Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés

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1 Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés Module 10 PCR quantitative pour la détection d OGM F. Weighardt WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

2 PCR quantitative pour la détection d OGM 2 Table des matières Module 10 PCR quantitative pour la détection d OGM INTRODUCTION 3 METHODES DE QUANTIFICATION PCR 4 HISTORIQUE DES TECHNIQUES DE PCR EN TEMPS REEL 7 PRINCIPES DE PCR EN TEMPS REEL 7 PRINCIPES DE QUANTIFICATION AVEC PCR EN TEMPS REEL 13 REFERENCES 20

3 PCR quantitative pour la détection d OGM 3 Introduction Lorsqu un produit alimentaire est déterminé positif pour une ou plusieurs lignées GM (soja Roundup Ready, maïs Bt-176, maïs Bt-11, maïs MON810 et maïs T25), les étapes analytiques suivantes consistent à évaluer la conformité avec la législation en vigueur (Règlement (CE) 1829/2003, Règlement (CE) 1830/2003) en mesurant la quantité de chaque lignée d OGM présente dans chaque ingrédient (Figure 1). Les règlements susmentionnés disposent que tous les produits contenant des OGM, consistant en de tels organismes ou produits à partir d OGM doivent être marqués en conséquence. L étiquetage n est pas requis pour les produits à base de matières contenant des OGM, consistant en OGM ou produits à partir d OGM dans une proportion ne dépassant pas 0,9 % des ingrédients alimentaires pris individuellement, à condition qu une telle présence soit fortuite ou techniquement inévitable. Tous les ingrédients (farine, huile, etc.) dérivés d une espèce unique (par ex. maïs, soja, colza, etc.) sont considérés collectivement en tant qu ingrédient unique (par ex. maïs). Soja non GM 99,4% Soja GM 0,6% Maïs GM 0,6% Maïs non GM 99,4% Figure 1. Aucun marquage requis. La quantité de soja GM et de maïs GM est inférieure au seuil autorisé. Par exemple, si un ingrédient dérivé exclusivement du maïs contient moins de 0,9 % de maïs GM, aucun étiquetage n est nécessaire pour les aliments dérivés de ce dernier. En revanche, s il contient plus de 0,9 % de maïs GM, les produits alimentaires dérivés doivent être étiquetés en conséquence. Cela vaut également si, en tenant compte de l ensemble des ingrédients dérivés de variétés différentes (par ex. soja et maïs), la quantité relative de maïs GM tombe en dessous de 0,9 % dans

4 PCR quantitative pour la détection d OGM 4 le produit final. Si au moins deux variétés de maïs GM sont présentes, leurs concentrations respectives doivent être ajoutées et le pourcentage total utilisé pour déterminer l exigence pour l étiquetage (Figure 2). Si le résultat est inférieur à 0,9 %, aucun étiquetage n est requis. Soja non GM 100% Maïs Bt 11 0,6% Maïs Bt 176 0,6% Maïs non GM 98,8% Figure 2. Etiquetage requis pour l ingrédient maïs. Les sommes des lignées Bt-11 (0,6 %) et Bt-176 (0,6 %) dépassent le seuil de 0,9 % requis pour l étiquetage. La teneur relative en OGM (sous forme de pourcentage) est déterminée en divisant le nombre de copies de séquences spécifiques de l OGM par le nombre de copies de gènes spécifiques d une plante (par ex. lectine pour le soja et invertase ou zéine pour le maïs). Le pourcentage d OGM qui en résulte s exprime par conséquent sous la forme suivante : OGM (%) = ADN GM/ADN référence x 100. Méthodes de quantification PCR Un des inconvénients majeurs de la PCR classique réside dans le manque d informations quantitatives précises en raison de l efficacité de l amplification. Si l efficacité de la réaction pour chaque cycle d amplification demeure constante, la concentration d ADN après la PCR serait directement proportionnelle à la quantité d ADN cible initiale. Malheureusement, l efficacité de l amplification varie en fonction des diverses réactions, ainsi que dans les cycles consécutifs au cours d une seule et même réaction. En particulier, lors des derniers cycles de la PCR, les résultats de l amplification sont générés de manière non exponentielle à un rythme de réaction inconnu.

