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1 Dans les cours d'eau, notamment canalisés, et dans les régions densément habitées ou d'agriculture intensive, les nitrites sont souvent un paramètre important de déclassement des cours d'eau. Chez l'homme et les mammifères, la présence de nitrites dans le sang empêche l'hémoglobine de fixer convenablement l'oxygène. C'est l'une des causes de la «maladie bleue du nourrisson», plus savamment appelée «méthémoglobinémie». C'est pourquoi la teneur en nitrites dans l'eau potable est réglementée (notamment pour la préparation des biberons) et, indirectement celle des nitrates en raison de leur capacité à se transformer en nitrites. En milieu acide, comme c'est le cas dans l'estomac, les nitrites, souvent présents dans la charcuterie comme additifs (E250 et E249), forment avec les amines secondaires des nitrosamines toxiques, très vraisemblablement cancérigènes. La D.J. de ces deux additifs est de 0,06 mg/kg de masse corporelle La formule de l'ion nitrite est NO 2. La teneur en nitrite dans l'eau destinée à la consommation humaine est donc règlementée, elle ne doit pas dépasser 0,1 mg/l (l'oms préconisait 0,2 mg/l en 2006). d'après Le but du TP est de doser les ions nitrite dans une eau afin de savoir si elle est potable ou non. Pour cela, on va utiliser deux techniques de dosage spectrophotométriques : la première (partie ) est adaptée de la technique décrite par la norme FNOR NF T , c'est une méthode utilisant une gamme d'étalonnage. la seconde (partie B) utilise la méthode des ajouts dosés. I. Principe des dosages : En milieu acide, les ions nitrite réagissent avec une amine aromatique (composé comprenant une fonction amine NH 2 fixée sur un noyau benzènique C 6 H 5 ), pour former un sel de diazonium selon une réaction appelé diazotation. Ici on utilise le chlorure de N-(naphtyl-1) diamino-1,2-éthane ou NED : NED sulfanilamide L'ion diazonium, en présence d'un dérivé de l'acide sulfanilique, l'amino-4-benzenesulfonamide ou sulfanilamide, donne un complexe rose. Cette réaction est très sensible ; elle permet de détecter de très faibles quantités d'ions nitrite. La limite de détection de la méthode se situe aux environs de 1µg/L d'ions nitrite. Elle est applicable directement à des échantillons dont la concentration massique en ions nitrite est inférieures à 1 mg/l. II. Données de sécurité : réactifs formule pictogrammes Masse molaire divers chlorure de N-(naphtyl- 1) diamino-1,2-éthane ou NED amino-4- benzenesulfonamide ou sulfanilamide C 12 H 14 N 2, 2 HCl 259,2 g/mol CS n H319 - H315 C 6 H 8 N 2 O 2 S 172,2 g/mom CS n Consignes de récupération : Page 1/7

2 - toutes les solutions seront vidées dans un bidon de récupération prévu à cet effet. III. Données diverses : Masses molaires atomiques ( g.mol -1 ) : H : 1,0 N : 14,0 O : 16,0 Couleur Longueur d'onde (nm) Couleur complémentaires Violet extrême 400 Violet moyen 420 vert-jaune violet-bleu 440 Bleu moyen 470 Jaune Bleu-vert 500 Vert moyen 530 pourpre vert-jaune 560 Jaune moyen 580 Bleu jaune-orangé 590 Orange moyen 600 bleu-verdâtre orangé-rouge 610 Rouge moyen 650 vert-bleu Rouge extrême 780 Source : IV. partie : dosage par la méthode de la gamme d'étalonnage : 1. Préparation de la gamme : À partir d'une solution mère (S m ) à la concentration C m = 10,0 mg/l en ions nitrite, vous allez devoir préparer par dilution 100 ml de solution étalon (S e ) à 1,00 mg/l. ttention : toute la suite du TP dépend de la précision avec laquelle vous aller préparer cette solution étalon! 1. Quel matériel, disponible sur votre paillasse, allez-vous utiliser? Il faudra utiliser une pipette jaugée de 10 ml, une fiole jaugée de 100 ml, de l'eau distillée et une propipette. 2. Indiquer brièvement les différentes étapes de la dilution. - Mettre un peu de solution mère dans un bécher. - Rincer la pipette à l'eau distillée puis avec la solution mère. - Rincer la fiole à l'eau distillée. - Prélever 10,0 ml de solution mère, placer dans la fiole jaugée. - Compléter au trait de jauge avec de l'eau distillée, boucher, puis homogénéiser. Une fois que ces réponses ont été validées par un enseignant, réaliser la solution étalon S e. Numéroter 7 tubes à essais de 0 à 6. Introduire dans les 6 premiers tubes 0, 2, 4, 6, 8, 10 ml de solution étalon. (cf. tableau ci-dessous en cas de doute!) Compléter chaque tubes à 10 ml avec de l'eau distillée. Dans le tube n 6, introduire 10 ml d'eau à doser jouter dans chaque tubes 0,2 ml de réactif de diazotation, boucher et homogénéiser. Laisser la coloration se développer pendant environ 30 minutes. Page 2/7

