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1 Les Viroses respiratoires aigues Diagnostic Biologique Pr Abdelhalim Trabelsi Service de virologie CHU Sahloul,Sousse Faculté de pharmacie de Monastir Tunis le 7 Avril 2011 (13 janvier 2011)

2 INTRODUCTION Les viroses respiratoires constituent une préoccupation majeure surtout dans les âges extrêmes (enfant et personnes âgés). C est la 3ème cause de mortalité infantile. Chez l adulte, ces infections sont souvent bénignes, mais elles peuvent aussi devenir graves quand il s agit d un terrain débilité (bronchitique chronique, asthmatique). Les principaux agents en cause sont les virus grippaux, le virus respiratoire syncytial, les virus parainfluenza et les adénovirus. D autres virus émergents ont été rapportés ces dernières années.

3 Les recherches virales traditionnelles (VRS,v. influenza et parainfluenza, AdV,) montrent que : 40 à 50% des broncho-pneumopathies de l enfant étiquetées virales restent sans virus identifié, de même que 60% des broncho-pneumopathies de l adulte. Les données anciennes réservent peu de place à ces virus en pathologie respiratoire : simples agents de rhumes

4 Pourquoi un diagnostic Virologique? 1) Pour reconnaître, traiter et prévenir les infections sévères chez le sujets hospitalisés 2) Parce qu il nya n y aucun parallélisme entre: -La clinique et la virologie - Certaines infections bactériennes et virales 3) Pour la surveillance épidémiologique de certaines infections virales telle que la grippe

5 CONDUITE A TENIR Devant toute suspicion de pneumopathie virale Sécrétions é nasopharyngées ou écouvillonnage nasal Envoi immédiat au laboratoire ou conservation à +4 C (Fiche +++)

6 Quels virus? Quand faire le Diagnostic? Quelle méthode choisir?

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10 Quand? IRA débutant par une rhinite et une toux sèche,une fièvre modérée (durée maximale 2 à 4 jours)virus ++++ IRA débutant par des signes systémiques :le syndrome grippal Fièvre,malaise,myalgies (s accentuent en 12 à 24h),virus ++++ Ensuite : rhinite,toux toux et autres signes (après 1 à 2 jours) virus +++

11 Cinétique d évolution de la Grippe: Biologie

12 Quelle méthode choisir? Détection antigénique Isolement en culture Détection génomique Sérologie

13 Prélèvements Sécrétions naso-pharyngées écouvillonnage nasal Aspirations bronchiques LBA

14 Prélèvement respiratoire Il faut prélever des secrétions nasales et non pharyngées (épithélium non respiratoire) ou trachéo-bronchiques bronchiques. Le plus tôt possible après le début de la maladie. Par aspiration nasale (ou trachéale) en milieu hospitalier, ou par écouvillonnage en pratique communautaire: Il faut recueillir suffisamment de cellules épithéliales( l virus souvent associés aux cellules). l Pour l écouvillonnage: - Utiliser 2 écouvillons (1 par narine) - Réaliser un frottage appuyé de la muqueuse - Mettre le contenu dans un milieu de transport.

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16 Détection d antigènes viraux Immunofluorescence ELISA Agglutination de particules de latex Immuno-chromatographie hi

17 Immunofluorescence: Ac monoclonaux spécifiques: Inclusions fluorescentes souvent intracytoplasmiques à aspect granulaire ou homogène Avantages: - Simplicité, rapidité ( 30à 90 min) - Peu de précautions lors du prélèvement - Détection de plusieurs virus sur le même prélèvement - 90,6 % concordance avec les cultures cellulaires - 6,3 % de diagnostic (+) contre des cultures cellulaires (-) Inconvénients: Expérience de lecture

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19 Immunofluorescence : prélèvement fixé sur lame en verre) IFD : Prélèvements positifs en Virus Influenza A

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22 Immuno-cytomarquage Ag intra-cellulaires ou membranaires Ac marqués par une enzyme (peroxydase) Nécessité de cellules intactes Délai d exécution 1h Coût faible Estimation semi-quantitative Lecteur entraîné

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24 ELISA Technique Sandwich Avantages: -ne nécessite pas de cellules intactes -Délai d exécution jusqu à 12h -Pas de nécessité de manipulateur spécialisé Inconvénients: -Pas de recherche conjointe de plusieurs virus - Coût élevé -Pas de réactifs disponibles ibl pour tous les virus