5 PCR quantitative pour la détection d OGM 5 La quantification d ADN basée sur une PCR classique repose sur des mesures de valeurs limites pour obtenir une sensibilité optimale, lorsque l amplification atteint le rendement maximum (appelé «phase stationnaire»). A ce stade, la réaction a dépassé la phase exponentielle, notamment en raison de la diminution des réactifs et de l inactivation thermique progressive de la polymérase utilisée. La corrélation résultante entre la concentration de produit finale et le nombre de molécules cibles initiales est ainsi limitée. Afin de surmonter ce problème, des techniques telles que la PCR quantitative compétitive et la PCR en temps réel ont été mises au point pour résoudre les problèmes liés à l établissement d un rapport entre la concentration d ADN cible et la quantité de produit PCR résultant de l amplification. PCR quantitative compétitive L une des premières méthodes PCR quantitatives mises au point est celle de la PCR quantitative compétitive (Giacca et al., 1994 ; Studer et al., 1998 ; Hardegger et al., 1999). Cette méthode est basée sur la co-amplification de la matrice d ADN cible et de quantités données d un ADN standard interne (compétiteur) portant les mêmes sites de fixation d amorces. Etant donné que la quantité initiale du compétiteur est connue et que les niveaux d amplification de la cible et de l ADN compétiteur sont les mêmes, la quantité des deux produits PCR, déterminée par ex. par électrophorèse sur gel, est représentative du taux d ADN cible et de compétiteur présents dans l échantillon de réaction avant l amplification. En règle générale, un compétiteur est un plasmide linéarisé porteur de la même séquence de nucléotides que l ADN cible, à l exception d une suppression ou d une insertion afin d obtenir, après co-amplification, deux bandes de tailles distinctes après électrophorèse sur gel standard. ADN amplifié de la cible ADN amplifié du compétiteur Figure 3. Co-amplification d une quantité fixe d ADN cible avec différentes quantités d ADN compétiteur.

6 PCR quantitative pour la détection d OGM 6 La PCR compétitive a été mise en œuvre avec succès pour quantifier à la fois l ADN et l ARN, mais sa plage dynamique est limitée à un taux cible/compétiteur situé approximativement entre 1:10 et 10:1. En fait, pour obtenir une précision optimale, il convient de trouver le point d équivalence auquel le taux cible/compétiteur est de 1:1 (Figure 3). A cet effet, plusieurs dilutions doivent être testées pour obtenir un taux cible/compétiteur approprié. Un autre inconvénient de cette approche réside dans la nécessité de construire et de caractériser un compétiteur différent pour chaque cible à quantifier. En fait, la moindre différence au niveau de l efficacité de l amplification compromettra sérieusement la précision d une quantification par PCR quantitative compétitive. Enfin, à la fin de la réaction, la PCR compétitive nécessite une quantification précise des amplicons de la cible et du compétiteur, ce qui implique généralement des étapes de traitement post-pcr laborieuses. La PCR compétitive est une méthode semi-quantitative qui implique une comparaison entre un standard (le compétiteur) et l échantillon. Les résultats ne peuvent indiquer qu une valeur inférieure, égale ou supérieure à une concentration standard donnée. Le système de PCR compétitive comporte toutefois l avantage suivant : les laboratoires n ont pas besoin d acquérir un équipement spécialisé, étant donné qu on utilise généralement du matériel de laboratoire standard pour les processus PCR et de biologie moléculaire. PCR en temps réel Il existe une technique de PCR quantitative plus précise et plus répandue : la PCR en temps réel. Contrairement aux mesures de valeurs limites, les systèmes de PCR en temps réel contrôlent la réaction en temps réel, au fur et à mesure qu elle se déroule. Avec ce type de système, la PCR est couplée à l émission d un signal fluorescent proportionnel à la quantité de produit PCR généré au cours de cycles consécutifs. Ce signal augmente proportionnellement à la quantité de produit PCR généré au cours de chaque cycle de réaction successif. L enregistrement de la quantité d émission fluorescente lors de chaque cycle permet de contrôler la PCR durant sa phase exponentielle. La première augmentation de fluorescence majeure correspond à la quantité initiale de matrice cible. (Ahmed, 2002)

