DETERMINATION QUANTITATIVE DE LA TENEUR EN ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC- MS/MS. Version 02 Date d application

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1 Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire Laboratoire de Liège MET-LFSAL- 139 DETERMINATION QUANTITATIVE DE LA TENEUR EN ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC- MS/MS Version 02 Date d application Rédaction par : Vérification par : Autorisation de publication par : Marie-Christine Offermanne (Expert technique) Marianne Aubry (Quality Manager) Fabian Etienne-Thewissen (Chef de section) Gestion et localisation de la version valide : LFSAL : disque local M:\Qualité\ Méthode\LAB 23 I-MET LFSAL -139.doc Destinataires : Membres du personnel de la section Phyto-Résidus. Mots clefs : Acrylamide UPLC-MS/MS chromatographie LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 1/15

2 Aperçu des modifications Révision par/date* Offermanne Marie-Christine 15/06/2013 Etienne- Thewissen Fabian 21/11/2013 Motif de la révision Première version Adaptation suite à l audit LFSAL Partie du texte/portée de la révision Points : * L écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans. LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 2/15

3 1 OBJECTIF CHAMP D APPLICATION DOCUMENTS LEGAUX ET NORMATIFS DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS PRINCIPE INDICATEURS DE PRESTATION CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUE REACTIFS ET SOLUTIONS RÉACTIFS SOLUTIONS EQUIPEMENTS METHODE PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS INCONNUS PRÉPARATION DE L ÉCHANTILLON DOPÉ PRÉPARATION D UN BLANC MÉTHODE PRÉPARATION D UN ÉCHANTILLON DE CONTRÔLE CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES SÉQUENCE D INJECTION DES SOLUTIONS CONTRÔLE DE LA QUALITÉ CONTRÔLES DE PREMIÈRE LIGNE CONTRÔLES DE DEUXIÈME ET TROISIÈME LIGNE CALCUL ET RAPPORTAGE RÉFÉRENCES AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES OU LISTES Y AFFÉRENTS PROCÉDURES FORMULAIRES LISTES ANNEXES LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 3/15

4 1 Objectif La méthode décrit les procédures d'extraction, de purification et d'analyse de l'acrylamide dans divers aliments : pain, frites, céréales et dérivés, café et épices et aliments pour bébés. L'acrylamide est le nom usuel du 2-propénamide (amide acrylique) de formule brute C3H5NO. Acrylamide L acrylamide peut se former notamment lors de la cuisson (friture, rôtissage..) à haute température d aliments riches en hydrate de carbone (amidon, sucres) et en protéines. La formation de l'acrylamide semble fortement influencée par la température de cuisson, la teneur en eau des aliments, ainsi que le «brunissage» (carbonisation) des produits. Les aliments les plus concernés seraient d'abord les produits à base de céréales et de pomme de terre (tels que les chips ou les frites), les pains et pâtisseries et généralement tous les produits soumis à des températures élevées comme le café ou les amandes grillées. On sait depuis quelques années que de l'acrylamide apparaît «spontanément» lors de la cuisson de certains aliments à plus de 120 C. 2 Champ d application La méthode permet de quantifier l acrylamide à des concentrations supérieures à 30 µg/kg par UPLC-MS dans les matrices suivantes : - Matrices sèches : biscuits, biscottes, café, pain, aliments pour bébés, - Matrices grasses : frites précuites, chips, La méthode permet de quantifier l acrylamide à des concentrations supérieures à 30 µg/kg (transition ion/ion la plus intense) pour le pain et les aliments pour nourrissons et enfants en bas âge, et supérieures à 50 µg/kg pour les produits à base de pommes de terre, les autres produits à base de céréales, le café et les autres produits par UPLC-MS dans les matrices suivantes : LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 4/15

5 - Matrices sèches : biscuits, biscottes, café, pain, aliments pour bébés, - Matrices grasses : frites précuites, chips, 3 Documents légaux et normatifs - Recommandation de la commission du 2 juin 2010 concernant la surveillance des niveaux d'acrylamide dans les aliments ( /307/UE) - Recommandation de la commission des sur les niveaux d'acrylamide dans les études alimentaires 4 Définitions et abréviations S/N : Signal to Noise MRM : Multiple Reaction Monitoring UPLC : Ultra-high Performance Liquid Chromatography MS : Mass Spectrometry ES+ : electrospray positif ml : millilitre IP : ion précurseur IQ : ion de quantification IC : ion de confirmation EC : énergie de collision ev : électronvolt SPE : solid phase extraction SI : standard interne Tpm : tours par minutes ACN : acétonitrile EtOH : éthanol HAc : acide acétique MeOH : méthanol H2O : eau 5 Principe Les échantillons sont préalablement homogénéisés. Suivent alors une extraction et une purification, puis détection, identification et quantification à l aide d un UPLC-MS/MS en mode MRM. La quantification est réalisée par étalonnage externe. LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 5/15