25 Techniques immunoenzymatiques : plaque ELISA avec micropuits après révélation él

26 Technique Immuno-chromatographique Simple Rapide Ne nécessite pas de cellules intactes Sensibilité faible

27 Technique immuno-chromatographique

28 Isolement des virus pneumotropes sur cultures cellulaires

29 Isolement du virus Cellules en lignée continue (Hep2) fibroblastes humains (MRC5) Inconvénients: ECP lent (3 à 10 j), discret (syncytium, foyer peu dégénératif) virus fragiles milieu de transport Inadapté pour de nombreux virus émergents Avantages: ages Amplification de la charge virale. ae Elle demeure la seule méthode de diagnostic direct dans 2,8 % des cas.

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36 Diagnostic moléculaire

37 - L utilisation des outils moléculaires trouve surtout son intérêt dans la détection des virus émergents et/ou difficiles à cultiver. - Le typage moléculaire des souches isolées permet de tracer le profil épidémiologique des souches circulantes indispensable pour une meilleure compréhension de la pathogénie de la maladie, son immunité et par conséquent les moyens de lutte contre sa diffusion. i

38 Laboratoires spécialisés Plusieurs PCR simples ou multiplex l en parallèle Peu de trousses commercialisés Résultats en 2jou 4h (PCR en temps réel)

39 Simultaneous typing and HA/NA subtyping of influenza A and B viruses including the pandemic influenza A/H1N by multiplex real-time RT-PCR Yaowu Yanga J Virol Methods Jul;167(1): Epub 2010 Mar 19. Real time RT-PCR Multiplex. Distinguer les virus de la grippe saisonnière /Grippe AH1N Typage des souches saisonnières simultanément. Sensibilité copies/réaction.

40 Etude des facteurs de risque liés à l hôte et au virus

41 Performances des techniques

42 Les éléments de choix de la méthode 1) simplicité et rapidité de la technique Tests IF et ELISA 2) Efficacité: 3) Coût : performance des techniques de détection virale en général PCR > IF > culture coût matériel et temps En général IF<PCR<Culture 4) Echantillons: LBA > Asp Bronchique > Naso-pharynx Prélèvement précoce Recueil des cellules respiratoires

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44 Diagnostic sérologique

45 Peu d intérêt pour le diagnostic -Apparition tardive des Anticorps(10 jours) -Ascension lente (20 jours) -Élaboration inconstante chez les enfants de moinsde6mois mois -Difficulté d interprétation Ac maternels IgM trouvés dans 60 à 70 % des cas Titres faibles très peu de réactifs commercialisés c

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47 Diagnostic de La grippe

48 DIAGNOSTIC Signes cliniques souvent évocateurs mais parfois absents Nécessité d isoler et d identifier le virus Multiplication dans la cavité allantoïde d œufs embryonnés Test d hémagglutination des hématies de volaille Techniques rapides Techniques sérologiques Techniques moléculaires

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53 Oeuf embryonné de 11 jours

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55 Inhibition de l hémagglutination (IHA) : utilisation préalable d anti-sérums sur le surnageant de culture (Ac spécifiques capables d inhiber l hémagglutination en présence du virus initialement hémagglutinant) virus exprimant une HA Ac anti-ha1 GR A : culture cellulaire + anti-sérum spécifique Sédimentation sans hémagglutination B : culture cellulaire sans anti-sérum spécifique Hémagglutination

56 Interêt d un diagnostic rapide de la grippe Maîtrisedel épidémie Réduction des examens complémentaires Réduction de la fréquence et de la durée des hospitalisations La mise en route rapide du traitement anti- viral

57 CONCLUSION

58 -Les infections respiratoires constituent la majeure cause de consultation et d hospitalisation,surtout pendant les mois froids -Elles sont responsables d une réduction énorme du rendement de la population active (absentéisme professionnel et scolaire) -Les techniques rapides de détection des PNEUMOVIRUS US ont facilité le diagnostic des infections respiratoires virales. -Ce diagnostic est très utile voire indispensable pour la surveillance épidémiologique ainsi que pour la prise en charge et la prévention -Les études épidémiologiques et virologiques sont encore insuffisantes en Tunisie i

59 L examen virologique, même s il est cher,et si la demande est justifiée, Ne doit plus être perçu comme un luxe inutile

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