TP de Biochimie Groupe 4 Forestier Michèle Fournier Coralie Freyre Christophe Manipulation d ADN

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1 MANIPULATION D ADN Clonage du gène «venus» dans des plasmides et expression de celui-ci chez les bactéries E.Coli. Assistants: U. Loizides M. Umebayashi C. Gehin - 1 -

2 1. Résumé Lors de notre expérience, nous avons procédé au clonage d un gène nommé «venus», variante de la protéine GFP, que nous avons inséré dans un vecteur afin de pouvoir l exprimer dans la bactérie E.coli. Nous avons tout d abord amplifié le gêne par PCR, puis nous l avons fait digérer par des enzymes de restriction et nous l avons inséré dans un plasmide. Finalement, les vecteurs contenant le gêne d intérêt ont été incorporés par transformation dans les bactéries. Nous avons mis ces dernières en culture dans un milieu riche en ampicilline afin de repérer les bactéries transformées. Pour déterminer si le clonage a été réussi, nous avons procédé à des analyses UV ainsi qu à une électrophorèse. [1] 2. Introduction La protéine fluorescente verte, plus connue sous le nom de «GFP» fût découverte pour la première fois dans les années 1960, c est vers 1992 qu on lui trouva un intérêt biologique particulier, en effet, cette protéine provenant d une méduse (Aequorea victoria) à la particularité d émettre de la lumière verte sous UV. Cela s explique par le fait que la GFP possède un groupement chimique capable d absorber et d émettre de la lumière en retour. Ainsi cette protéine devint un marqueur dès plus efficace, l idée étant d attacher la séquence codante de la GFP au gène d une autre protéine afin de pouvoir visualiser cette dernière sous UV. Depuis, la science a développé d autres variantes de la GFP, capable d émettre du rouge, du bleu et du jaune. [2] Dans notre cas, la protéine «venus», que nous avons étudié dans notre expérience, est une variante de la GFP qui fluoresce en jaune. Pour pouvoir travailler sur notre gêne «venus», nous avons d abord réalisé une PCR, méthode révolutionnaire qui est une amplification de réaction en chaîne par polymérase. Elle fut découverte dans les années 90, et se développa assez rapidement dans tous les laboratoires. La PCR consiste à amplifier un segment d ADN connu en lui mettant des amorces spécifiques, la polymérase TAQ thermorésistante, provenant d une méduse, synthétise le brin complémentaire. Après plusieurs cycles de dénaturations et de synthèses consécutifs, le segment de base est cloné de manière exponentielle en plusieurs exemplaires. [3] Comme nous allons vous le démontrer dans les chapitres suivants, après amplification de notre gêne par PCR, nous avons eu recours au clonage, en procédant à l insertion de ce dernier dans un plasmide afin de pouvoir le copier et l exprimer dans les bactéries E.Coli. Le but de ce clonage étant de posséder notre gêne dans un vecteur bactérien facilement disponible et facilement amplifiable par une mise en culture. 3. Résultats 3.1 Electrophorèse : Gel produit PCR Une quantité de l échantillon d ADN résultant de la PCR est placé sur un gel d agarose. Un courant est appliqué sur ce gel, cela permettra de déterminer le poids de l ADN présent dans l échantillon. L ADN est chargé négativement et suivant sa taille, il migrera plus ou moins vite en direction de l anode (chargée positivement). Afin d observer l ADN, du bromure d éthidium est présent dans le gel. Il a pour propriété de se lier aux parties hydrophobes de l ADN et d être fluorescent en présence de lumière UV. [ 1] - 2 -

3 Image N 1 : ADN sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium On peut d après cette image et la référence indiquant la taille moléculaire, estimer la taille de l échantillon d ADN à environs 0.7 KiloBase (700 paires de bases). 3.2 Electrophorèse : Gel digestion Deux réactions de digestions sont effectuées, un pour le plasmide et un pour l insert. Après purification, deux échantillons sont préparés avec du tampon 5xADN et de l eau, puis soit le plasmide, soit l insert. Ces deux échantillons sont chargé sur un gel d agarose, suivant la même méthode que ci-dessus. Cela permettra de déterminer la concentration de plasmide et d insert

