Stéphane Priet. Research Group Viral Replicases: Structure, Function & Drug Design. Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB)

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1 Stéphane Priet Research Group Viral Replicases: Structure, Function & Drug Design Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB) CNRS UMR Aix-Marseille Université

2 - Les polymérases - Les antiviraux - Trois exemples: Acyclovir Efavirenz Ribavirine 2

3 Les polymérases Enzymes qui synthétisent un polymère d'arn ou d'adn en utilisant des NTPs ou dntps Rôles biologiques dans la cellule: - maintien de l information génétique, génération des copies du génome = réplication - génération d un ARN messager à partir de l ADN = transcription 3

4 Classement de l "Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology" L' "EC number" (Enzyme Commission number) est une classification des enzymes basée sur la réaction qu'elles catalysent EC 2. Transférases EC 2.7. Transférases d un groupement contenant un phosphore (polymérase et kinase) EC Nucleotidyltransférases (transfert d'un NMP sur un groupement OH) - Matrice indépendante Les polymérases EC Polynucleotide adenylyltransferase (poly(a) polymerase) - utilisant une matrice (synthèse d'un brin complémentaire et antiparallèle à la matrice) matrice produit EC DNA-dependent RNA polymerase (DdRp, ex: RNApol) EC DNA-dependent DNA polymerase (DdDp, ex: DNA polymerase I) EC RNA-dependent RNA polymerase (RdRp, ex: polymérase HCV, Dengue) EC RNA-dependent DNA polymerase (RdDp, ex: RT HIV) 4

5 Les polymérases 5 Poly(A) polymérase - mimivirus (ds DNA) - variole (small pox) virus (dsdna) DNA-dependent RNA polymerase (DdRp) - mimivirus - variole DNA-dependent DNA polymerase (DdDp) - mimivirus - variole - herpesvirus, varicella-zoster virus (dsdna) RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) - poliovirus (+ssrna) - dengue virus (+ssrna) - influenza virus (-ssrna) 30nm, 7,5kb RNA-dependent DNA polymerase (RdDp or RT) - HIV (+ssrna) - hépatite B virus (dsdna) 42nm, 3kb 100nm, 13kb variole, vaccinia 250nm, 250kb 50nm, 11kb 80nm, 10kb mimivirus 400 nm, 1200kb herpes 170nm, 125kb

6 DdDp (cellulaires ou virales) RdRp (virales) dsdna +/-ssrna dsrna Les polymérases new dsdna new +/-ssrna Mécanisme spécifique des RdRp virales (pas d équivalents cellulaires!) è cibles privilégiés pour antiviraux 6

7 Transcription - production des ARN messagers DdRp (cellulaires ou virales) mrna dsdna RdRp -ssrna mrna mrna Rétro-transcription production d ADN complémentaire à partir d ARN (RT) Les polymérases +ssrna ou mrna ssrna/dna dsdna Mécanisme spécifique des RdRp et RT virales (pas d équivalents cellulaires!) è cibles privilégiés pour antiviraux 7

8 convention sur la numérotation des atomes de carbone du ribose ou désoxyribose (2 sans OH) d un nucléotide Les polymérases 4' 5' 3' OH OH 1' 2' 8

9 5' G 3' O OH 5' C 3' OH OH Les polymérases γ 4' 5' 3' OH OH Les polymérases connectent toujours le groupement 3 -OH d un nucléotide déjà incorporé au phosphore α d un groupement phosphate lié au carbone 5 du NTP à incorporer. β α 1' 2' 9

10 - dépendant d une amorce : ADN 5 pppa-pg-pc-pt-oh 3 ARN 5 pppa-pg-pc-pu-oh 3 NH NH 2 -Gly-Ala-Trp-Glu-NH-CH-CH HC H 2 C 2 OH Protéique C=O CO Ser-Pro----Asp-COOH Les polymérases - indépendante d une amorce (initiation de novo) : NTP OH OH 10