7 PCR quantitative pour la détection d OGM 7 Historique des techniques PCR en temps réel Higuchi et al. (1992, 1993) ont été les premiers à analyser la cinétique de la PCR en mettant au point un système capable de détecter les produits PCR au fur et à mesure de leur accumulation. Ce système «en temps réel» comprenait l intercalant bromure d éthidium dans chaque mélange réactionnel. Les opérations étaient effectuées à l aide d un thermocycleur approprié permettant d irradier les échantillons de lumière UV et de détecter la fluorescence résultante à l aide d une caméra CCD refroidie (caméra à dispositif de transfert de charge) assistée par ordinateur. Lors du processus d amplification, des quantités croissantes d ADN double brin généré et intercalé en présence de bromure d éthidium entraînaient un accroissement de la fluorescence. En restituant graphiquement le rapport entre l émission de lumière fluorescente et le nombre de cycles, le système générait des graphiques d amplification donnant un tableau plus complet du processus de la PCR qu une analyse de l accumulation du produit après un nombre de cycles fixe. Principes de la PCR en temps réel La spécificité d une méthode de PCR en temps réel dépend à la fois des principes chimiques utilisés pour générer et contrôler la réaction d amplification et l équipement utilisé pour contrôler le signal. Divers principes chimiques ont été mis au point à cet effet : intercalants (bromure d éthidium, SYBR Green I) et sondes d hybridation (sondes TaqMan, sondes de transfert d énergie entre molécules fluorescentes, balises moléculaires, sondes Scorpion et sondes TaqMan MGB). PCR en temps réel à base de colorant SYBR Green I La première application de la PCR en temps réel est directement dérivée des expériences de Higuchi et al. (1992, 1993), consistant à remplacer le bromure d éthidium par un agent intercalant d ADN double brin fluorescent moins toxique, plus spécifique et plus sensible (de 10 à 25 fois), le SYBR Green I (Haugland, 2002). Le colorant SYBR Green I se lie au petit sillon de l ADN double brin, mais pas à l ADN simple brin. Suite à cette liaison, la fluorescence (excitation env. 488 nm et 254 nm ; émission env. 560 nm) augmente considérablement (de 800 à 1000 fois env.). Au début de la PCR, la quantité croissante d ADN nouvellement synthétisé génère un signal fluorescent croissant (Figure 4). Une limitation du système de détection de séquence à base de SYBR Green I est représentée par son mode de reconnaissance d ADN non spécifique. En fait, chaque molécule d ADN double brin

8 PCR quantitative pour la détection d OGM 8 présente dans une PCR est quantifiée, y compris donc les produits PCR non spécifiques et les dimères d amorce. Afin de surmonter le problème et de soustraire l élément de quantification dû aux ADN non spécifiques et aux dimères d amorce sur certains dispositifs, il est possible d effectuer une analyse de la courbe de fusion. Après l étape finale de la PCR, les produits sont dissociés lentement et les données relatives à la fluorescence sont recueillies. Étant donné que chaque ADN double brin possède une température de fusion spécifique, il est possible de quantifier les éléments ayant différentes températures de fusion dans un seul et même mélange réactionnel, et par conséquent d éliminer les éléments non spécifiques de la quantification. Méthodes de PCR en temps réel basées sur des sondes spécifiques de la séquence Le problème de la spécificité de détection par fluorescence des amplicons a été résolu par l utilisation de sondes spécifiques des séquences avec un marquage fluorescent conçu à l intérieur de la paire d amorces PCR. Le processus d hybridation des sondes (et leur dégradation finale) n interfère généralement pas avec l accumulation exponentielle du produit de la PCR. Plusieurs principes différents sont maintenant utilisés pour réaliser des réactions de quantification basées sur une PCR en temps réel spécifique. Sondes de transfert d énergie entre molécules fluorescentes Le transfert d énergie entre molécules fluorescentes (FRET) est basé sur le transfert d énergie d un fluorophore donneur à un fluorophore accepteur (Figure 4) (Haugland, 2002). Les conditions de base pour le FRET sont les suivantes : Les molécules donneuses et accepteuses doivent être proches l une de l autre (généralement 10 à 100 Å). Le spectre d absorption de l accepteur doit chevaucher le spectre d émission de fluorescence du donneur. Les orientations des dipôles de transition du donneur et de l accepteur doivent être à peu près parallèles. Si le fluorophore donneur et le fluorophore accepteur sont proches l un de l autre, l excitation du donneur avec de la lumière bleue génère un transfert d énergie vers l accepteur, qui peut alors émettre une longueur d onde lumineuse plus importante. La formation de produits PCR peut être contrôlée en utilisant deux sondes

