Plan du cours 05/03/15. UE09s Méthodes d étude et analyse du génome

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1 UE09s Méthodes d étude et analyse du génome Applica:ons des techniques du génie géné:que au diagnos:c moléculaire et à la thérapie des maladies acquises Exemples en cancérologie Thérapie ciblée Théranos:que PACES Pr Nicolas SEVENET Plan du cours Introduc:on Cancérogenèse moléculaire No:on de thérapie ciblée Exemples de techniques en vue de détecter une anomalie moléculaire FISH à amplifica:on d un gène, surexpression du récepteur membranaire HER2 (cancer du sein) PCR et séquençage Sanger ou détec:on par extension d amorcesà muta:on ponctuelle ac:vatrice du gène KRAS, ac:va:on d une voie de transduc:on du signal de division mito:que (cancer colorectal) 1

2 Schéma général transduc:on signal Tratstuzumab Cancer du sein Y Y Cetuximab Cancer colorectal R M = Messager R = récepteur C = cytoplasme N = noyau h4p:// Rubriques/Output/ CommunicaCons_intercellulaires 3.php# Introduc:on Le cancer est une pathologie cellulaire Caractéris:ques générales de la cellule cancéreuse Proliféra:on cellulaire non contrôlée Indépendance vis- à- vis des signaux de contrôle du cycle cellulaire Perte de l inhibi:on de contact Suppression de l exigence d un support solide Expansion clonale Hypothèse de Peter Nowell (1976) : toutes les cellules tumorales cons:tuant la tumeur dérivent d une cellule unique dotée d une altéra:on géné:que favorisant la proliféra:on MAIS la cellule normale ne devient tumorale (= transforma:on cellulaire) qu après accumula:on d anomalies géné:ques Colonisa:on de :ssus étrangers (métastases) Capacité d envahissement et de croissance au sein de :ssus étrangers = le :ssu stromal adjacent se modifie 2

3 Introduc:on le cancer est une pathologie géné:que Au niveau géné:que L accumula:on d anomalies géné:ques est favorisée par une instabilité chromosomique globale (ß altéra:on de la ségréga:on des chromosomes) à instabilité géné:que, complexité génomique : Augmenta:on du taux de muta:on Muta:ons des gènes de contrôle du cycle cellulaire ou de la croissance cellulaire Balance entre proliféra:on et différencia:on Modifica:ons morphologiques Perte de l adhérence et morphologie arrondie Perte des câbles d ac:ne Réorganisa:on du cytosqueleee Diapo 6 cours JB Corcuff différencia:on cellulaire UE2 S1 Introduc:on - thérapie ciblée Biomarqueur L altéra:on géné:que entraîne la synthèse d une protéine Qui cons:tue un avantage sélec:f pour la cellule tumorale! avantage sélec,f Qui peut être «u:lisée» afin de suivre l évolu:on de la maladie! marqueur d évolu,on, marqueur pronos,c Qui peut être ciblée par un médicament des:né à ralen:r ou supprimer le développement de la tumeur! cible thérapeu,que, marqueur prédic,f 3

4 Introduc:on - thérapie ciblée Exemples de thérapies ciblées Amplifica:on du récepteur membranaire Her2 an:corps monoclonal an:- Her2 = Trastuzumab, Hercep:n Ac:va:on de la voie EGFR/Ras an:corps monoclonal an:- EGFR inhibant ceee voie si protéine Ras n est pas mutée = Cetuximab, Erbitux CANCER DU SEIN THÉRAPIE CIBLÉE ANTI- HER2 HERCEPTIN 4

5 Voie de transduc:on du signal débutant par le récepteur membranaire Her2 Baselga J, Swain SM (2009) Novel anccancer targets: revisicng ERBB2 and discovering ERBB3. Nature Rev Cancer 9, Ac:va:on d une voie de signalisa:on cellulaire Dimérisa:on du récepteur HER2 phosphoryla:on des tyrosine situées sur la par:e intracytoplasmique du récepteur Interac:on avec la PI3kinase et ac:va:on de la voie PTEN 5

