Enzymein Higher Plants

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1 Diss.ETH N FunctionalAnalysisofInsulin-Degrading Enzymein Higher Plants A dissertation submittedto the SWISS FEDERALINSTITUTE OF TECHNOLOGY ZÜRICH for the degreeof DOCTOR ofnaturalsciences Presented by Yoann Huet MSc of Biology University ofnice Sophia-Antipolis, France Born Citizen of France Accepted on the recommendation of Prof. Dr. N. Amrhein, referent Prof. Dr. K. Apel,co-referent Prof. Dr. A. Schaller,co-referent Zürich, 2004

2 Abstract Insulin-degrading enzymes(ides) are evolutionary well conservedmetalloproteases ofthe inverzincin family, characterized by their HXXEH catalytic motif, a functional inversion ofthe HEXXHmotif found in the vast majority of metal-dependentpeptidases.this work reports the cloning of the first IDE cdna from plant origin and the biochemical characterization of the encoded protein. A partial tomato IDE (LelDE) cdna was previously isolated in a two-hybrid based genetic screen in yeast aiming to identify proteases able to cleave the wound-hormonesystemin, an 18 amino acid peptide involved in the wound response and defense against herbivorous insects in tomato plants. Recombinant GST-IdDE was shown to cleave systeminat the carboxy side of Lys14 in a MALDI-TOF mass spectrometry assay, as well as several other unrelated peptides. Specificityof LcIDE did not depend on an amino acid motif in the primary structureof its Substrates suggesting that, like its animal homologues, LelDE recognizes higher order structural elementsratherthan the primary sequence. An antiserum directed against the N- terminal catalytic domain revealed the presence of LelDE in all investigated tissues including roots, leaves, flowers, green fruits, and cotyledons but failed to detect the enzyme in apoplasticwash fluids or cell cultured supernatants.absence oficide from the apoplast, the suspected site of systemin inactivation, and the analysisof Le/DE-silenced plantsindicated that IcIDE is unlikely to be involved in systemindegradation in pianta. In order to further investigateide function in higher plants, Arabidopsiside mutants were isolated and characterized.the Arabidopsisgenome contains two IDE paralogues, IDE1 and IDE2, which are 75 % identical at the protein level. For the IDE2 transcript, several alternative splicingevents wereobservedincluding the retentionofpart ofintron2, leading to a frame-shiftand the disruptionofthe coding sequence for the catalytic motif. A T-DNA insertionlibrary was screened leading to the isolation of the idel-1 and ide2-l mutants with T-DNA insertions in the middle of the respective gene. RT-PCR analysisconfirmed that both mutants do not produce the full-iength transcript anymorebut truncated variants Idc2-1 showed a reduced rate of seed germination, ABA and sucrose hypersensitivityof seedlings, and a decrease of cytokinin-dependent shoot regeneration from calli. Idel-1 showed similar but less severe defects. Analysis of the idel-l/ide2-l were still detected. double mutant revealed a synergisticinteraction of the two mutations for some of the IV

3 phenotypes, indicating partial redundancy between IDE1 and 1DE2 function. A possible role for ArabidopsisIDEs in the regulation of proteasome activity, as shown in animal system, is discussed.

4 Resume Les IDEs (Insulin-degrading enzymes) sont des m&alloprot6ases qui ont i& remarquablement bien conserv^es au cours de Involution. Elles appartiennent ä la famille des inverzincines et sont caract6ris6es par leur motif catalytiquehxxeh, une inversion fonctionnelle du motifhexxhretrouve chez la majorite" des autres proteases nfressitant un ion mdtallique comme cofacteur. Le travail prkente" ici reporte le clonagedu premier cdna d'origine\6g6tsa codant pour une IDE, ainsi que la caractsrisation biochimique de l'enzyme. Un cdna incompletde tomate, codant pour une IDE (LcIDE), füt auparavant isole ä la suite d'un criblagegenetique base sur le system du double hybride chez la Ievure ayant pour but d'identifier des proteases capables de dsgraderla systemine, un Polypeptide de 18 acides amines implique" dans la reponse aux blessures et dans le Systeme de defense contre les insectes herbivores. Une analyse utilisant la spectrometrie de masse MALDI- TOF a montre que la proteine recombinante GST-LdDE coupe la systemine du cote" carboxyle de la Lys14, ainsi que d'autres peptides non apparentds. La spiciflcits du site de coupure dans les Substrats de LdDE est independantede leur structure primaire suggfrant meme facon que ses homologuesanimaux, LeIDE reconnait des elements que, de la structuraux d'ordre sup^rieur.un anti-s^rum dirigö contre le site catalytiquelocalis^ dans dans tous les tissues la partie N-terminalede la proteine a t6v&6 la presencede LeIDE analyses incluant les racines, les feuilles, les fleurs, les fruits verts et les cotyiedons mais l'enzyme n'a pu etre d6tect e dans des preparations de fluides apoplastiques,ni dans des surnageants de culture cellulaire. L'absence de LeIDE dans l'apoplast, le site pr&ume" de l'inactivation de la systemine, ainsi que l'analyse des plantes dans lesquelles l'expression de LeIDE est re>rim6epar RNA interference, indique que LeIDE n'est vraisemblablement pas impliqu^edans la degradation de la systemine in pianta. Afin d'approfondir l'etude fonctionnelle des IDEs chez les plantes sup rieures, des mutants ide ont ete isoi6s et caracterises chez Arabidopsis. Le genome &Arabidopsis contient deux paralogues, IDEI et IDE2, qui montrent 75 % de similarites au niveau de la sequence proteique. Concernant le transcript IDE2, plusieurs epissages alternatifs ont ete observes, incluant la retention d'une partie de J'intron 2 provoquant un deplacement du code de lecture et la disruption de la sequence codant pour le domaine catalytique. Une collection^arabidopsis transgeniques pour des insertions de T-DNA a ete cribiee et a permit l'isolation des mutants idel-1 et ide2-l pour lesquels un T-DNA s'est inseve au VI

5 milieu du gene respectif. Des analyses de RT-PCR ont demontre que, pour les deux mutants, les transcripts complets sont absents bien que des variants tronques peuvent encore etre detectes. Idc2-1 presente un taux de germinationreduit, une hypersensitivite des plantules au sucrose et ä l'aba, et une reduction de la capacite ä reinerer des nouvelles pousses ä partir de calli cultives en presence de cytokinine. Idel-1 montre un phenotype similaire bien que moins severe. L'analyse du double mutant idel-l/idc2-l a reveie une interaction synergique des deux mutations pour certains des phenotypes observes, indiquant une redondance partielle de la fonction d' 1DEI et 1DE2. Un röle suppose des IDEs dans la regulation de l'activitedu proteasomechez Arabidopsis, comme montre dans les systemesanimaux, est discute. VII