A) Domaines et prényls de protéines RAS (super-famille)

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1 CHAPITRE 2 : PROTÉINES G MONOMÉRIQUES Ce sont des intégrateurs moléculaires des voies de signalisation, des «commutateurs multipositions». Elles sont constituées d une sous-unité α, existent chez les eucaryotes depuis la levure jusqu à l humain. I) Super famille Ras La super famille RAS compte plus de 100 membres, on distingue 5 sous-familles. Dans chaque sous-famille, les protéines G possèdent des séquences géniques communes et vont assurer la même fonction avec des domaines protéiques homologues visant à fixer les dérivés guanyliques : A) Domaines et prényls de protéines RAS (super-famille) Elles ont quatre domaines de liaisons : Les domaines Switch assurent la flexibilité de la protéine et permettent le changement de conformation Le domaine E correspond à un domaine homologue pour la liaison avec l effecteur qui est en aval de la voie de signalisation, actif quand il lie le GTP.

2 - Rho, Rab et Ras ont des séquences de prényls s accrochant à la partie C-terminale de la protéine et s ancrant dans la membrane - Arf ont un prényl qui s accroche à N-terminale - Sa 1 et Ran n ont pas d ancrage Les protéines RAS sont ubiquitaires sauf : - Rab 3a dans les neurones, sur des cellules endocrines ou exocrines - Rab 17 dans les cellules épithéliales Les protéines G ont une localisation d expression particulière dans des compartiments particuliers de la cellule. La plupart sont dans le cytosol, dans la membrane ou dans les deux, sauf : - les Ran qui oscillent entre le cytosol et le noyau Il peut exister différents types de prényls (composés lipidiques) - Ras : farnésyl C 15 qui s accroche en C-terminale - Rho : geranyl/farnesyl C 20 - Arf : myristiles C 14 GAP stimule la protéine G qui hydrolyse le GTP en GDP et revient dans un état inactif. B) Fonctions des protéines G - Ras : différenciation et prolifération cellulaire (eucogène), principalement au cours du stade embryonnaire mais peut réapparaître en cas de maladie - Rab : régulation du transport vésiculaire (endo/exocytose) - Ran : transport nucléo-cytoplasmique - Arf : formation de vésicules membranaire

3 II) Les protéines Rho Il existe 17 types de protéines Rho, elles sont régulatrices de l assemblage du cytosquelette d actine et responsable de la poly/dépolymérisation de l actine. L expression de différentes séquences codantes pour les membranes des protéines Rho définit un phénotype cytosquelettique particulier. - Rho a, b, t : rôle dans l adhérence et la contraction des muscles - Cdc 42 : filopodes d actines à un pôle de la cellule, senseurs d orientation (polarité) et fibres de stress - Rac 1, 2, 3 : lamellipodes (ruffle) d actine polymérisée à front de progression/protusion L association de l activité de ces 3 groupes de protéines est nécessaire à la migration, elles sont impliquées dans la métastase cancéreuse. - Rnd inhibent Rho a, b, c, elles n ont pas d activité GTPasique intrinsèque, elles ne sont jamais inactives, leur action ne dépend que de leur expression Structure : - hélice α particulière : Rho insert - cystéine en C 190 sur laquelle s accroche un lipide en C 20 (pour Rho A) Site de prénylation

4 A) Le cycle des protéines Rho La protéine Rho A inactive est logée dans le cytosol, le GDi vient masquer le prényl, ce qui va solubiliser la protéine. Les Rho ne sont actives qu à la membrane (membrane plasmique pour Rho A). Le GDi se sépare de Rho A par d autres voies de signalisation impliquant la phosphorylation du GDi et de Rho, ce qui permet le relargage de GDi et l ancrage de Rho à la membrane. Il y a ensuite une réaction d échange GDP/GTP sous l influence de GEF. Activation de la protéine G effecteur GAP remet le GDP et Rho se resolubilise, ce qui induit un couplage avec le GDi Protéines GEFs : 70 membres

5 1) Les protéines GEFs L activation des protéines Rho par les GEFs se fait en 3 temps : - reconnaissance de faible affinité entre GEF et G - relation GEF-G qui permet le relargage du GDP : complexe libre de nucléotides de très haute affinité - GTP en excès va rentrer dans les protéines G et les rendre actives, faible affinité

6 2) Les effecteurs intracellulaires de Rho Les protéines Rho ont de multiples effecteurs dans les cellules : kinases, phosphatases, protéines de structure, facteurs de transcription. Pour Rho A : Rho kinase est l effecteur majeur Pour Rac 1 : PAK 1, 2, 3 kinase Pour Cdc 12 : PAK 1, 2, 3, 4 a) Effecteur de Rho A : ROCK Les effecteurs majeurs des Rho A, les Rho kinases Rock 1 et 2, ont trois domaines fonctionnels : - N-terminale : 90% d identités des acides aminés avec le domaine kinase (activité catalytique) - Partie médiane : 54% d identité, Rho Binding Domain - C-terminale : 65% d identité, PH domain, domaine riche en cystéine CRD