4 Image N 2 : Insert et plasmide sur gel d agarose L échantillon contenant les plasmides à été contaminé avec de l eau, certainement que le tube était mal fermé au moment de l incubation dans le bain à 37 C. Par conséquent notre échantillon est beaucoup trop dilué, comme nous pouvons le voir en comparaison aux autres échantillons sur l image N 2. Pour la suite de l expérience, une solution de plasmide fournie par les assistants sera utilisée. L observation de l échantillon de plasmide nous permet tout de fois d estimer la taille de la molécule qui serait d environ 5 KiloBase. Nous observons pour l échantillon d insert une intensité équivalente à 125 ng, étant donné que pour la préparation de l échantillon nous avons utilisé 5 µl d insert. Nous avons une concentration estimée de 25 ng/µl. 3.3 Ligation Nous voulons avoir dans notre tube où la ligation entre plasmides et inserts s effectue 3 fois plus d inserts que de plasmides. Par conséquent nous devons calculer quelle masse d inserts est nécessaire. ng plasmide Kb insert ng insert = ( ) Ratio molaire Kb plasmide insert plasmide ( ) 3 = 21 ng 5 21 ng d insert sont nécessaires, puisque 50 ng de plasmide seront utilisés. Les concentrations exactes des échantillons de plasmides et d insert ont été fournies par les assistants. Insert : 74 ng/µl - 4 -

5 Plasmides : 47 ng/µl Afin d être plus précis, nous effectuons une dilution de 1 : 10 pour l échantillon d insert et de 1 : 2 pour l échantillon de plasmide. Calcul de la quantité à prendre après dilution : Insert : 21 ng = 2.8 µl 7.4 ng Plasmide : 50 ng = 2.2 µl 23.5 ng Deux échantillons de contrôle contenant uniquement les plasmides, le tampon, la ligase et l eau sont préparés. Puis deux échantillons identiques, mais contenant aussi les inserts sont préparés. Par la suite, les bactéries préalablement préparées sont insérées dans ces échantillons et après incubations, les colonies sont déposées sur des boîtes de pétries. Image N 3 : Boites de pétries 3.4 Echantillon de clones 6 échantillons sont préparés. Pour se faire, 5 colonies sont piquées dans les boîtes contenant l insert et une dans la boîte de contrôle. Ces colonies sont suspendues dans l eau et une PCR est effectuée pour les dupliquer. Les 6 colonies sont placées sur une boîte de pétrie afin d observer lesquelles contiennent le gène cible

6 Image N 4 : Boites de pétries, les 6 colonies Nous remarquons que seul l échantillon 2 contient le gène venus. C est en effet la seule colonie qui fluoresce à la lumière UV. L échantillon 4 ne contient aucune colonie. Les autres échantillons contiennent des colonies, mais qui ne fluorescent pas. Peut-être parce que la concentration est trop faible ou simplement ce sont des faux-positifs. 3.5 Observations finales des colonies bactériennes Les 6 échantillons ont été chargé sur un gel d agarose avec une référence moléculaire. Image N 5: Gel des 6 échantillons Un autre gel à été effectué avec uniquement l échantillon contrôle et un échantillon aléatoire. L échantillon choisit était le numéro 3. Ce dernier ne contient malheureusement pas le gène cible, mais cela à été remarqué plus tard