6 6 Indicateurs de prestation (données de validation de la méthode) Répétabilité-Reproductibilié intra-laboratoire : Matrice sèche : Concentration (µg/kg) n x p Répétabilité : 2,8 x Sj(r) (µg/kg) Reproductibilité : 2,8 x Sj(FI) (µg/kg) CV r (%) CV r Max (%) 2/3 CV Hor CV R (%) CV R Max (%) CV Hor x 6 6,4 17,5 2,7 15,5 8,1 23,3 Matrice grasse : Concentration (µg/kg) n x p Répétabilité : 2,8 x Sj(r) (µg/kg) Reproductibilité : 2,8 x Sj(FI) (µg/kg) CV r (%) CV r Max (%) 2/3 CV Hor CV R (%) CV R Max (%) CV Hor x 6 18,9 57, Incertitude de mesure Matière sèche Matière grasse 19% 18% 7 Consignes de sécurité et mesures spécifique Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et dans le log book de l'appareil. Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte. L influence de la lumière (du jour ou artificielle) n est pas connue. Éviter d y exposer inutilement les réactifs et les solutions. 8 Réactifs et solutions Réactifs : les standards analytiques et les solutions sont conservés selon les conditions reprises sur les certificats. Les solvants sont conservés à température ambiante. LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 6/15

7 8.1 Eau de qualité UPLC Ethanol Méthanol de qualité UPLC Méthanol de qualité HPLC Dichlorométhane Acide Acétique Acrylamide Acrylamide-d3 (standard interne) 8.2 Solutions Solutions d Acrylamide Solution stock (SS) d Acrylamide à 1 mg/ml : 20 mg/ 20 ml d éthanol Solution fille A (SFA) d Acrylamide à 5µg/ml : 100 µl SS/ 20 ml d eau Solution fille B (SFB) d Acrylamide à 0,5 µg/ml : 1000 µl SFA/ 10 ml d eau Solution fille C (SFC) d Acrylamide à 0,05 µg/ml : 100 µl SFA/ 10 ml d eau Solutions de Standard Interne (Acrylamide-d3) Solution stock (SIS) d Acrylamide-d3 à 1 mg/ml : 10 mg/ 10 ml d éthanol Solution fille A (SIA)d Acrylamide-d3 à 10µg/ml : 100 µl SIS/ 10 ml d eau Solution fille B (SIB)d Acrylamide-d3 à 0,5µg/ml : 1000 µl SIA/ 20 ml d eau Solutions d étalonnage L1 à L5 6: Niveau de calibration Solution d Acrylamide (µl) Solution d Acrylamided3 (µl) Eau de qualité UPLC (µl) Concentration finale (ng/ml) SFC 500 SIB SFB 500 SIB SFB 500 SIB SFA 500 SIB SFA 500 SIB SFA 500 SIB Solution d acide acétique 0,1% LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 7/15

8 - pipeter 500 µl d acide acétique dans une fiole jaugée de 500 ml - amener au volume avec de l eau pour LC-MS et homogénéiser. 9 Equipements Tubes Falcon de 50 ml Moulinette-mixer Balance analytique Trébuchet Bain à ultrasons Agitateur orbital Centrifugeuse (5000 t/min) Micropipettes et tips Seringues et filtres acrodisk de 0,2µm Tubes à essai en pyrex Système sous-vide pour cartouches SPE Vials Cartouches SPE HLB Oasis 200 mg, 6 ml Cartouches SPE Bond Elut- Accucat 200mg, 3 ml Chaîne UPLC-MS équipée d un détecteur de masse de type triple quadrupôle, d une colonne analytique permettant une résolution correcte de l acrylamide. La colonne Synergi 2.5µm Hydro-RP 100A 100x2,0mm est donnée à titre d exemple. 10 Méthode 10.1 Préparation des échantillons inconnus Préparation et extraction Broyer et homogénéiser l échantillon à l aide d un mixer. Dans un falcon de 50 ml, peser au trébuchet environ 1 g d échantillon homogénéisé (0,5g pour la matrice café), avec une précision de 0,01g. Ajouter 500 µl de la solution SIB de standard interne. Compléter le volume à 15 ml avec de l eau de qualité UPLC. Agiter vigoureusement et placer 15 minutes au bain à ultrasons. Ajouter 2 ml de dichlorométhane. Agiter vigoureusement et placer 20 minutes à l agitateur orbital. Centrifuger 15 minutes à 5000 t/min. Filtrer le surnageant sur filtre acrodisk de 0,2µm LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 8/15