11 3 5 3 Site actif deux acides aspartiques Les polymérases site actif Amorce et ion catalytique Mg 2+ A sont liés 11

12 3 5 3 NTP à incorporer Site actif deux acides aspartiques Les polymérases site actif Amorce et ion catalytique Mg 2+ A sont liés NTP entre dans le site actif avec le Mg 2+ B 12

13 3 5 3 NTP à incorporer Site actif deux acides aspartiques Les polymérases site actif Amorce et ion catalytique Mg 2+ A sont liés NTP entre dans le site actif avec le Mg 2+ B Attaque nucléophile de l'oxygène 3' sur le phosphate α Formation d'une liaison phosphodiester et libération d'un pyrophosphate inorganique (pp i ) 13

14 3 5 3 NTP à incorporer Site actif deux acides aspartiques Les polymérases 14 site actif Amorce et Mg 2+ A sont liés NTP entre dans le site actif avec le Mg 2+ B Attaque nucléophile de l'oxygène 3' sur le phosphate α Formation d'une liaison phosphodiester et libération d'un pyrophosphate inorganique (pp i ) Le NMP incorporé passe du site catalytique vers le site du "primer" et un nouveau cycle recommence

15 La synthèse d un ARN ou ADN se déroule en plusieurs étapes qui impliquent des changement conformationnels des polymérases. Les polymérases Un antiviral peut bloquer la polymérase dans une de ces conformations et peut inhiber la synthèse. 15

16 Ex: synthèse de novo (RdRp ou DdRp) Initiation matrice site actif ppp PPP 2ème nucléotide à incorporer ppp PPP 1 er nucléotide élément de la polymérase stabilisant le NTP Elongation 3 dinucléotide synthétisé avance mouvement de l élément stabilisateur Les polymérases 5 3 matrice 3 PPP 3 site actif 5 matrice amorce 5 3 distributive dissociation du complexe ternaire possible accumulation de produits courts «abortifs» PPP 3 amorce 5 processive complexe ternaire stable synthèse continue jusqu'à la fin 16

17 Incorporation de NTPs marqués radioactivement lors d'une cinétique : accumulation des produits intermédiaires et finaux visualisée sur gel de polyacrylamide T7 DdRp (DNA virus) HCV RdRp (+RNA) Phase processive Les polymérases Phase distributive 17

18 Ex: T7 RNApol pppggg RNA product Les polymérases 3 dans le site active Changement du sous-domaine N-terminal Création d un tunnel pour le produit l ARN ne peut plus se dissocier de la polymérase 18

19 RNA template Ex: RdRp phage 6 Cystoviridae (dsrna) sous-domaine doigts NTP sous-domaine pouce 3 Les polymérases dsrna exit Asp catalytiques sous-domaine paume motifs catalytiques 19

20 RNA template Ex: RdRp phage 6 Cystoviridae (dsrna) sous-domaine doigts NTP sous-domaine pouce 3 Les polymérases élément stabilisateur du premier NTP plateforme d initiation Asp catalytiques sous-domaine paume motifs catalytiques 20

21 Nter 30 kda not shown RdRp (55 kda) poliovirus (+ssrna) + dsrna product DdRp (98 kda) T7 bacteriophage (dsdna) + dsdna + RNA RNAseH Exonuclease Les polymérases 21 p51not shown RT (heterodimer 66kDa + 51kDa) HIV (+ssrna) DNA/RNA primer/template RNAseH? DdDp (110 kda) herpes simplex virus (dsdna) + dsdna product

22 - Même principe catalytique (deux Asp catalytiques, Mg 2+ - dépendent) - Grands principes d architecture similaires (repliement «main droite», doigts-paume-pouce, tunnels matrice, entrée des (d)ntp, sortie produit) - Motifs catalytiques conservés (sous-domaine paume) Les polymérases mais - Fonctionnellement et structuralement très complexes, plutôt flexible - Beaucoup de différences locales offrent de multiples manières d inhibition spécifiques 22