9 PCR quantitative pour la détection d OGM 9 oligonucléotidiques spécifiques de la séquence avec un marquage fluorescent, appelées sondes d hybridation, en plus des amorces PCR. Les sondes d hybridation sont conçues en tant que paire, l une des sondes étant marquée avec le donneur (3 - fluorescéine) et l autre avec l accepteur (5 -Red 640 ou 5 -Red 705). Étant donné que le FRET est proportionnel à l inverse de la puissance 6 de la distance, les sondes d hybridation doivent être conçues de manière à s hybrider avec les régions adjacentes de l ADN matrice (elles sont généralement séparées par un intervalle de 1 à 5 nucléotides). Si les deux sondes s hybrident, les deux colorants sont rapprochés et le FRET vers le colorant de l accepteur se traduit par un signal mesurable par fluorimétrie. Sondes de dégradation (principe TaqMan) L essai TaqMan exploite l activité exonucléase 5-3 de l ADN polymérase Taq pour cliver une sonde de dégradation durant la PCR (Lie et Petropoulos, 1998). La sonde de dégradation (ou TaqMan) est généralement un oligonucléotide d une longueur de bases (habituellement avec une température de fusion de 10 C plus élevée que celle des amorces) contenant un colorant fluorescent rapporteur à l extrémité 5 et un colorant d extinction de fluorescence à l extrémité 3 (Figure 4). Étant donné que l extrémité 3 est bloquée, la sonde ne peut être prolongée comme une amorce. Durant la PCR, en présence d une cible, la sonde s hybride spécifiquement entre les sites d hybridation des deux amorces. Lorsque la sonde est intacte, la proximité du colorant rapporteur par rapport au colorant d extinction de fluorescence entraîne la suppression de la fluorescence du rapporteur essentiellement par transfert d énergie de type Forster (Forster, 1948 ; Lakowicz, 1983). Pendant la réaction, l activité exonucléase 5-3 de l ADN polymérase Taq dégrade la sonde entre le colorant rapporteur et le colorant d extinction de fluorescence seulement si la sonde s hybride avec la cible. Cela entraîne un accroissement de la fluorescence au fur et à mesure de l amplification. L accumulation de produit PCR est détectée en contrôlant l augmentation de fluorescence du colorant rapporteur. Ce processus survient durant chaque cycle et n interfère pas avec l accumulation exponentielle de produit. Contrairement aux sondes FRET, les sondes de dégradation libèrent des fluorochromes à chaque cycle, ajoutant un nouveau colorant au colorant libéré précédemment. Par conséquent, le signal fluorescent augmente considérablement à chaque cycle. Dans l essai TaqMan, on utilise des paramètres de cycles thermiques et des conditions de réaction PCR universels. Une exigence spécifique applicable aux sondes fluorogéniques est qu il ne peut y avoir de G à l extrémité 5. Un «G»

10 PCR quantitative pour la détection d OGM 10 adjacent au colorant rapporteur éteint la fluorescence du rapporteur, même après division. Figure 4. Différents principes de PCR en temps réel. I. Vert SYBR I. II. Sondes de transfert d énergie de résonance par fluorescence. III. Sondes de dégradation TaqMan 5`-3`. Balises moléculaires Les balises moléculaires sont des sondes d ADN conçues pour contenir une structure en forme d épingle à cheveux. La séquence de la boucle est complémentaire de la cible spécifique de la sonde et les séquences des bras sont conçues de manière à être complémentaires l une de l autre (Figure 5) (Tyagi et Kramer, 1996). Les extrémités 5 et 3 de la sonde sont liées de façon covalente à un fluorophore et à un extincteur. Lorsque la structure en épingle à cheveux est fermée, le fluorophore et l extincteur sont rapprochés. Dans ce cas, tous les photons émis par le fluorophore sont absorbés par l extincteur. En présence d une séquence complémentaire, la sonde se déploie et s hybride avec la cible. Le fluorophore est déplacé par l extincteur et la sonde commence à fluorescer.

