Développement du couplage LC-MALDI-MS/MS pour l analyse des toxines d origine phytoplanctonique

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1 Développement du couplage LC-MALDI-MS/MS pour l analyse des toxines d origine phytoplanctonique Christelle DELEUZE Licenciée en Sciences Chimiques Laboratoire de Spectrométrie de Masse Service du Professeur E. De Pauw Université de Liège

2 Philosophie du projet Convention de recherche Prolifération d espèces phytoplanctoniques productrices de toxines Problème de santé publique émergent Nécessité de méthodes d analyses Objectif de la convention Mise au point d une technique de détection et de quantification de toxines par une méthode fiable et de référence: La spectrométrie de masse But: Surveillance: - Ressources en eau - Produits de consommation

3 Problématique des phycotoxines Phycotoxines Toxines produites par phytoplancton Phytoplancton (plancton végétal) PREMIER maillon chaîne alimentaire (écosystème aquatique) Vecteur de propagation de toxines

4 Problématique des phycotoxines Types d intoxications - Contact avec l eau (baignade, ) Cyanotoxines (eaux douces) - Ingestion de produits de l aquaculture Toxines marines: accumulation dans coquillages filtreurs Syndromes ASP, DSP, PSP Pourquoi les doser? - Effets importants (Caruaru 1996) - Résistance à la congélation et cuisson - Métabolites potentiellement dangereux

5 Apport de la spectrométrie de masse Qu est-ce que la spectrométrie de masse (MS)? Ioniser: Sources MALDI et ESI Analyser et quantifier Identifier Un spectromètre de masse «pèse» les molécules ionisées

6 Apport de la spectrométrie de masse Méthodes classiques : Tests biologiques (ELISA) Sensibles Risque important de faux positifs Référence: Spectrométrie de masse Identification non ambiguë - MS à haute résolution - MS en «tandem» Quantification possible

7 Philosophie du projet Mise au point du couplage LC-MALDI pour l analyse de molécules à faible poids moléculaire (phycotoxines) Méthode conventionnelle: HPLC-ESI-MS/MS Méthode développée : HPLC-MALDI-ToF-MS(/MS)

8 Philosophie du projet Avantages LC-MALDI><LC-ESI Mémoire physique ToF><Quadripôle Sensibilité en spectre complet Possibilité de détecter et identifier toxines inconnues

9 Challenges Sélection de matrices MALDI Ad hoc petites molécules éviter interférence en masse Optimisation de la séparation HPLC de toxines de structures variées Mise au point de la quantification Standards MALDI

10 Résultats Toxines analysées - Cyanotoxines: produites par des cyanobactéries dans l écosystème d eau douce - Microcystin LR - Nodularin - Cylindrospermopsin - Phycotoxines: produites par les micro-algues plancton - PSP: Saxitoxin, Neosaxitoxin, Gonyautoxin 1, 2, 3 & 4 - DSP: Domoic acid - Lipophilic toxins: Pectenotoxin-2

11 Résultats:MALDI-ToF Mise au point de matrices MALDI Matrices classiques: 150 < MM < 500 Interférences dans le spectre de masse Cristaux inhomogènes: reproductibilité faible d un tir LASER à l autre Matrices développées: Matrices ioniques liquides - peu d interférences - résolution améliorée - QUANTIFICATION facilitée

12 Résultats:MALDI-ToF Mise au point de matrices MALDI Matrices classiques (cristaux) Matrices ioniques liquides Anderson, J. L.; Armstrong, D. W.; Wei, G. T. Analytical Chemistry 2006, 78,

13 Résultats:MALDI-ToF Mise au point de matrices MALDI Matrices LIQUIDES ioniques facilitent la quantification Construction de courbes d étalonnage Matrices classiques >< Matrices ioniques liquides Courbe d'étalonnage: Nodularin sur DHB Courbe d'étalonnage: Nodularin sur ILM1 Aire absolue y = x R 2 = >< Aire absolue y = x R 2 = Concentration (µm) Concentration (µm)

14 Résultats: Séparation HPLC HPLC classique : Phase inverse (C18) φ stationnaire APOLAIRE φ mobile POLAIRE 11 toxines, structures très variées: - Ions - Peptides cycliques - Polyether cycliques - Couples de stéréoisomères Observation Seuls les peptides sont retenus sur les colonnes C18

15 Résultats: Chromatographie HILIC Séparation HPLC «classique» peu efficace Nouveau type de chromatographie Chromatographie HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) trait d union entre chromatographies en phase normale et inverse Phase stationnaire Phase mobile Type de molécules séparées Phase normale Phase inverse Polaire Apolaire (KO MS) Polaires Apolaire Polaire (OK MS) Moyennement polaires HILIC Polaire Moyennement polaire (OK MS) Polaires

16 Résultats: Chromatographie HILIC Séparation d un mélange de 11 toxines MODE POSITIF: Ions retenus et séparés

17 Résultats: Chromatographie HILIC Séparation d un mélange de 11 toxines MODE POSITIF: Toxines peptidiques retenues, conditions à optimiser

18 Résultats: Chromatographie HILIC Séparation d un mélange de 11 toxines MODE NEGATIF: Séparation de stéréoisomères ioniques

19 Résultats: Analyse de spiruline HPLC «classique»: Séparation de microcystin LR et nodularin MS(/MS): Détection mise au point (méthode classique) Test d extraction de ces deux toxines dans la spiruline Manipulation - Echantillons fortifiés par mélange des toxines AVANT extraction APRES extraction - Echantillons non fortifiés

20 Résultats: Analyse de spiruline Echantillon blanc Echantillon fortifié AVANT extraction Echantillon fortifié APRES extraction => Pas de Microcystin LR dans l échantillon (<LOD)

21 Conclusions et perspectives Séparation HPLC - Optimisation phase HILIC - Transfert sur HPLC-MALDI Méthodes de quantification - Détermination matrices d intérêt - Mise au point de l extraction - Développement de la quantification A terme - DEUX méthodes mises au point Méthode classique LC-ESI-MS/MS: Fiable pour suivi prédéfini (Toxines connues ET cherchées) Méthode LC-MALDI-MS(/MS): Possibilité de détermination de toxines inconnues OU dont le suivi n était pas prévu

22 Remerciements Aquapôle (ULg) F.R.I.A. : Fonds national pour la Recherche dans l Industrie et dans l Agriculture Ministère de la Région Wallonne European Union Structural Funds Laboratoire de Spectrométrie de Masse - E. De Pauw - J. Widart - F. Guillonneau

23 Laboratoire de Spectrométrie de Masse

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