3 Pendant ce temps, vous pouvez répondre à quelques unes des questions suivantes et préparer le dosage de la partie B. 3. Compléter le tableau ci-dessous en expliquant le calcul de la concentration en ions nitrite pour la solution du tube n 1 : tubes Solution étalon S e (ml) Eau distillée (ml) 0 (témoins) Réactif (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Concentration en ions nitrite (mg/l) Calcul de la concentration dans le tube n 1 : 0,196 0,392 0,588 0,784 0,980 On a mis 2 ml de solution étalon, puis on a ajouté 8 ml d'eau et 0,2 ml de réactif. Le volume final de la solution est donc 10,2 ml. C 1 = C e x 2 10,2 = 0,196 mg/l 2. Mesures et exploitations : On donne le spectre d'une des solutions obtenues : 2,5 spectre diazoïque olympiades ,0 1,5 1,0 0,5 0, longueur d'onde (nm) 4. À quelle longueur d'onde doit-on mesurer l'absorbance des solutions? On observe un pic d'absorbance à 540 nm, c'est à cette longueur d'onde qu'il va falloir travailler. 5. À quoi sert la solution préparée dans le tube n 0? C'est un tube dans lequel il n'y a pas d'ion nitrite. Il va servir à «faire le blanc». Page 3/7

4 6. pourquoi la solution est-elle rose? La solution absorbe autour de 540 nm, ce qui correspond à la lumière verte. Elle nous apparaît donc de la couleur complémentaire, c'est à dire le pourpre (rose!) u bout de 30 minutes de repos, préparer 7 cuves spectrophotométriques avec un peu de chacune des solutions contenues dans les tubes 0 à 6. Mesurer les absorbances à l'aide du spectrophotomètre réglé à la «bonne» longueur d'onde et compléter le tableau de la question 7. tubes Concentration en ions nitrite (mg/l) 7. tableau de mesures (cf. question 3 pour la première ligne) : 0 (témoins) ,196 0,392 0,588 0,784 0,980? bsorbance 0,071 0,169 0,270 0,371 0,469 0, Tracer la graphe de l'absorbance en fonction de la concentration en ions nitrite (sur papier millimétré ou dans un tableur selon le matériel mis à votre disposition) : 0,500 =f(c) 0,450 0,400 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 C (mg/l) 8. Que peut-on dire des points expérimentaux? À quelle loi cela correspond-il? 0,500 0,450 0,400 f(x) = 0,482x - 0,009 R² = 0,999 =f(c) 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 C (mg/l) Page 4/7