11 PCR quantitative pour la détection d OGM 11 Figure 5. Principe des balises moléculaires. Scorpions La famille des sondes appelées «Scorpions» constitue une évolution supplémentaire. Une sonde Scorpion comprend une séquence de sonde spécifique avec une structure en épingle à cheveux (Figure 6) (Thelwell et al., 2000). Un fluorophore fixé à l extrémité 5 émet un signal fluorescent qui est désactivé dans la configuration en épingle à cheveux par une fraction attachée à l extrémité 3. L épingle à cheveux est liée à l extrémité 5 d une amorce. Après l élongation de l amorce Scorpion, durant l amplification, la séquence de sonde spécifique est capable de se lier à son complément dans le même brin d ADN. Cette hybridation ouvre la boucle en épingle à cheveux, de telle sorte que la fluorescence n est plus désactivée et un accroissement du signal est observé. Un stoppeur PCR entre l amorce et la séquence des bras évite la translecture de la boucle en épingle à cheveux, ce qui pourrait entraîner l ouverture de celle-ci en l absence de la séquence cible spécifique. La nature monomoléculaire de l hybridation comporte des avantages par rapport aux systèmes de sondes homogènes. Contrairement aux balises moléculaires, aux essais TaqMan ou FRET, les essais Scorpion ne nécessitent pas de sonde séparée en plus des amorces.

12 PCR quantitative pour la détection d OGM 12 Figure 6. Principe des sondes Scorpion. Sondes MGB TaqMan Une sonde MGB (Minor Groove Binder) est une petite molécule en forme de croissant qui s insère parfaitement dans le petit sillon de l ADN double brin (Kutyavin et al., 2000). Dans les sondes TaqMan, le groupe MGB est attaché à l extrémité 3 avec le colorant d extinction de fluorescence (Figure 7). Lorsque la sonde TaqMan s hybride, le MGB stabilise l hybridation en se déployant dans le petit sillon de l ADN double brin créé entre la sonde et la séquence cible. La stabilisation est beaucoup plus efficace lorsque les doubles brins sont parfaitement appariés (c est-à-dire lorsqu il n y a pas de mésappariement de séquence). Outre le pouvoir discriminant accru, la plus grande stabilité signifie que les sondes TaqMan MGB sont très courtes (généralement 13 à 20 mer) par rapport aux sondes TaqMan standard (généralement 18 à 40 mer), tout en satisfaisant aux exigences de conception. Les sondes TaqMan MGB présentent plusieurs avantages en ce qui concerne la PCR quantitative, notamment pour les essais multiplex. La performance spectrale améliorée permet une précision et une cohérence accrues entre les essais individuels et la spécificité d hybridation accrue assure une plus grande discrimination des cibles. Par ailleurs, la

13 PCR quantitative pour la détection d OGM 13 sonde plus petite peut faciliter la conception des essais en offrant plus de possibilités dans des régions cibles plus courtes, telles que les «fenêtres» de consensus de conservation ou de divergence de séquence. La taille des amplicons peut être réduite au maximum en utilisant des sondes MGB plus courtes pouvant améliorer davantage la cohérence inter-essais. Figure 7. Principe des sondes MGB. Principes de quantification par PCR en temps réel Quantification relative La teneur en OGM d un échantillon peut être exprimée comme étant la quantité de matière génétiquement modifiée dans la quantité de matière totale. Pour déterminer cette valeur dans un système PCR en temps réel, il faut évaluer le nombre de séquences d ADN d un gène de référence endogène (en vue d une utilisation en tant que «normalisateur») ainsi que le nombre de séquences d ADN cible spécifique de l OGM. Le gène de référence doit être sélectionné de manière à ce qu il soit spécifique de l espèce, présent en copie unique par génome haploïde, stable au sein de différentes lignées de la même espèce et ayant les mêmes propriétés d amplification que les OGM analysés (bien que cela soit plutôt dû à une bonne conception des sondes d amorces). Un problème dans la quantification relative résulte de l interprétation du pourcentage de teneur en OGM non stipulé par la