9 Purification sur cartouche SPE Oasis Conditionnement : + 3,5 ml de méthanol de qualité HPLC + 3,5 ml d eau de qualité UPLC Echantillon : + 1,5 ml de surnageant Lavage : + 0,5 ml d eau de qualité UPLC Elution : + 1,5 ml d eau de qualité UPLC Récolter la dernière fraction dans un tube à essai en verre. Attention: la cartouche SPE ne peut pas aller à sec, sauf pour l élution! Purification sur cartouche SPE Accucat Marquer un trait à 1 ml sur la cartouche Conditionnement : + 2,5 ml de méthanol de qualité HPLC + 2,5 ml d eau de qualité UPLC Echantillon : + la totalité de l éluat issu de la cartouche Oasis Eliminer jusqu au trait à 1 ml Récolter le reste et transférer dans un vial Attention: la cartouche SPE ne peut pas aller à sec pour le conditionnement! 10.2 Préparation de l échantillon dopé de contrôle A chaque séquence d analyses, un échantillon de la série est dopé. Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, et ajouter précisément à la micropipette une certaine quantité d une des solutions filles en acrylamide correspondante, en même temps que la solution de standard interne. Par exemple, pour un dopage à 100 µg/kg, ajouter 200 µl de la SFB en acrylamide à 0,5 µg/ml. A chaque série d analyse : - Un échantillon pain est préparé suivant la procédure des échantillons inconnus. - Contrôle basse concentration : le même échantillon est supplémenté en acrylamide par l ajout de 100 µl de la solution SFB et préparé selon la procédure des échantillons inconnus. LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 9/15

10 - Contrôle haute concentration : le même échantillon est supplémenté en acrylamide par l ajout de 200 µl de la solution SFA et et préparé selon la procédure des échantillons inconnus Préparation d un blanc méthode A chaque séquence d analyses, un blanc méthode est réalisé. Pour ce faire, suivre la procédure de préparation des échantillons inconnus, ajouter la solution de standard interne, mais ne pas ajouter d échantillon ni de solution de dopage dans le falcon de 50 ml Préparation d un échantillon de contrôle Par série, et par type de matrice, un échantillon de contrôle est ajouté. Il s agit d un échantillon de la série supplémenté à 50 µg/kg en acrylamide Conditions chromatographiques Paramètres de l UPLC : Volume d injection : 2 µl Température de la colonne : 30 C Température de l autosampler : 10 C Solvant de rinçage de la seringue et du piston : Eau (UPLC) (80%) Méthanol (UPLC) (20%) Gradient d élution : Temps (min) Flow (ml/min) A : Eau UPLC B : Méthanol UPLC D : Eau + 0,1% HAc Initial Paramètres du spectromètre de masse Mode ESI. Polarité : ES+ Température de la source : 150 C Température de désolvatation : 650 C LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 10/15

11 Débit de gaz de désolvatation : 1000 l N 2 / heure Débit de gaz cone : 150L/heure Débit de gaz collision : 0.2 ml/minute Acquisition : MRM - Acrylamide : m/z 72 > 55 - Acrylamide-d3 : m/z 75 > Séquence d injection des solutions courbe d étalonnage L1 à L5 blanc méthode échantillons inconnus et types (max 8) L1 et L4 (quality check) échantillons inconnus et types (max 8) L1 et L4 (quality check) 11 Contrôle de la qualité 11.1 Contrôles de première ligne Identification des pics : l analyse est réalisée en mode MRM (transition m/z : 72 > 55) Identifier l acrylamide dans la solution d échantillon en comparant le temps de rétention avec celui des solutions de contrôle (L1 et L4) l encadrant. Les temps de rétention ne peuvent différer de plus de 5 %. Identifier l acrylamide dans la solution d échantillon en comparant le temps de rétention de l acrylamide et de l acrylamide-d3. Les temps de rétention ne peuvent différer de plus de 0,05 minute Contrôle du blanc méthode Le blanc méthode ne peut présenter de pic ayant un S/N >10 3 aux temps de rétention de l acrylamide ou de l acrylamide-d3 (SI) Contrôle de la droite d étalonnage LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 11/15

