EXPECTORATIONS I. PROBLEMES POSES PAR L ETUDE CYTOBACTERIOLOGIQUE DES EXPECTORATIONS

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1 Micro CSB System EXPECTORATIONS I. PROBLEMES POSES PAR L ETUDE CYTOBACTERIOLOGIQUE DES EXPECTORATIONS A. QUELQUES GENERALITES SUR LES INFECTIONS RESPIRATOIRES Elles sont très diverses par leur localisation, leur manifestation et leur étiologie. On distingue les infections tuberculeuses des infections à «germes banaux». Les premières feront l objet d une étude particulière dans une autre fascicule. Seules sont étudiées dans ce chapitre les infections non tuberculeuses 1.Les infections pulmonaires (pneumopathies) aiguës Elles siègent au niveau du tissus alvéolaire. Elles s accompagnent localement d un afflux de polynucléaires et de sécrétion de quantité importante de fibrine. On retrouvera donc dans l expectoration le ou les germes responsables de l infections, du pus, de la fibrine, l ensemble emmenant souvent en remontant les voies respiratoires du mucus bronchique, des sécrétions rhino-pharyngées et de la salive. La pneumonie lombaire aiguë à pneumocoque en est l exemple le plus 1 typique, mais il existe bien d autres pneumopathies aiguës soit primitives soit secondaires à une infection virale. 2.Les infections des voies respiratoires Les pharyngites et les laryngites sont souvent des infections bénignes qui ne justifie pas la mise en route d un examen de laboratoire. Leur étiologie est, d ailleurs, fréquemment virale. Le laboratoire interviendra, par contre, pour chercher l agent infectieux au cours des bronchites aiguës ou à l occasion des poussées infectieuses de bronchites chroniques. Dans ce cas, l infection bactérienne n est souvent que la conséquence et non la cause de la maladie. Les causes les plus fréquentes en sont l exposition prolongée et répétée à des substances irritantes pour l épithélium bronchique : tabac, substances chimiques, brouillard (dans les agglomérations industrielles) et les infections virales (Rhinovirus, Myxuvirus). Tous ces agents ont pour effet de nécroser la couche superficielle de l épithélium respiratoire et d inhiber l action phagocytaire des macrophages. C est sur ce terrain affaibli que se développe alors le processus infectieux.

2 B.PROBLEMES POSES PAR L IDENTIFICATION DE L AGENT CAUSAL 1. Les difficultés à surmonter a. L existence d une flore commensale abondante dans les voies respiratoires hautes Chez un individu sain, les bronches et le poumon sont stériles. Les germes retrouvés dans une expectoration devraient donc représenter les agents causaux de l infection en culture pure. Ce n est pourtant pas le cas le plus fréquent. En effet, la bouche et le rhinopharynx sont le siège d une flore très abondante au sein de laquelle on peut distinguer : (1) Des hôtes constants, en particulier Des Streptocoques (c est le genre quantitativement prédominant) les espèces non groupables sont les plus nombreuses (Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius). Des Neisseria commensales : Neisseria sicca, Neisseria perflava. Des Corynebactéries : Corynebacterium pseudodiphteriticum. Staphylococcus epidermidis, chez les porteurs sains : Staphylococcus coagulase + Hæmophilus parainfluenzæ, hæmophilus parahemolyticus. (2) Des hôtes transitoires, en particulier Ils séjournent dans le pharynx plusieurs heures après les repas ; ce sont essentiellement des Entérobactéries. Le crachat spontané est donc souvent souillé par des bactéries provenant des voies respiratoires hautes. Différentes sortes de germes seront isolés et identifiés et il sera parfois bien difficile de distinguer les agents infectieux des germes commensaux, d autant que certaines espèces peuvent, selon les cas, appartenir aux deux catégories. b. La fragilité de certains agents infectieux Certaines bactéries, fréquemment mises en cause à l occasion d infections respiratoires, sont fragiles et relativement exigeantes (Hæmophilus, Pneumocoque). La culture aura tendance à les sous-estimer par rapport à des germes comme les Entérobactéries, plus robustes, à croissance plus rapide et pouvant aussi être impliqués dans des infections respiratoires. 2