14 PCR quantitative pour la détection d OGM 14 législation ; par conséquent, la teneur en OGM (en pourcentage) peut être considérée comme étant le poids de l ingrédient modifié divisé par rapport au poids total de l ingrédient pur (par ex. poids du maïs GM divisé par le poids total de l ensemble du maïs contenu dans l échantillon). Du point de vue analytique, il convient de calculer le pourcentage d OGM en termes de nombre de copies d ADN cible par rapport au nombre de copies spécifiques de taxon cible, mais cette définition ne tient pas compte de certaines caractéristiques importantes des lignées d OGM ; par conséquent, les paramètres suivants doivent être soigneusement pris en compte lors de l interprétation des résultats : a. la ploïdie de la lignée. Il est possible que la ploïdie de la lignée GM soit différente de celle de la lignée wt (par ex. tétraploïde au lieu de diploïde) ; b. la zygotie de la lignée. La caractéristique GM pourrait être homozygote ou hétérozygote ; c. le nombre d insertions par génome haploïde d une construction génique artificielle unique. Une construction pourrait être insérée en une seule copie par génome haploïde ou en plusieurs copies. Le point c. peut être contourné en concevant le système de sonde-amorce à la limite de l insertion de la construction dans le génome. Étant donné que les séquences flanquantes sont uniques, cela confère au système le double avantage d être spécifique à la lignée et d exclure de la quantification les insertions multiples de la même construction. On contourne les points a. et b. empiriquement en utilisant des matériaux de référence homogènes avec l échantillon (par ex. matériaux de référence sous forme de farine de maïs pour quantifier la farine de maïs). Alternativement, des étalons de référence différents des matériaux de référence certifiés (par ex. séquences d ADN clonées ou mélanges d ADN génomiques) peuvent être calibrés par rapport à ces matériaux de référence certifiés afin de corriger les divergences moléculaires dans la quantification. Une solution courante aux problèmes liés aux points a. et b. consiste à exprimer le pourcentage d OGM en termes de génomes haploïdes. Dans tous les cas, cet aspect de la quantification doit être pris en compte lors de la mise au point d une méthode, étant donné que la limite de détection et la limite de quantification sont influencées par le nombre effectif de copies à quantifier.

15 PCR quantitative pour la détection d OGM 15 Conception d une expérience de quantification d OGM en temps réel La conception d une analyse PCR en temps réel doit inclure les éléments suivants : - Un système PCR capable de détecter une séquence d ADN cible spécifique de l OGM. - Un second système PCR capable de détecter une séquence de référence endogène, préférentiellement spécifique de l espèce, mais pouvant être utilisée en tant que «normalisateur» dans les calculs des concentrations relatives d OGM. - Les courbes d étalonnage pour la cible et la référence endogène. Pour chaque échantillon expérimental, la quantité de cible et de référence endogène est déterminée à partir de la courbe d étalonnage correspondante. La quantité de cible est normalisée avec la quantité de référence endogène pour obtenir la concentration relative de la cible. Pour qu elles répondent aux exigences statistiques, les courbes d étalonnages doivent comprendre au moins 4 points de concentration différents. Chaque point de la courbe d étalonnage, ainsi que l échantillon, doivent être chargés au moins en trois exemplaires. En outre, un contrôle négatif (NTC contrôle sans matrice) doit être ajouté tant pour la quantification du gène de référence et que pour celle des OGM. D autres contrôles peuvent être utilisés (par ex. contrôle ADN cible négatif, contrôle ADN cible positif). Enfin, la quantification du gène de référence et la quantification de la séquence spécifique de l OGM doivent être effectuées au cours de la même opération PCR (co-amplification) et non en plusieurs opérations, afin d éviter toute fluctuation statistique entre différentes expériences. PCR multiplexe en temps réel En fonction des propriétés chimiques et de l appareillage utilisé pour la quantification, il est possible de concevoir des PCR en temps réel pour effectuer la quantification des séquences de référence et d OGM séparément dans des tubes distincts ou dans les mêmes tubes en tant que réaction «multiplexée». Les deux options présentent à la fois des avantages et des inconvénients : les réactions multiplexées permettent d économiser du temps et des réactifs (il est possible d analyser le double d échantillons en une seule et même expérience), d éviter les erreurs de configuration entre la mesure de la référence et du gène cible de l OGM, étant donné qu elles ont lieu dans le même tube, mais elles sont moins sensibles (en termes de limite de quantification) en raison de l interférence entre les deux réactions et des différences de consommations de réactifs entre les deux