23 - Activité primordiale pour la réplication des virus - Interviennent plusieurs fois pendant la réplication virale (réplication, transcription du génome) Les polymérases - Multiples réactions (pour la génération d une copie du génome à réactions enzymatiques de transfert d un NTP ou dntp) - Absence d homologues cellulaires (RdRp, RT) - Cibles antivirales vérifiés en clinique (herpes, HIV, HBV) 23

24 Antiviral = médicament qui ralentit/empêche une infection virale principe générale : baisse de la virémie dans un patient infecté è idéalement guérison des patients arrêt de la transmission è ralentit une épidémie Les antiviraux principes d action diminution : - de l infection des cellules cibles par le virus - relargage et de la réplication de génome virale - de l'assemblage du virus et de la sortie des cellules infectées 24

25 exemple: antiviraux en développement contre virus de la dengue Les antiviraux Cycle viral virus de la dengue Flavivirus Flaviviridae (+ssrna) 25

26 1. le développement de vaccins peut être difficile - à cause du réassortiment génétique exemple: virus de la grippe - dans le cas des infections persistantes exemple: HIV - à cause d'existence de plusieurs sérotypes exemples: virus de la dengue 4 sérotypes Les antiviraux 2. vaccination exhaustive est coûteuse ou difficile exemples: virus de la fièvre jaune, virus rougeole (encore morts par an chez les jeunes enfant!) 26

27 3. après l éradication d une maladie virale par vaccination exemple poliovirus but de l OMS - arrêter transmission fin 2012 après arrêt de la vaccination pour éviter infection à cause du vaccin (vaccin orale - virus «vivant» mais atténué) antiviraux devient très important Les antiviraux exemple variole (smallpox) maladie déclarée éradiquée en 1980 vaccin existe (virus atténué, effets latéraux) le virus existe dans des laboratoires surveillées danger bioterrorisme programme développement d antiviraux lancé en

28 1. impact sur la santé publique symptômes assez sévères et/ou épidémies répandues plutôt que locales (marché?) 2. existence d une fenêtre temporelle pour le traitement infection chronique avantage: fenêtre temporelle thérapeutique large inconvénient: de préférence administration par voie orale effets secondaires plus sévères d'un traitement long infection aigüe avec une virémie à longue durée ou avec une diagnostic rapide Les antiviraux avantage: administration par voie intraveineuse possible effets secondaires moins importants traitement court 3. lien entre la charge virale et la sévérité des symptômes dosage différentielle après diagnostique possible 4. modèle animal indispensable 5. essais cliniques doivent être faisables 28

29 Exemple: le développement d un antiviral contre la dengue est envisageable 1. dengue a un impact considérable sur la santé publique syndrome de type grippal sévère fièvre hémorragique Les antiviraux millions d infections annuelles cas de fièvre hémorragique morts

30 Exemple: le développement d un antiviral contre la dengue est envisageable 2. infection aigüe mais un diagnostique rapide est possible (NS1) Incubation Clinical Symptoms IgM Ab diagnostics too late IgG Days D-14 a D-3 D0 D+4/+7 D+15 Les antiviraux Viremia Detection of the virus (cellular culture, 6 days) ARN viral (PCR, expensive) Viral protein NS1 in the blood (2008 commerical kits from Bio-Rad, Panbio) Kumarasamy et al. (2007) J Virol Methods 140:75; Libraty et al. (2002) J Inf Dis 186:1165

31 Exemple: le développement d un antiviral contre la dengue est envisageable 3. il y a une corrélation entre le niveau de NS1 (virémie) et la sévérité des symptômes (fièvre hémorragique) 4. modèle animal depuis études cliniques possible mais difficile 6. developpement d un vaccin compliqué par l existense de 4 sérotype Les antiviraux dès 2005 augmentation du nombre de projets de développement d un antiviral contre la dengue (recherche publique et industrielle)