3 c. Les infections respiratoires sont souvent pluribactériennes Ces quelques renseignements montrent les difficultés et les limites de l analyse. En pratique, si on veut qu elle est un sens, on devra mettre en œuvre les techniques les plus adéquates et veiller à une interprétation très critique des résultats. 2.Les solutions a. Importance du choix de la technique de prélèvement L expectoration spontanée, recueillie dans un récipient stérile, reste la méthode la plus utilisée. La bouche et le pharynx sont préalablement désinfectés par gargarisme avec un antiseptique dilué - Avantage de ce type de prélèvement : il n est pas traumatisant - Inconvénient : la flore commensale contamine assez sensiblement l expectoration, malgré la désinfection. Le prélèvement in situ par bronchoscopie Les sécrétions sont recueillies par un tube aspirateur souple et stérile, introduit dans le bronchoscope. Avant de parvenir aux bronches, le tube doit cependant passer par le bucco pharynx. Le prélèvement est donc 3 contaminé mais de façon très limitée. C est une amélioration. La ponction transtrachéale Elle est réalisée à l aide d une grosse aiguille que l on fait pénétrer entre deux anneaux. L aiguille est muni d un cathéter qui permet d atteindre les bronches. Les sécrétions sont aspirées par une seringue. Cette technique de prélèvement limite au maximum les sources de contaminations mais n élimine pas pour autant toute possibilité de souillure (souvent par des Pseudomonas). Elle a pour inconvénient (grave) d être traumatisante. Des études comparatives ont été faites. Les conclusions les plus importantes sont (pour rester dans l essentiel) les suivantes : 1- chez le sujet normal, les germes considérés comme pathogènes : Streptococcus pneumoniæ, Hæmophilus, sont trouvés dans l expectoration, mais sont absents de la ponction transtrachéale, 2- en cas de bronchite chronique, la répartition des résultats varie assez sensiblement selon la technique prélèvement comme le montre le tableau ci-dessous, établi d après les travaux de Koster (232 malades) :

4 Streptocoques Pneumocoques H. influenzæ Pseudomonas æruginosa Entérobactéries Ponction transtrachéale 10,9% 12,8% 15% 9,4% 19,9% Crachats 15,8% 10% 8% 11,5% 49% Il est clair que l analyse de l expectoration spontanée surestime l impact de Entérobactéries et des Pseudomonas et sous-estime celle des Hæmophilus et des Pneumocoques. Nous voyons, en conclusion, que chaque technique de prélèvement présente des inconvénients. L aspiration bronchique apparaît, cependant, si on tient compte du nécessaire confort du malade, comme une technique particulièrement intéressante. b. Nécessité de ne pas différer l analyse On évitera ainsi la prolifération des contaminants, et la lyse des germes, fragiles. Dans le cas où la mise en route de l analyse ne peut être faite, le crachat sera conservé au réfrigérateur à + 4 C. c. Traitement des expectorations Le lavage des crachats à l eau physiologique stérile permet l élimination des parties salivaires et la solubilisation du mucus rhino-pharyngé. Ce traitement élimine partiellement les contaminations par le flore commensale. L homogénéisation. Les crachats sont fluidifiés par l action de la N acétylcystéine (Mucostyl). On provoque, par un tel traitement, la libération des germes emprisonnés dans la masse du mucus. L opération est intéressante car ces bactéries ont de grandes chances de provenir du foyer infectieux (les contaminants commensaux se surajoutent en effet dans la partie 4

