, se connecter en cliquant sur l icône correspondante : Pegasus.lnk
5 La fenêtre suivante apparaît : Appuyer sur le bouton Login 2) Dans la fenêtre qui s affiche, en bas à droite : Vérifier le vide : entre 1 et 2 e-7 torr Vérifier les températures de la source et de la ligne de transfert en fonction de celles désirées dans les méthodes d'analyse. 3) Dans le menu Instrument, aller dans Diagnostic : Quand il y a n'y a pas de faute au niveau de l'appareil (paramètres électriques et électroniques), aucune case de la fenêtre n'est cochée. Si l'une de ces cases est validée, il faut alors vérifier dans l'onglet correspondant d'où provient l'erreur (température, vide, tensions des lentilles,...). Pour que l'instrument fonctionne bien, il faut aussi que toutes les cases du cadre Relays soient cochées. 1) Tuning B : Réglages du GC-TOF
6 Le tuning se fait par rapport à un produit de référence (PFTBA) qui est déjà disponible dans la machine et prêt à être injecté (vérifier à chaque fois si il en reste le PFTBA est stocké dans une ampoule près de la source d'ionisation). PFTBA : Tous les paramètres du spectromètre de masse (paramètres électroniques, réglage de la source d'ionisation, du tube à temps de vol et du détecteur, optimisation de l'intensité relative et de la résolution des ions correspondant au PFTBA, calibrage des masses...) sont optimisés sur les pics caractéristiques de ce composé: 69, 131, 219, 414, 502, 614 Lancer le tuning : Quality Control rien 1. Aller dans «Acquisition Tasks», cliquer sur + pour créer une ligne de données comme suit : Type Folder Name Status Vial Repet Acquisition System Adjust 3 AS GC MS DP 2. Appuyer sur la touche «Entrée» du clavier et créer une autre ligne de données (en appuyant sur le bouton +) : QC rien Type Folder Name Status Vial Repet Filament Focus AS GC MS DP Appuyer sur la touche «Entrée» du clavier. 2 autres lignes se créent automatiquement (Ion Optic Focus et Mass Calibration)
7 3. Pour lancer le tuning, sélectionner les 4 lignes créées à l aide de la souris et de la touche shift, puis relever le bouton «pause». L optimisation des paramètres de l appareil va durer une quinzaine de minutes. 4. Ensuite, pour savoir si le tuning est bon, aller dans le menu «View» puis «Log...» Vérifier si la phrase : "Not enough improvement keeping original values" est écrite. Si les paramètres sont inchangés par rapport au tuning précédent, alors l'optimisation des réglages est bonne. En revanche si cette phrase n'apparaît pas, il faut relancer un tuning de façon à obtenir les meilleurs paramètres possibles pour le spectromètre de masse. 2) Vérification du bruit de fond : Il faut que le rapport m/z 18(H 2O) sur m/z 28(N 2) soit compris entre 1 et 3. Dans le cas où le fragment m/z 28 (N 2 : air) est plus intense que le fragment de m/z 18 (H 2O : eau) : cela signifie qu'il y a une fuite. Dans la fenêtre Database / Acquired Samples / dossier BKG, vérifier qu un sous-dossier au nom du mois courant existe. Sinon le créer (clic droit sur la souris et cliquer sur New, nommer suivant le modèle : mois+année correspondante) Aller dans «Acquisition Tasks», cliquer sur + pour créer une ligne de données avec : QC no daily tune Type Folder Name Status Vial Repet Sample Dossier du mois courant BKGdate-A AS GC MS 3 BKG DP
8 - Généralement, on fait 2 séries de 3 répétitions pour vérifier le bruit de fond. Donc, on réécrit une ligne de données semblable à celle ci-dessus mais avec un autre nom : BKG-date-B - Relever le bouton pause pour lancer le test du bruit de fond - Pour chacune des analyses de bruit de fond (durée 1 min), le lancement se fait manuellement: une fenêtre s'ouvre avant chaque analyse pour confirmer ou non le démarrage du test. - Ouvrir les fichiers créés, et afficher les ions m/z 18, 28, 32 et 44 en cliquant sur E. - Noter les intensités de ces ions au dos de la fiche de suivi. Calculer BKG par la formule : BKG = intensité de m/z 18 intensité de m/z 28 - Si le bruit de fond n est pas bon, contacter le pilote-procédé. Il pourra resserrer l écrou entre la colonne chromatographique et la ligne de transfert vers le spectromètre de masse (connexion souvent propice à une microfuite!) Si cette opération est insuffisante, il faudra chercher d'autres endroits à partir desquels une fuite est possible. 11. Etape 3 : Dérivation de l échantillon La manipulation de l échantillon se réalise sous la hotte et avec gants. 1) Ajouter 50 µl de la solution de méthoxyamine, vortexer et incuber avec agitation constante 90 min à 30 C (pièce 1.31 ou 0.09). Pendant l incubation, suivre les points 1 à 4 de l «Etape 4 : Injection de l échantillon». 2) Ajouter 80 µl de MSTFA, vortexer et incuber avec agitation constante 30 min à 37 C (pièce 1.31). Les cônes seront jetés dans les déchets chlorés. Le MSTFA est stocké dans le réfrigérateur de la salle 2.50 sur le portoir «GC/MS-TOF». Au besoin, remplir le tube de MSTFA avec une ampoule rangée dans le tiroir gauche du réfrigérateur (Sigma M7891 ; CAS ; MM=199.25) 3) Laisser reposer 2 heures avant injection au GC/MS à température ambiante. Quelques minutes après le début de ce temps de repos, l «Etape 3 : Dérivation de l échantillon» peut être recommencée pour un nouveau lot de 4 échantillons ou moins. Moins de 20 minutes avant injection, transférer dans un vial contenant un insert ajouter 10 µl de la solution d alcanes et vortexer. 12. Etape 4 : Injection de l échantillon 1) Les flacons de solvant et de poubelle (gros vials Agilent au niveau de la tour d injection) sont rangés dans une boîte «vials Agilent LECO» placée sous la hotte en Ce rangement est effectué systématiquement à la fin de chaque projet, pour éviter les émissions de vapeur d hexane et de réactifs dans la pièce. Si ces flacons ne sont pas présents, replacer : 2 vials de solvant en position A 11 et B 8 4 vials poubelle sur les positions WA 5, WA 4, WB 3 et WB 2. Vérifier le niveau de solvant (hexane) dans les vials A et B, compléter si besoin. Une bouteille d hexane est prévue à cet effet en ) Avant chaque série d analyse, injecter un ou deux blanc(s) (injection du solvant de rinçage, l hexane, dans un vial sans insert) dans les mêmes conditions d analyses que les échantillons analysés par la suite.