32 Exemples d antiviraux en clinique ou en développement virus infection molécules protéine ou étape cible aigüe ou chronique Les antiviraux 32 Herpes chronique Acyclovir polymérase (Herpesviridae) Tromantadine entrée (fusion) HIV(Retroviridae) chronique Enfurvitide entrée (GP41 fusion) Efavirenz polymérase Ritonavir protéase Hepatitis B chronique Adefovir polymérase (Hepdnaviridae) Influenza A aigüe Amantadine M2 (Orthomyxoviridae) Onseltamivir neuraminidase (sortie) Arbidol entrée (fusion) HCV chronique Ribavirin polymérase / réplication (Flaviviridae) Telaprevir protéase Boceprevir protéase En développement Variole aiguë ST-246 F13L (maturation) (Poxviridae) Herpes chronique PNU polymérase HIV chronique Vicriviroc CCR5 (co-receptor) Influenza A, B aigüe Peramivir neuraminidase (sortie) Favipiravir (T-705) polymérase HCV chronique Setrobuvir polymérase VX222 polymérase Rhinovirus aigüe WIN uncoating (Picornaviridae) Pleconaril VP1 (receptor-binding) à large spectre

33 exemples d'antiviraux qui ciblent les polymérases : - spécifiques Acyclovir - inhibiteur DNA polymérase herpes virus Adefovir - inhibiteur RT hépatite B Efavirenz - inhibiteur RT HIV Les antiviraux - à large spectre Cidofovir - inhibiteur DNA polymérases viral (cytomegalovirus, herpes) Favipiravir (T-705) - inhibiteur RdRp (virus ARN influenza etc.) Ribavirine - modes d action multiples (virus ARN) 33

34 Nucleoside analog inhibitors (NI) nucléosidiques (ou nucléotidiques) - souvent inhibiteurs à large spectre - activation nécessaire vers la forme tri-phosphate par des kinases - inhibiteurs compétitifs par rapport aux NTPs - souvent incorporés pendant la polymérisation (effet terminateur de chaine ou mutagénique) Les antiviraux Ex: Acyclovir - DNA polymérase Adefovir - RT hépatite B Cidofovir - viral DNA polymérases Favipiravir (T-705) RdRp Ribavirine - modes d action multiples 34

35 Non-nucleotide analogs inhibitors (NNI) non-nucléosidiques - pas d activation dans la cellules nécessaire - pas de ressemblance aux molécules présentes dans la cellule - agissent sur des sites allostériques - provoquent un changement de conformation ou bloquent la polymérase dans une conformation particulière Les antiviraux Efavirenz - inhibiteur RT HIV Setrobuvir inhibiteur RdRp hépatite C (en développement) 35

36 réponse naturelle à la pression sélective d un médicament apparition de virus mutés moins sensibles au médicament plus rapide chez le virus ARN que ADN (DdDp avec correction par l activité exonucléase) plus importante chez les personnes immunodéficientes Fonctionnement de la pression sélective : Les antiviraux pendant la réplication génération de mutations = virus existe en quasiespèces quand la réplication virale est inhibée par un antiviral les mutants résistants ont un avantage et sont donc sélectionnés nécessité de «suivre» le virus et de développer des antiviraux contre les souches résistantes 36

37 Acyclovir (Aciclovir) Zovirax ou Activir acycloguanosine 2-amino-9-((2- hydroxyethoxy)methyl)-1h-purin-6(9h)- one Exemple: Acyclovir analogue nucléosidique (NI) 37

38 Acyclovir Premier médicament antiviral (découvert en 1977, premiers essais cliniques 1982) Herpesviridae (dsdna) HSV-1 - herpès oro-faciaux, HSV-2 - herpès génital Exemple: Acyclovir VZV (varicella-zoster virus) varicelle, zona (éruption cutanée localisée et des douleurs de type brûlures) EBV (virus d'epstein-barr) - mononucléose infectieuse (MNI), infection généralement bénigne, états grippaux Infections aigües, persistantes (latente) 38