5 la plus superficielle du contradictoires produit, au avec ceux des cultures, ces enseignements cour de sa remontée doivent dans prévaloir. les voies respiratoires hautes). En réunissant les opérations ci-dessus, Prenons pour exemple les observations suivantes : on diminue l incidence de la flore - Examen microscopique : commensale et on accroît celle des germes nombreux diplocoques Gram+ pathogènes. Ces deux manipulations sont complémentaires. Un autre intérêt de Quelques bacilles Gram (-) l homogénéisation est d obtenir un produit fluide sur lequel il est possible de faire - Culture sur milieu non sélectif (gélose au sang) : - des dilutions (donc une évaluation o Nombreuses colonies de quantitative des microorganismes). bacilles Gram (-) d. L intérêt d une évaluation o Quelques petites colonies en quantitative et de l utilisation de milieux sélectifs Une infection respiratoire se manifeste par une véritable culture in goutte de rosée de diplocoques Gram+ : On devra penser à la possibilité, à la probabilité même, d une infection à vivo des germes infectants de Pneumocoques. l épithélium bronchique ou alvéolaire. On pourrait raisonner de la même façon à Dans une expectoration, ces partir d autres exemples (Hæmophilus, microorganismes seront retrouvés en grand nombre s ils ont une signification pathologique alors que les contaminants de la flore commensale apparaîtront en quantité nettement plus faible dans la mesure où le crachat aura subit le lavage et l homogénéisation. Streptocoques β hémolytiques). L explication de telles conclusions a été donné précédemment. Elle tient aux différences concernant les capacités de multiplication, les exigences nutritives et la vitalité des germes présents dans le crachat. ation semi-quatitative : de nombreux laboratoires se Quel que soit l intérêt de l examen tent d une évaluation semi-quantitative à l examen microscopique, il n en demeure pas moins copique d un frottis coloré. Cet examen prend alors une nécessaire d obtenir une culture abondante importance, d autant que, dans l hypothèse de résultats de l agent pathogène afin de l identifier et de pratiquer son antibiogramme. La 5

6 difficulté peut être résolue par l emploi de milieux sélectifs : o Gélose au sang + acide nalidixique pour isoler les Streptocoques (y compris Streptococcus pneumoniæ) l acide nalidixique inhibera la plupart des bacilles Gram (-). o Gélose au sang + bacitracine pour Hæmophilus. Evaluation quantitative : pour certains, c est la seule pratique permettant d éviter les résultats erronés ; Des études récentes ont montré que les germes isolés dans une expectoration avait une signification de virulence lorsque leur nombre dépassait 10 7 dans un millilitre. En pratique, on dilue le crachat de manière à ce que le nombre de colonies du germes impliqué dans l infection se situe au alentour de la centaine par boîte. On y parvient en ensemençant sur les milieux adéquats et à l aide d une anse calibrée 0,01mld une dilution au 1/1 000 e (dans l eau physiologique stérile) du crachat homogénéisé et fluidifié par la N acétylcystéine (ou d autres procédés). Les contaminants, dans ces conditions seront peu représentés ou même éliminés par la dilution. e. Autres critères Présence de pus : si l examen microscopique révèle la présence d un germe dominant, l observation concomitante de nombreux leucocytes sera en faveur de la virulence. Résultats d analyses répétées : la comparaison des résultats d analyses répétées permet de confirmer l étiologie proposée à la fin du premier examen. Les traitements antibactériens sont cependant la cause fréquentes de variations dont il faut tenir compte (les Pneumocoques, par exemple, sont très sensibles aux traitements aux antibiotiques et disparaissent souvent du foyer infectieux dès l instauration du traitement pour y être remplacés par des Entérobactéries ou par Pseudomonas æruginosa, beaucoup plus résistants). B.NATURE DES GERMES EN CAUSE 1.Dans les infections pulmonaires Hæmophilus influenzæ et Streptococcus pneumoniæ sont les plus fréquents dans les pneumopathies aiguës. Les Staphylocoques coagulase + domine 6

7 l étiologie des abcès du poumon avec les anérobies de la flore de veillon. 2.Dans les broncho-pneumonies On isole : Staphylococcus aureus, Les Entérobactéries (surtout Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus, Providencia), Pseudomonas æruginosa. b. LES DIFFERENTS ETAPES DE L ANALYSE A.EXAMEN MACROSCOPIQUE L expectoration doit être décrite avec précision. Certains aspects sont en effet caractéristiques. Exemple : le crachat de la pneumonie lobaire aiguë est transparent, peu aéré, visqueux, très adhérent au récipient, de couleur rouille ou gelée de coing. Afin de décrire l aspect de l expectoration, on choisira généralement entre : Muqueux : donnant un aspect en gelée avec de rares parcelles purulentes, Mucopurulent : muqueux avec des parcelles de pus plus nombreuses, 7 Salivaire Fluide et purulent, Visqueux, adhérent, Préciser aussi la couleur éventuellement : Rouille, Verdâtre, Hémoptoïque (sang). La présence de grains jaune est caractéristique d une acinomycose. Noter, s il y a lieu, l odeur fétide, témoin deb la présence d anaérobies. B.EXAMEN MICROSCOPIQUE 1.But de l examen Nous avons vu précédemment que l expectoration est constituée d une sécrétion muqueuse, d origine pulmonaire ou bronchique. Selon la localisation de l infection, des cellules pulmonaires ou bronchiques sont aussi rejetées avec la sécrétion, ainsi que le pus formé au niveau du foyer infectieux. Le but de l examen cytologique sera donc double : Déterminer la présence et, éventuellement, la nature des cellules présentes dans le crachat. Cette étude sera conduite sur un frottis fixé, coloré au bleu de méthylène. Si, à l examen de ces