6 Détermina:on de la surexpression tumorale de HER2 La surexpression tumorale de Her2 est observée dans Les cancers du sein En phase précoce (observée au diagnos:c) Métasta:ques (observée lors de l évolu:on tumorale) Certains cancers de l estomac Elle est associée à une proliféra:on cellulaire augmentée, une agressivité tumorale (accroissement de la masse tumorale) Détermina:on de la surexpression tumorale de HER2 On parle de surexpression tumorale lorsqu en immuno- histochimie an:- Her2, on observe un marquage des cellules tumorales Modéré et homogène : IHC 2+ homogène Fort : IHC 3+ Principe Immuno- HistoChimie (IHC) ü Colora:on HES des :ssus ü IHC ü Diapos 75 à 85 du cours de P Dubus en histologie 6

7 Surexpression tumorale de Her2 Elle est un facteur pronos:que et prédic:f de thérapie ciblée FISH Iconographies et schémas disponibles sur le site laboratoire Roche Immuno- histochimie an:- HER2 sur tumeur du sein IHC 0 Absence de marquage an:- Her2 (Her2 néga:f) à le récepteur membranaire Her2 n est pas exprimé à la surface des cellules tumorales IHC 1+ Faible marquage an:- Her2 Différence de marquage entre cellules normales et cellules tumorales à le récepteur membranaire Her2 est peu exprimé à la surface des cellules tumorales Iconographies et schémas disponibles sur le site laboratoire Roche 7

8 Immuno- histochimie an:- HER2 sur tumeur du sein IHC 2+ Marquage an:- Her2 circonféren:el de la cellule tumorale modéré à le récepteur membranaire Her2 est exprimé à la surface des cellules tumorales IHC 3+ Marquage membranaire an:- Her2 intense et complet sur plus de 10% des cellules tumorales (Her2 posi:f) à le récepteur membranaire Her2 est fortement exprimé à la surface des cellules tumorales Iconographies et schémas disponibles sur le site laboratoire Roche Carcinomes canalaires infiltrants FISH HER2 PRÉDICTIF Indica:on thérapeu:que de trastuzumab (Hercep:n ) Recherche d amplifica:on du locus HER2 par FISH POUR TOUT cancer du sein (CARCINOME MAMMAIRE INFILTRANT ) 2+ EN IHC an,- HER2 Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon 8

9 FISH Principe Décrit dans le cours d Edith Chevret (UE1, diapos 39 à 45) Hybrida:on moléculaire Dépistage de la trisomie 21 (à 3 chromosomes 21) Détec:on d une transloca:on réciproque entre deux chromosomes (t(9;22), chromosome Philadelphie) Détec:on d une amplifica:on Un gène est dupliqué de très nombreuses fois les unes à la suite des autres sur le même chromosome à amplifié HSR, homogenous Staining Region = région colorée de façon homogène Fluorescent In Situ HybridizaCon Principe Fragments d ADN locus spécifiques HYBRIDATION Prélèvement étudié: Etalement chromosomique Noyaux interphasiques Coupes... DiaposiCves réalisées avec l aide de Frédéric Chibon 9

10 Comment analyser une amplifica:on du gène HER2 en FISH interphasique? Chr 17 Cen17 Her2 Cen17 Her2 h4p://www.google.fr/url?sa=t&rct=j&q=her2%20calcul%20nombre%20de %20copies%20par%20noyau %20fish&source=web&cd=5&ved=0CEsQFjAE&url=h4p%3A%2F%2Fwww.e- cancer.fr%2fcomponent%2fdocman%2fdoc_download%2f4298- caracterisacons- des- tumeurs- de- la- vessie&ei=a9t0t8mne4nf0qwrmjwudq&usg=afqjcneoaqdiy- XK045MW1ucGzlYircwHQ Ra:o = Her2/Cen17 = 1 Comment analyser une amplifica:on du gène HER2 en FISH interphasique? Chr 17 Cen17 Her2 Cen17 Her2 Her2 Ra:o = Her2/Cen17 = 1,5 Pas d amplifica:on 10