39 Inhibiteur DdDp sous forme triphosphate HO compétitif du dgtp Exemple: Acyclovir montre spécificité pour DdDp de Herpesviridae K i = 3 nm DdDp HSV-1, HSV-2 K i = 180 nm DdDp alpha humaine (x60) Inhibition de la synthèse d ADN par incorporation dans la chaine naissante terminaison de la polymérisation (pas de groupement 3 OH) 39 Derse et al. (1981) Journal Biological Chemistry 256:11447

40 Administration sous forme hydroxyle (molécules chargées ne traversent pas la membrane cellulaire) Conversion en monophosphate par la thymidine kinase virale (3000 plus efficace que TK cellulaire) Conversion en di- et triphosphate par les kinases cellulaires thymidine Exemple: Acyclovir après transport du ACV-triphosphate dans le noyau inhibition de HSV DdDp 40

41 Sustiva ou Stocrin (4S)-6-chloro-4-(2-cyclopropylethynyl)-4-(trifluoromethyl)-2,4-dihydro-1H-3,1- benzoxazin-2-one Antiviral contre HIV Exemple: Efavirenz Inhibiteur non-nucléosidique de la réverse transcriptase (NNRTI) Découvert en 1995 par drug design basé sur des NNRTIs connus «seconde génération» inhibe aussi des mutants RT qui sont résistants contre «première génération» NNRTIs 41

42 Efavirenz Mode d'action Inhibition de la synthèse d ADN, non-compétitive versus dntps et matrice Liaison à un site allostérique changement de la conformation des Asp catalytiques baisse d activité RT doigts pouce close-up backview Exemple: Efavirenz Cœur de la RT, RNA/DNA paume efavirenz DNA 3 site actif normal site actif changé 42

43 Problème des NNRTIs développement rapide de résistance Utilisation en bi- ou tri-thérapie = HAART (highly active antiretroviral therapy) exemples: efavirenz + zidovudine (NRTI azido-thymidine (AZT)) + lamivudine (NRTI - 2',3'-didéoxy-3'-thiacytidine (3TC)) Exemple: Efavirenz efavirenz + tenofovir (NRTI adenosine analog) + emtricitabine (NRTI cytidine analog) La recherche de nouveaux inhibiteurs de la RT et de HIV est toujours très active! 43

44 Rebetol, Copegas analogue nucleosidique O Exemple: Ribavirine NH 2 N N N HO O OH OH 1-(β-D-Ribofuranosyl)-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamid guanosine phosphorylation en RMP RDP RTP par des kinases cellulaires 44

45 découvert en 1972 à l'issue d'une recherche systématique d'activité antivirale des nucléosides synthétiques non approuvé par FDA (Food-Drug-Administration) à cause des effets secondaires approuvé 1998 contre hépatite C (HCV) (+ssrna (Flaviviridae)) Exemple: Ribavirine 170 millions de personnes infectées Chronicité dans 70-80% des cas Atteintes hépatiques graves Traitement interferon-α + ribavirin efficace dans 40 à 80 % des cas (génotype 2/3>1/4/5) 45

46 RTP est un NI RTP est incorporé par la RdRp en face de C et de U Exemple: Ribavirine effet antiviral par "error-catastrophe" 46

47 génération des mutations C/U, U/C ou A/G, G/A première incorporation synthèse brin -!5'-CCGAUCACGUA-3'!!!!!!3'-GGCUARUGCRU-5'! synthèse brin +!!!!5'-CCGAUUACGCA-3'!!!!!3'-GGCUARUGCRU-5'!! première incorporation synthèse brin + 5'-CCGRUCACRUA-3'!!!!!3'-GGCUAGUGCAU-5'! Exemple: Ribavirine synthèse brin -!!!!5'-CCGRUCACRUA-3'!!!!!3'-GGCCAGUGUAU-5'! synthèse brin + 5'-CCGGUCACAUA-3'!!!!!3'-GGCCAGUGUAU-5'! 47