9 Créer une ligne de données avec : QC GC Type Folder Name Status Vial Repet AS no daily tune Sample A créer dans Acquired Samples A créer suivant les analyses que l on fait Regarder le numéro sur le plateau de l injecteur 1 Méthode du passeur d'échantillon automatique Méthode de la GC MS Méthode du MS DP Méthode de traitement des données Folder : Dans la fenêtre Database / Acquired Samples, utiliser ou créer un sous-dossier au nom du projet (clic droit sur la souris et cliquer sur New, nommer suivant le modèle : Année + mois+ Nom). Vial : Utiliser de préférence les positions 60, 65, 70 et 75 du passeur d échantillons. Méthodes : Les différentes méthodes utilisées dépendent de l injection. Injection de l hexane Injection du mélange d alcanes ou d un échantillon AS 1 µl AS (voir VI. Annexe ou fiche de suivi) GC GC GC (voir VI. Annexe ou fiche de suivi) MS MS MS (voir VI. Annexe ou fiche de suivi) 3) Au début de chaque projet, injecter le mélange d alcanes frais. Mélanger 10 µl de la solution d alcanes et 130 µl d hexane dans un vial contenant un insert. 4) Vérifier le Blanc (absence de pics de pollution) et le mix d alcanes (présence de 8 pics m/z 85 caractéristiques des alcanes). 5) Injecter les échantillons en ayant pris soin de respecter exactement 2 heures de repos prévues à la fin de l étape 2 de ce protocole (Dérivation de l échantillon). 13. Etape 5 : Vérifications et exportation des données 14. Après la fin des injections, vérifier que les fichiers d acquisition de chaque échantillon ont bien été créés dans «Acquired Samples». 15. Archiver le répertoire du projet par la suite de commandes «Database» / «Backup to archive» «Suivant» sélectionner le sous-dossier à archiver par «Select» ne pas cocher la case «delete selected samples after archive is complete» et cliquer sur «Suivant» donner à l archive le même nom que le projet et cliquer sur «Terminer» 16. Suivre la procédure de récupération des données PCR_PO7055 en respectant bien la règle de nommage des répertoires. 17. Eteindre les écrans. 18. Ranger les petits vials d échantillons dans la boîte «vials d échantillons LECO» et les gros vials solvant et poubelle ans la boîte «vials Agilent LECO». Replacer ces boîtes sous la hotte en 0.43.
10 V. CHANGEMENT DU PROTOCOLE VI. ANNEXES Cette section décrit les méthodes utilisées dans le logiciel ChromaTOF pour piloter l appareillage lors des injections d échantillons 1. Méthode du passeur automatique d échantillons La méthode «AS» standard est : AS = 1 µl insert sans ressort Agilent - 2 Appareil utilisé Agilent 6890 Volume de la seringue 10 µl Volume injecté 1 µl Nombre de pompage de l échantillon 7 Rinçage de la seringue par l échantillon avant l injection 2 Rinçage de la seringue par le solvant après l injection 10 Niveau de l échantillon Méthode de chromatographie en phase gazeuse La méthode «GC» standard est : GC = OF 15C/min Transfer Line 330C splitless flow 0.7 Appareil utilisé Agilent 6890 Colonne chromatographique RTX5 Longueur 40 m Diamètre interne 250 µm Epaisseur 0.25 µm Température maximale 360 C Gaz vecteur Hélium Débit constant 0.7 ml/min Mode d injection splitless Température de l injecteur 230 C Rampe de température 80 C 15 C/min 330 C 6 min 2 min Vitesse d acquisition 20 Hz
11 3. Méthode du spectromètre de masse La méthode «MS» standard est : MS = OF Test-DetectorVoltage 1600SD290 Appareil utilisé Pegasus III Temps d analyse Temps Méthode GC Délai de solvant 290 sec Gamme de masse Taux d acquisition 20 spectres/sec Détecteur Tension du détecteur 1600 V Source d ionisation Tension du filament -70 V Température de la source 200 C Masses affichées pendant l acquisition TIC
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