8 préparations, la présence de polynucléaires éosinophiles est suspectée, on la confirmera en effectuant une coloration de May Grunwald-Giemsa. Observer la flore bactérienne de l expectoration afin d orienter les recherches en vue de l isolement de l agent pathogène. Cependant, le problème est rendu ici délicat du fait 1) que le crachat est très souvent souillé par la salive et des sécrétions d origine rhinopharyngée, 2) que de nombreuses infections respiratoires sont pluribactériennes. Une opération essentielle sera donc de laver le crachat à l eau physiologique stérile afin d éliminer la plus grande partie de la salive. D autre part, on travaillera de préférence sur les parcelles purulentes car c est là que l on aura le plus de chance de trouver l agent infectieux. Lors de l orientation microscopique du diagnostic on choisira, enfin un champ dépourvu de cellules bucco-pharyngées (leur présence serait le témoin d une contamination salivaire) 2.Techniques a. Lavage Le crachat est placé dans une boîte de pétri. Ajouter environ 5 ml d eau physiologique stérile (ce volume est variable selon l abondance du crachat). Bien mettre en contact. Aspirer le liquide avec une pipette (cotonnée!) en penchant légèrement la boîte pour favoriser l écoulement du liquide de lavage. Rejeter dans un récipient contenant un antiseptique. Le lavage est, bien sur, à éviter dans le cas d un crachat fluide. b. Repérer et prélever une parcelle purulente L écraser, si nécessaire, entre 2 lames. Etaler la parcelle sur 3 lames. Fixer à la chaleur. c. Colorer Une lame au bleu de méthylène, Une lame au Gram, Une lame selon la méthode de Ziehl. (coloration au bleu de méthylène : sur la préparation fixée, répartir le colorant, laisser 1 minute. Rincer à l eau. 3.Résultats de l examen microscopique : cytologie des expectorations a. Le fond de la préparation Dans la plupart des cas, il est constitué par du mucus hyalin, bleu (au bleu de méthylène), répartir assez uniformément 8

9 bien que formant des zones plus épaisses par endroits. Quelquefois (cas de la pneumonie), on pourra observer des formations d un bleu plus foncé en forme de goutte. Il s agit d un exsudat séroalbumineux. Un réseau de fibrine plus ou moins dense, plus ou moins bien limité, parfois filamenteux, peut englober les polynucléaires (pneumonie). Notons enfin que le mucus hyalin prédomine dans les crachats adhérents (pneumonie, bronchite aiguë au début), (congestion pulmonaire). b. Cellules d origine pulmonaire On en retrouve 2 types dans le crachat : les cellules alvéolaires et les macrophages. Cellules alvéolaires Une représentation très schématique de l épithélium pulmonaire permettra de les situer (fig. I). Cet épithélium comprend deux sortes de cellules : - De petites cellules rondes ou ovalaires, nucléées, - De larges plaques au contours irréguliers sans, noyaux. Ce sont les petites cellules que l on retrouve dans les expectorations : les cellules alvéolaires. Leur aspect est variable selon leur degré de maturité. (fig. II) Macrophages Grosse cellule à noyau excentrique et cytoplasme clair. Certaines sont chargées de grains d homosidérine et sont appelées «cellules poussière». (fig. III) c. Cellules de l épithélium bronchique Schéma d une coupe transversale de bronche permet de localiser les cellules de l épithélium bronchique (ce sont elles qui tapissent l intérieur des bronches et sont donc concernées par l inflammation.(fig. I) On les retrouve, en fait, plus ou moins tuméfiées dans les crachats. En voici quelques aspects assez classiques.(fig. IV). Principales cellules rencontrées dans l étude cytobactériologique d une expectoration N 1- Cellule bronchique peu déformée. Le noyau commence cependant à ce tuméfier N 2- Cellule bronchique dont le noyau, en dégénérescence réticulée plus avancée, s est étiré sous l influence de l étalement. N 3- Aspect réticulé isolé : trace d un noyau d une cellule bronchique dont le cytoplasme a disparu. 9