5 Les points expérimentaux sont sur une droite qui passe par l'origine. Il s'agit de la loi de Beer Lambert : l'absorbance est proportionnelle à la concentration de l'espèce absorbante = k x C. 9. déterminer la concentration en ions nitrites dans l'eau. si on utilise un tableur, on peut utiliser l'équation de la droite de régression : = 0,482 x C pour l'eau, on a mesuré = 0,227, ce qui donne C = 0,471 mg/l Si on utilise du papier millimétré, on trace l'horizontale =0,227 sur le graphique. Cette horizontale coupe la droite d'étalonnage pour C = 0,471 mg/l 10. L'eau est-elle potable? La concentration en ions nitrite est de 0,471 mg/l, or la limite autorisée est de 0,1 mg/l. L'eau n'est pas potable. V. partie B : dosage par la méthode des ajouts dosés : 1. Préparation de la gamme : On utilisera la solution étalon (S e ) à 1,00 mg/l et le tube témoins (tube n 0) que vous avez préparé dans la partie. Numéroter 5 tubes à essais de 1 à 5. Préparer les tubes, de la même manière que pour la partie, mais selon les indications données dans le tableau cidessous. tubes Solution étalon S e (ml) Eau à doser (ml) Eau distillée (ml) Réactif de diazotation (ml) 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 Laisser la coloration se développer pendant environ 30 minutes. Pendant ce temps, vous pouvez terminer le dosage de la partie. 11. Quelle est la différence essentielle entre cette technique est celle de la partie? Dans cette partie, on ajoute l'eau que l'on veut doser dans les tubes à essais. 12. Dans le tableau ci-dessous, calculer les concentrations en ions nitrite (notées C aj ) provenant de la solution étalon S e seulement. Faire apparaître les calculs pour le tube n 5. tubes C aj (mg/l) 0,196 0,294 0,392 0,490 Calcul de la concentration dans le tube n 5 : On a mis 5 ml de solution étalon, puis on a ajouté 5 ml d'eau à doser et 0,2 ml de réactif. Le volume final de la solution est donc 10,2 ml. C aj5 = C e x 5 10,2 = 0,490 mg/l Page 5/7

6 2. Mesure et exploitations : u bout de 30 minutes de repos, préparer 5 cuves spectrophotométriques avec un peu de chacune des solutions contenues dans les tubes 1 à 5. Utiliser le tube 0 de la partie pour «faire le blanc». Mesurer les absorbances à l'aide du spectrophotomètre réglé à la «bonne» longueur d'onde et compléter le tableau suivant : tubes ,111 0,206 0,251 0,296 0,343 C aj (mg/l) 0,196 0,294 0,392 0, Tracer la graphe de l'absorbance en fonction de la concentration en ions nitrite (sur papier millimétré ou dans un tableur selon le matériel mis à votre disposition) : 0,400 =f(caj) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 C(mg/L) 14. Que peut-on dire des points expérimentaux? 0,400 f(x) = 0,472x + 0,112 R² = 1,000 =f(caj) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 C(mg/L) Page 6/7

7 Les points expérimentaux sont sur une droite qui ne passe pas par l'origine. 15. À l'aide de la réponse à la question 8, donner la relation liant l'absorbance d'une des solutions préparée dans cette partie et les concentrations C aj et C i (concentration en ions nitrite provenant de l'eau à doser). On notera k le coefficient de proportionnalité. = k x (C aj + C i ) 16. Que peut-on dire de C i dans le cas de cette expérience? On a mis 5mL d'eau dans chaque tubes et le volume final est le même (10,2 ml). On peut donc en conclure que C i est la même pour chaque tubes : c'est une constante! 17. Montrer que dans ce cas, on a = a x C aj +b, où a et b sont des constantes que l'on explicitera. = k x (C aj + C i ) = k x C aj + k x C i = a x C aj + b avec a = k et b = k x C i 18. Déterminer les valeurs des constantes a et b à l'aide de la courbe tracée à la question 13. on a a = 0,472 L/mol et b = 0, Calculer C i et en déduire la concentration C N en ions nitrite dans l'eau. D'après la question 17, on a C i = b a et d'après le protocole, on a C i = C N x ml. 5 10,2 car on a mis 5 ml d'eau à doser pour un volume final de solution de 10,2 Donc on a C N = b a x 10,2 5 = 0,484 mg/l. VI. Comparaison des résultats. 20. calculer l'écart entre les résultats trouvés par les deux méthodes. Méthode : C = 0,471 mg/l Méthode B : C = 0,484 mg/l e = (0,484 0,471) / 0,484 = 3% 21. Quelles sont les sources d'erreurs pouvant expliquer cet éventuel écart? - essentiellement les dilutions imprécises. Sources : partie : activités technologiques en biochimie 2 CRDP d'aquitaine partie B : adaptée de «Utilisation d un tableur dans l exploitation des courbes de dosage spectrophotométrique» - S. LECLERC, ENCPB / RNChimie. Page 7/7

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