16 PCR quantitative pour la détection d OGM 16 réactions. D un autre côté, des réactions séparées pour mesurer le gène de référence et le gène cible de l OGM sont plus sensibles en termes de limite de quantification, mais nécessitent deux fois la quantité de réactifs et de tubes réactionnels sur l appareillage de PCR en temps réel et sont plus exposées par ex. aux risques d erreur de pipetage lors de la mesure d un échantillon. La disponibilité de colorants rapporteurs multiples pour les sondes TaqMan permet de détecter l amplification de plusieurs cibles dans le même tube. Le colorant rapporteur (FAM) se distingue de l autre (VIC) car ils ont des longueurs d onde d émission maximale différentes. Par exemple, la disponibilité de colorants multiples ayant des longueurs d onde d émission distinctes (FAM, TET, VIC et JOE) permet d effectuer des essais TaqMan multiplex. Le colorant TAMRA est utilisé comme extincteur sur la sonde et le colorant ROX comme référence passive dans le mélange réactionnel. Pour obtenir les meilleurs résultats, la combinaison FAM (cible) et VIC (contrôle endogène) est recommandée, étant donné qu ils présentent la plus grande différence en termes d émission maximale. D un autre côté, il convient de ne pas combiner JOE et VIC. Les essais TaqMan multiplex peuvent être effectués sur les systèmes de détection de séquence ABI PRISM 7700, 7900, 7500, 7300 et 7000 en raison de leur capacité à détecter des colorants multiples ayant des longueurs d ondes d émission distinctes. Analyse graphique des données de la PCR en temps réel Au cours d une PCR en temps réel, les données de fluorescence (valeurs Rn) recueillies permettent de tracer un graphique représentant la quantité de signal par rapport au nombre de cycles (ou au temps). En général, le graphique est tracé sur une échelle semi-logarithmique. Dans la PCR en temps réel, on peut distinguer trois phases différentes : une première phase de «retard» avec de légères fluctuations des courbes correspondant au signal de fond ; une seconde phase exponentielle avec des courbes parallèles croissantes, et une troisième phase où les courbes ont tendance à atteindre un palier (Figure 8).

17 PCR quantitative pour la détection d OGM 17 Figure 8. Graphique de PCR en temps réel. Les phases typiques de PCR en temps réel sont mises en relief. La force de la PCR en temps réel réside dans le fait que la quantification survient non pas à la phase terminale de la PCR (palier), mais à l étape où la croissance exponentielle de la quantité d ADN amplifié (valeur Rn) atteint un point significativement plus élevé que le signal résiduel. Cette technique de mesure augmente considérablement la précision de la quantification, étant donné qu il y a une corrélation directe entre la quantité de matrice initiale et la phase durant laquelle l amplification commence à devenir exponentielle. Dans la PCR en temps réel, un cycle seuil (C T ) est défini à titre expérimental comme le cycle auquel le signal de fluorescence atteint la moyenne des signaux de fluorescence mesurés entre le troisième et le quinzième cycle plus dix écarts types. Plus la quantité initiale d ADN génomique est élevée, plus le produit accumulé est détecté rapidement dans le processus PCR, et plus la valeur C T est basse. En pratique, le choix de la ligne de seuil dans la détermination de la valeur C T incombe souvent à l opérateur, représentant l un des éléments subjectifs de la PCR en temps réel. La ligne de seuil doit être placée au-dessus de toute activité de base et dans la phase d augmentation exponentielle, qui paraît linéaire dans la transformation logarithmique (toutes les courbes sont parallèles). Dans tous les cas, la ligne de seuil doit être placée au niveau auquel les courbes des répliquâts commencent à coïncider le plus. En fait, il arrive parfois que les répliquâts présentent, dans la toute première partie de la phase exponentielle, une légère divergence qui diminue ou disparaît totalement alors que la réaction se poursuit.

18 PCR quantitative pour la détection d OGM 18 Calcul de la teneur en OGM Le rendement de la PCR en temps réel est une valeur Rn, qui correspond à la différence entre Rn + (le signal de fluorescence comprenant l ensemble des éléments) et Rn - (le signal de fond de la réaction référence ou lecture d un échantillon NTC). La teneur en OGM d un échantillon peut être déterminée de deux manières différentes : 1. Tracé de deux courbes standard sur la base de différentes quantités d ADN : - la première courbe avec un système de quantification spécifique du gène de référence ; - la seconde courbe avec un système de quantification spécifique de la cible GM. Pour chaque échantillon, les quantités de cible spécifique et de gène de référence sont déterminées par interpolation avec la courbe standard. La teneur en ADN des OGM (sous forme de pourcentage) est ensuite calculée comme étant le rapport entre la quantité de séquence cible GM et la quantité de séquence du gène de référence (GM/référence * 100). Il convient de noter que les échantillons analysés doivent forcément se situer entre les limites supérieure et inférieure des deux courbes standard. Les valeurs aberrantes doivent être exclues, étant donné qu elles sont sujettes à des erreurs de quantification. 2. La méthode C T comparative ( C T ) : cette méthode n utilise pas une quantité connue de standards mais compare la quantité relative de la séquence cible d OGM à la séquence du gène de référence. La courbe standard est obtenue en chargeant une série d échantillons à différentes concentrations connues d OGM (par ex. matériaux de référence certifiés de l IRMM). Le résultat est une courbe standard de valeurs C T ( C T = C T gène de référence - C T OGM ). La valeur de la teneur en OGM est obtenue en calculant la valeur C T de l échantillon et en la comparant aux valeurs obtenues avec les standards. Pour que cette méthode soit fructueuse, les efficacités d amplification des systèmes PCR cible et de référence doivent être semblables. À cet effet, une méthode sensible de contrôle consiste à examiner la manière dont C T (la différence entre les deux valeurs C T de deux PCR pour la même quantité de matrice initiale) varie en fonction de la dilution de la matrice. Si les efficacités des deux amplicons sont approximativement équivalentes, la représentation graphique logarithmique de la quantité d entrée par rapport à C T serait une ligne presque horizontale (pente <0,10). Cela signifie que les deux PCR ont la même efficacité dans la plage de quantités de matrice initiales. Si le graphique montre une efficacité inégale, la méthode de la courbe standard doit être utilisée pour la quantification des OGM. La