12 La quantité trouvée pour les injections des niveaux d étalonnage (QC : L1 et L4) ne peut différer de plus de 10 % de la quantité théorique. Pour chaque niveau d étalonnage, le pourcentage de déviation entre la concentration mesurée et la concentration théorique doit être inférieur à 10% Le rejet d un des points d étalonnage est autorisé à condition que cela ne soit ni le premier ni le dernier niveau Suivi de l échantillon de contrôle Le rendement de l échantillon de contrôle devra être compris dans l intervalle 100 +/- l incertitude de mesure. Si ce critère n est pas rencontré, la série d analyse doit être recommencée Contrôles de deuxième et troisième ligne Des contrôles deuxième et troisième ligne sont réalisés selon la procédure : «LAB 23 P 020 Gestion des contrôles qualité». 12 Calcul et rapportage Établir la droite d étalonnage en rapportant les facteurs de réponse des pics des solutions étalons par rapport aux concentrations correspondantes en µg/kg. La droite d étalonnage est du type y = ax + b On peut déterminer la quantité d analyte X (µg/kg) présent dans l échantillon selon la formule : X = (y-b) a x PE La non-conformité du résultat est appréciée sur base des fiches techniques disponibles sur Intranet. 13 Références aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents 13.1 Procédures LAB 23 P 020 Gestion des contrôles qualité LAB 23 P 018 Création et suivi des cartes de contrôle qualité LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 12/15

13 13.2 Formulaires LAB23 F543-PR-ACRYLAMIDE : Rapport d exécution Dosage de l Acrylamide 13.3 Listes néant LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 13/15

14 14 Annexes Annexe 1 : Flowchart de la préparation des échantillons. Blanc méthode: Echantillon dopé: Echantillon: Echantillon de contrôle: Tube Falcon de 50 ml Tube Falcon 50 ml + solution Tube Falcon 50 ml + 1 g Tube Falcon 50 ml + 1 g échantillon type fille en acrylamide + 1 g échantillon (0,5 g si café) échantillon (0,5 g si café) µl SFB en acrylamide-d3 (SI) (=250 ng) Amener à 15ml avec eau qualité UPLC 15 minutes au bain ultra-sons + 2 ml dichlorométhane 20 minutes à l agitateur Centrifuger 15 minutes à 5000 tpm Récupérer le filtrat afin de le purifier sur colonne Purification manuelle sur colonne SPE HLB Oasis 200mg/6ml Conditionnement : + 3,5 ml méthanol de qualité UPLC + 3,5 ml H 2O de qualité UPLC Echantillon: + 1,5 ml extrait (surnageant) Lavage: + 0,5ml LC-MS H 2O Elution: + 1,5ml LC-MS H 2O Récolter dans tube en verre La colonne SPE ne peut pas aller à sec sauf pour l élution! Purification manuelle sur colonne SPE Bond-Elut AccuCAT 200mg/3ml Marquer le trait 1 ml sur la cartouche Conditionnement : + 2,5 ml méthanol + 2,5 ml H 2O de qual. UPLC Echantillon: + la totalité de l extrait issu de la cartouche Oasis Eliminer jusqu au trait à 1 ml Récolter dans un tube en verre La colonne SPE ne peut pas aller à sec pour le conditionnement! transférer dans un vial pour LC-MS LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 14/15

15 ACRYLAMIDE DANS LES ALIMENTS PAR UPLC-MS/MS Annexe 2 : Flow chart : «Détermination de la teneur en acrylamide dans les aliments par LC/MS» 1g échantillon broyé ng SI + solution de dopage (si échantillon dopé) + amener à15ml avec eau de qualité UPLC Ajouter 2 ml de dichloromethane Placer 15 minutes au bain à ultra-sons Placer 20 minutes à l agitateur rotatif Centrifugation 15 minutes à 5000 t/min Passer 1,5 ml du surnageant sur cartouches SPE LAB 23 I-MET 139 LFSAL ACRYLAMIDE v.02 15/15