10 N 4- Cellule bronchique presque intacte en volume, mais dont le cytoplasme commence à s altérer et le noyau à se tuméfier. d. Cellules de l épithélium bucco pharyngé Grandes cellules pavimenteuses, à petit noyau central, cytoplasme très abondant. Témoin de contamination salivaire. (fig.v). e. Autres cellules - Polynucléaires neutrophiles : plus ou moins dégradés, l ensemble constitue le pus. On doit en apprécier l abondance (rares, assez nombreux, nombreux, très nombreux). - Polynucléaires acidophiles : on les retrouvent dans les expectorations dans le cas de l asthme. - Hématies. - Levures (Candida albicans) ou un autres champignons (Aspergillus). C.CULTURES ET IDENTIFICATIONS 1.Homogénéisation Ajouter au crachat lavé une solution à 5% de N acétylcystéine de façon à le diluer au 1/10 e. lorsque la fluidification sera achevée, on pourra ensemencer. 2.Choix des milieux d isolement Isolement Le choix des milieux est, bien sur, fonction de l examen microscopique. Les milieux suivants sont cependant d un grand intérêt Gélose au sang : elle permet la culture de la plupart des bactéries aérobies rencontrées dans les crachats. La grande variété de germes à isoler, la fréquence élevée des cocci Gram+ dans les infections respiratoires imposent son usage. Gélose au sang à l acide nalidixique (40 mg/ml) : l acide nalidixique inhibe les bacilles Gramet facilite l isolement des Streptocoques. Gélose au sang cuit + isovitalex (ou supplément G) + bacitracine (50UI/ ml) : Ce milieu est ensemencé par la méthode des cadrans avec une anse d une dilution au 1/1000 e du crachat fluidifié dans l eau physiologique stérile. Dans ces conditions, seul Hæmophilus se développera si son importance numérique dans le crachat est suffisante pour lui attribuer un rôle pathogène (c est à dire, en fait, s il se trouve en concentration supérieure à /ml). La dilution élimine en effet les germes résistants à la bacitracine qui pourraient accompagner Hæmophilus dans le crachat mais qui n auraient du fait de 10

11 leur faible représentativité qu une signification de contaminant. Cette méthode appliquée aux autres milieux d isolement permet la numérotation des autres germes dans le crachat : le nombre de colonies comptées représente le nombre de bactéries dans 1ml de crachat dilué à 10-5 (0,01 ml, volume d une anse de produit dilué à 10-3 ), 1 colonie équivaut donc à germes. Gélose BCP : elle permet une meilleure orientation des bacilles Gram- que la gélose au sang. Gélose Sabouraud + actidione + chloramphénicol lorsqu on aura observé d autres formes mycéliennes). 3.Identification Se reporter à un cours de Bactériologie systématique. Sont identifiés : - Les germes anormalement présents dans le crachat, quelle que soit leur abondance (exemple Streptocoques hémolytiques) - Les germes considérés comme pathogènes lorsqu ils sont abondants en culture : Hæmophilus : lorsqu on observe des colonies suspectes à la dilution 105, Pneumocoque ; Entérobactéries, Pseudomonas lorsque les conditions suivantes sont réunies : o Abondance à l examen direct, o La culture couvre au moins le premier cadran. 11

12 SCHEMA RECAPITULATIF Les étapes de l examen cytobactériologique d un crachat : Exemple d une (1) organisation du travail CRACHAT Noter l aspect Examens Lavage [+ N Acétylcytéine Fluidification Microscopiques à 5% (dilution de = HOMOGENEISATION crachat au 1/10 e ] Repérer et prélever une parcelle purulente. Etaler 3 frottis et colorer Gram Bleu ziehl Dilution au 1/100 e (1 anse dans 1 ml) ISOLEMENT ISOLEMENT (1effilure de Pipette Pasteur) Gélose au sang cuit gélose au sang à gélose gélose au sang 12

13 + Facteurs de croissance l acide nalidixique BCP frais + Bacitracine (50 UI/ml) (Recherche des (Recherche des (Recherche d H. influenzæ) Streptocoques dont autres germes) les Pneumocoques) (1) parmi bien d autres possibles Identification biochimique Antibiogramme 13