11 Comment analyser une amplifica:on du gène HER2 en FISH interphasique? DiaposiCves et schémas des Dr Beuzeboc, Dr Couturier, InsCtut Curie, Paris Comment analyser une amplifica:on du gène HER2 en FISH interphasique? DiaposiCves et schémas des Dr Beuzeboc, Dr Couturier, InsCtut Curie, Paris 11

12 Carcinomes canalaires infiltrants FISH HER2 Carcinome Canalaire Infiltrant- Grade III - Her2 IHC 20% 2+ Nombre moyen de copies par noyau : HER2 = 2.65 CEN- 17 = 1.82 HER2/CEN- 17 ra:o : 1.45 NON AMPLIFIE Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon Carcinomes canalaires infiltrants FISH HER2 Carcinome Canalaire Infiltrant - Grade III - Her2 IHC 60% 2+ Nombre moyen de copies par noyau : HER2! 10 CEN- 17 à 2 HER2/CEN- 17 ra:o : > 5 AMPLIFIE Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon 12

13 CANCER COLORECTAL THÉRAPIE CIBLÉE ANTI- EGFR ERBITUX Un marqueur fron:ère dans le cancer colorectal : le gène KRAS Siena, S et al (2009) Biomarkers prediccng clinical outcome of epidermal growth factor receptor- targeted therapy in metastacc colorectal cancer. JNCI 101,

14 Immunohistochimie an:- EGFR Algars et al (2011) EGFR gene copy number assessment from areas with highest EGFR expression predicts response to anc- EGFR therapy in colorectal cancer BJC 105, Marquage an:- EGFR intense avec deux clones différents Cetuximab Erbitux An:corps monoclonal humanisé an:- EGFR (Her1) Inhibe la proliféra:on des cellules tumorales Surexprimant le récepteur EGFR Avec une voie de signalisa:on fonc:onnelle (gène KRAS non muté, «wild- type») ATTENTION : Si la voie est ac:vée (muta:on ac:vatrice oncogène KRAS), il n y a plus d indica,on à inhiber EGFR Indica:ons Cancer colorectal métasta:que en associa:on avec les chimiothérapies classiques Cancer des voies aéro- diges:ves supérieures en associa:on avec des chimiothérapies classiques (à base de sels de pla:ne) 14

15 Mécanisme d ac:on du cetuximab Ligand Ac:va:on de EGFR Blocage de EGFR Cascade de transduc:on du signal Gènes ac:vés Cascade de transduc:on du signal Gènes non ac:vés Apoptose Angiogenèse Métastase Proliféra:on dédifférencia:on Cetuximab - Erbitux - An:- EGFR KRAS cancer colorectal métasta:que Normanno N et al (2009) ImplicaCons for KRAS status and EgFR- targeted therapies in metastacc crc Nat. Rev. Clin. Oncol. 6, Pa:ents avec muta:on KRAS Pa:ents avec KRAS NORMAL Le cetuximab n inhibe la proliféra:on cellulaire (et donc entraîne une survie prolongée chez les pa:ents) uniquement lorsque la voie EGFR- KRAS est intègre (à KRAS non muté, normal) 15

16 Muta:ons KRAS les plus fréquentes Chr 12; exon 2; Codons 12 et 13 GGT GGC Les muta:ons KRAS les plus fréquentes Détermina:on du statut KRAS à recherche des muta:ons ponctuelles ac:vatrices de l oncogène KRAS 2 méthodes principalement PCR- séquençage direct PCR en temps réel : méthode par extension de primer 16

17 Délimiter la zone tumorale à explorer La détermina:on du statut KRAS par séquençage direct 140 pb Exon 2 KRAS Primer forward (sens) Primer reverse (an:sens) 17

18 KRAS; Exon 2; p.gly12val, GGT>GTT 18

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