19 PCR quantitative pour la détection d OGM 19 plage dynamique doit être déterminée à la fois pour (1) les concentrations minimale et maximale des cibles pour lesquelles les résultats sont exacts et (2) les rapports minimum et maximum de deux quantités de gènes pour lesquelles les résultats sont exacts. Dans la PCR en temps réel compétitive classique, la plage dynamique est limitée à un rapport cible/compétiteur d environ 10:1 à 1:10 (la précision optimale est obtenue pour un rapport de 1:1). La PCR en temps réel est capable de générer une plage dynamique beaucoup plus importante.

20 PCR quantitative pour la détection d OGM 20 Références Règlement (CE) n 1829/2003 du Parlement Européen et du Conseil du 22 septembre 2003 concernant les denrées alimentaires et les aliments pour animaux génétiquement modifiés. JO L 268, , pp Règlement (CE) n 1830/2003 du Parlement Européen et du Conseil du 22 septembre 2003 concernant la traçabilité et l étiquetage des organismes génétiquement modifiés et la traçabilité des produits destinés à l alimentation humaine ou animale produits à partir d organismes génétiquement modifiés, et modifiant la Directive 2001/18/CE. JO L 268, , pp Ahmed, F.E. (2002). Detection of genetically modified organisms in foods. Trends in Biotechnology 5, Forster, T. (1948). Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann Phys (Leipzig) 2, Giacca, M., Zentilin, L., Norio, P., Diviacco, S., Dimitrova, D., Contreas, G., Biamonti, G., Perini, G., Weighardt, F., Riva, S. and Falaschi, A. (1994). Fine mapping of a replication origin of human DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA 91, Hardegger, M., Brodmann, P. and Hermann, A. (1999). Quantitative detection of the 35S promoter and the nos terminator using quantitative competitive PCR. European Food Research Technology 209, Haugland, R.P. (2002). The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition. Molecular Probes, Inc. Handbook.html (Dernière connection Janvier 2010). Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S. and Griffith, R. (1992). Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Biotechnology 10,

21 PCR quantitative pour la détection d OGM 21 Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. and Watson, R. (1993). Kinetic PCR: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11, Kutyavin, I.V., Afonina, I.A., Mills, A., Gorn, V.V., Lukhtanov, E.A., Belousov, E.S., Singer, M.J., Walburger, D.K., Lokhov, S.G., Gall, A.A., Dempcy, R., Reed, M.W., Meyer, R.B. and Hedgpeth, J. (2000). 3'-minor groove binder-dna probes increase sequence specificity at PCR extension temperatures. Nucleic Acids Research 28, Lakowicz, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York, chapter 2. Lie, Y. S. and Petropoulos, C. J. (1998). Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion Biotechnol 9, Studer, E., Rhyner, C., Lüthy, J. and Hübner, P. (1998). Quantitative competitive PCR for the detection of genetically modified soybean and maize. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A 207, Thelwell, N., Millington, S., Solinas, A., Booth, J. Zeitschrift für Lebensmittel- Untersuchung und -Forschung A and Brown, T. (2000). Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Research 28, Tyagi, S. and Kramer, F.R. (1996). Molecular Beacons: Probes that fluoresce upon hybridisation. Nature Biotechnology 14, Vaïtilingom, M., Pijnenburg, H., Gendre, F. and Brignon, P. (1999). Real-time quantitative PCR detection of genetically modified Maximizer maize and Roundup Ready soybean in some representative foods. Journal of Agricultural Food Chemistry 47,