48 ribavirine provoque une «erreur catastrophe» = mutagenèse létale les polymérases font 1 erreur tous les 10 3 à 10 5 nt les DdDp avec un domaine exonucléase corrigent 1 erreur tous les 10 7 nt les RdRp (et RT) - pas de domaine exonucléases pas de correction en présence de RTP encore plus d'erreurs x pour HCV in vitro Exemple: Ribavirine les virus à ARN existent en "quasi espèces" proche du seuil d'erreur baisse d'infectivité du virus à cause d'un taux excessif de mutations 48

49 1. ribavirine extracellulaire change la balance entre cellules T-helper 1 et T-helper 2 (diminution) et entraine augmentation production INFγ 2. ribavirine intracellulaire induit la "interferon signalling cascade" (ISG) qui déclenchent la réponse du système immunitaire inné 3. RMP inhibe la «inosin-monophosphate-dehydrogenase» (IMPDH) responsable de la formation du GTP intracellulaire effet indirect sur la RdRp virale IMPDH catalyse la conversion d inosine-monophosphate au xanthosine-monophosphate 49

50 ribavirine interféron inhibiteurs spécifiques Incivo Telaprevir (VX-950) inhibiteur protéase approuvé sept en Europe (mai 2011 aux USA Incivek ) Johnson & Johnson Exemple: Ribavirine Victrelis Boceprevir inhibiteur protéase approuvé juillet 2011 en Europe (mai 2011 aux USA) Merck 8 inhibiteurs de polymérase en phase clinique II (juin 2011) 5 NNI et 3 NI VX222 Vertex NNI but = réussite en traitement de tous les génotypes! 50

51 effets secondaires à forte dose (anémie) approuvé en "rescue therapy» pour combattre des infections sévères thérapie intraveineuse et de courte durée exemple RSV Exemple: Ribavirine respiratoire syncytial virus (RSV) -ssrna (Paramyxoviridae) RSV cause la plus fréquente infections respiratoires des jeunes enfants 34 millions de cas / an dans le monde décès = 0.3% utilisation de ribavirine dans le cas de symptômes sévères approuvé en

52 Exemples: Lassa virus (Arenaviridae) Hanta virus -ssrna (Bunyaviridae) Exemple: Ribavirine Lassa hemorrhagic fever (Afrique, cas, 5000 décès = 1.7%) cas sévères la ribavirine baisse le risque de mortalité de 55% à 5% Hantaan hemorrhagic fever with renal syndrome (Asie, décès 2 12%) utilisé depuis

53 Les polymérases virales sont des cibles par excellence pour le développement des antiviraux Beaucoup de polymérases virales n'ont pas de domaine exonucléase taux d'erreurs élevés (1 pour 10 3 à 10 5 nt) beaucoup de mutations et donc adaptations génération de résistances Développement des antiviraux spécifiques mais aussi à large spectre contre des virus émergeantes, sauvages et résistants, est un sujet de la recherche très actif. Nous essayons d être en avance sur les virus! 53

54 Plateforme de Criblage Marseille-Luminy PCML Mission: Découverte et caractérisation d antiviraux et de leurs cibles Moyens: Chimiothèque molécules Chimiothèque Nationale (23 000) Collection médicaments approuvés Prestwick (900) Chimiothéque commercial Chembridge (30 000) Collections des extraits de plantes Robots pour faire de criblages haut débit 2 fluorimetres/luminométres Compteur à scintillation (Salle radioactivité) Salle culture cellulaire Savoir-faire: Essais enzymatique sur des protéines virales polymérases (virus de la dengue, hépatite C, VIH) enzymes impliquées dans la formation de la coiffe hélicases Essais interaction protéines-protéines du complexe réplicatif Essais cytotoxicité sur cellules mammifères Essais réplication virale dans des cellules mammifères intégrée dans AD2P: Antiviral Drug Development Platform Aix-Marseille Université