7 La protéine Rock est repliée au repos, elle masque l activité catalytique, Rho se lie à RBD, la protéine Rock s ouvre et le site kinase devient accessible. RND-3 se lie sur le domaine kinase et inhibe donc l ouverture de la protéine Rock. La Rho kinase peut être activée par d autres voies : - acide arachinodique (lipide) se lie au CRD et active la Rho kinase - acide sphingosyl phosphoryl choline se lie de la même manière - kaspase 3 suractive la Rho kinase après avoir clivé la protéine, provoquant l apoptose Lorsque Rho est sous forme GTP, il peut activer mdia qui est une protéine recrutée au site de polymérisation de l'actine. ROCK peut phosphoryler la myosine phosphatase et inhibe l'activité de cette myosine phosphatase (myosine phosphatase est impliquée dans la phosphorylation de la myosine). ROCK active aussi la LIM kinase qui agit sur la Cofilin (protéine de coiffe des actine en formation, s il y a coiffe, la polymérisation est finie) ce qui permet de stimuler la polymérisation en inhibant la dépolymérisation. Formation des fibres de stress Les protéines Rho répondent ou génèrent des forces, elles ont un rôle majeur dans les tensions et les forces, la perte ou le réarrangement de ces forces vont modifier l adhérence des cellules

8 b) Effecteurs de Rac PAK, POR et Arf 6 sont peu connus et mènent à la formation de lamellipodes (ruffles) c) Effecteurs de Cdc 42 Les Cdc 42 activent les WASP, produits du gène du syndrome de Wiskott Aldwich (déficience de l immunité caractérisée par un défaut de signalisation des lymphocytes B et T) qui vont interagir avec le complexe protéique nucléateur Arp 2/3. B) Rôle des protéines Rho, Rac et Cdc 42 Grâce au fonctionnement de ces protéines, les voies de signalisation contrôlent la polarité cellulaire. Toutes les cellules eucaryotes sont capables de polariser, en particulier Cdc 42 qui est nécessaire à former les bourgeonnements impliqués dans la fabrication des levures et qui joue également un rôle dans la polarisation des nématodes ou des neuroblastes des drosophiles. La polarisation est indispensable à la mise en place de la division asymétrique, ce qui induit la différenciation des cellules (protéines Par 1-2 au pôle postérieur, Pac 3-6 et PKC au pôle antérieur) Cette polarité est impliquée dans la morphologie.

9 Cdc42, par la polymérisation de l'actine, permet de mettre en place le cytosquelette nécessaire aux structures d'ancrages des cellules épithéliales. Cdc 42, PAR 6,3 et PKC (atypique) régulent l'assemblage des jonctions serrées et ainsi la polarité apicale et basolatérale des cellules épithéliales. Les neurones différenciés sont contrôlés par la protéine Rho A qui exerce un effet inhibiteur sur la pousse neuronale au niveau du cône de croissance et des épines dendritiques. Si on inhibe Rho kinase, les neurones se mettent à pousser (pousse de neurites). On distingue deux types de mouvements cellulaires : a- Mouvements non coordonnés Chaque cellule suit un mouvement qui lui est propre (cas des cellules cancéreuses), ce mouvement est dû à plusieurs types de forces impliquant toute une réorganisation dynamique et polarisée du cytosquelette d actine. Forces de protusion (Rac) Forces contractiles du corps cellulaire (Rho A) permettant la rétraction à l arrière de la cellule en cas de perte d adhérence : il y a inhibition de Rho A Orientation du mouvement due à Cdc 42 Cas des cellules cancéreuses (cellules invasibles) : pas de mouvement par chimiotaxie, mouvement induit par la cellule elle-même. La migration cellulaire s accompagne de la modification des programmes transcriptionnels et de la sécrétion de protéases à un pôle donné de la cellule dégradant la matrice extracellulaire, ce qui permet à la cellule d avancer. Cas de la croissance des neurones : les neurones sont soumis à deux types de molécules : les chimioattracteurs qui génèrent la pousse en activant Rac et Cdc 42 et les chimiorépulseurs qui l inhibent via Rho b- Mouvements coordonnés Des populations de cellules migrent en même temps, on retrouve ce cas dans l organogenèse et la réparation tissulaire. Un test de lésion sur un tapis cellulaire montre que les cellules «sentent» l espace libre et vont le reboucher. Rac est essentielle pour donner le mouvement cellulaire, les cellules migrent perpendiculairement à la déchirure depuis l élongation de leur MTOC et leur appareil de Golgi. Il existe des signaux sécrétés par la cellule pour inhiber un signal cellulaire.

10 Fonctions des vaisseaux sanguins : - conduction du sang - protection des tissus qu ils inhibent : système de contrôle qualité pour l organisme Les vaisseaux sont constitués de 2 grands types de cellule : - une couche de cellules endothéliales en contact avec le sang, allongées dans le sens de la circulation, avec beaucoup de Rac et peu de Rho - deux couches de cellules musculaires lisses : beaucoup de Rho et un peu de Rac Rac : - contrôle de l expression du gène induisant réaction inflammatoire - migration des cellules - angiogenèse : fabrication de nouveaux vaisseaux pour alimenter une tumeur Rho A : contraction des muscles lisses causée par une phosphorylation des chaînes légères de la myostine, ce qui induit une augmentation de la pression

11 MLCK : Kinase des chaînes légères de myosine. Cette protéine est activée par la concentration en calcium via la Calmoduline (CAM). La MLCP permet de déphosphoryler la chaîne légère. La Rho K phosphoryle la MYPT et la désactive. Ces protéines sont impliquées dans la phagocytose (Cdc 42) :

12 Rho A est impliqué dans la phase G1 du cycle cellulaire, Rho A contrôle un répresseur et un activateur du cycle cellulaire : - Active la cycline D1 - Inhibe le répresseur P21 Cip1 - Contrôle aussi la formation d'un anneau d'actine qui permet la cytodiérèse