7 Image N 6 : Gel des 2 échantillons 4. Discussion et Conclusion 4.1 PCR La PCR est la meilleure méthode pour amplifier un fragment. 25 cycles sont suffisants pour atteindre le point de saturation Nous avons effectué 30 cycles, car les conditions ne sont souvent pas optimales et il nécessaire d effectuer plus de cycles avant d atteindre le point de saturation. Nos résultats sont cohérents avec les données théoriques : environ 0.7 kd (700 paires de bases) alors que le gène VENUS contient 711 paires de bases. [4] Le bromure d éthidium (BET ou EtBr) est tout à fait adapté à la précision de nos résultats, on aurait pu par exemple aussi utiliser un autre indicateur fluorescent comme SYBR Green I (SG) [5] qui est un indicateur plus précis mais plus cher aussi. [6] 4.2 Digestion Après digestion par des enzymes, nous avons effectué une électrophorèse afin de déterminer la quantité de plasmide et de plasmide+insert dans nos levures. Nous avons obtenu 125 ng d insert ce qui correspond au rendement attendu après purification. La quantité de plasmide est très en dessous de celle attendue. Ceci est certainement dû au fait que le tube a été mal refermé et que de l eau provenant de l humidité de l air s est solidifié sur l échantillon : celui-ci avait été placé dans la glace afin de conserver ses propriétés et d éviter qu il ne soit dénaturé. Nous avons obtenu 5 ng alors que la quantité attendue était plutôt de 42 ng ce qui est bien au dessus de notre résultat. Une meilleure gestion lors de la mise en conservation de nos échantillons aurait pu éviter cela. Le choix des enzymes est un choix classique, totalement adapté aux buts de ces travaux pratiques. D autres enzymes auraient pu être choisies comme : Sal I, Not I, Sma I etc. [1] Nous avons utilisé Xho I et Bam HI et nos résultats correspondent aux résultats des groupes ayant utilisé Bam HI et EcoRI. Il n y a vraisemblablement pas de différences entres ces enzymes dans le cas de nos travaux pratiques. Il est évident que la précision joue un rôle important pour formuler cette hypothèse : dans des cas plus spécifiques, il serait utile d appliquer des méthodes plus précises (au niveau du choix de l indicateur fluorescent, de la concentration du gel, de la tension appliquée lors de l électrophorèse, etc) pour déterminer si une enzyme permet une meilleure digestion qu une autre. Le vecteur pgex-4t-3 convient très bien pour notre expérience comme expliqué dans le protocole : une des protéines traduites est pratique pour purifier ou détecter le plasmide. [1] 4.3 Préparation des bactéries compétentes et transformation Les bactéries ont pu se développer sur des plaques de Petri sur gel d agarose. On peut remarquer que la plaque de contrôle n a que peu de colonies survivantes : le plasmide qui est normalement «ouvert» c'est-à-dire qu il ne forme pas un cycle, a réussi à se fermer, permettant aux bactéries de résister à l ampicilline. Quant à la boîte où les bactéries avaient les plasmides plus le gène VENUS, plusieurs colonies se sont développées. A noter que sur une de nos deux boites, une énorme colonie de bactéries a eu le temps de se développée. Il est probable que c est soit plutôt - 7 -

8 des bactéries ou un champignon. En utilisant des gants stériles et en travaillant rapidement dans un milieu hostile, cette contamination aurait pu être évitée. La transformation du plasmide digéré et ligué seul nous permet de tester l efficacité de notre plasmide+insert. 4.4 Préparation du plasmide Nous avons effectué deux réactions, un sur le contrôle et un sur le contrôle plus insert. Nous avons effectué une PCR de 25 cycles des deux échantillons prélevées sur nos plaques de pétri. Le promoteur est spécifique et n affecte pas l ADN de la bactérie ce qui nous assure que seulement les plasmides sont répliqués. 4.5 Contrôle des positifs Une seule des 5 colonies prélevées dans notre boîte contrôle plus insert s est révélée être positive. Les autres ne semblent pas contenir de mutants. A noter qu une des colonies ne s est pas développée : ceci est peut être dû à une erreur lors du choix des colonies pendant le transfert de plaques. La colonie contrôle est négatif ce qui est totalement cohérent. Nous pouvons remarquer sur le gel d électrophorèse que seulement la colonie qui était positive aux UV a bien le gène VENUS alors que toutes les autres n ont pas de marqueur fluorescent. De plus, on peut remarquer sur le gel d électrophorèse de digestion qu il y a beaucoup d impuretés. Ceci est certainement dû à une contamination avec de l ADN étranger qui a été digéré et qui se dépose sur toute l échelle. 4.6 Conclusion Cette expérience nous a permis de cloner et d exprimer le gène VENUS dans des plasmides insérés dans des bactéries de type E.Coli. Nous avons obtenu 20% de clones, la plus grande difficulté était de choisir les colonies qui contenaient le plasmide avec le gène d intérêt. Les étapes critiques sont lors des manipulations avec les bactéries, car il est très facile de contaminer les échantillons. Une meilleure stérilité nous garantirait des résultats plus esthétiques, et donc plus précis. Le clonage et la sélection de mutants fait partie intégrante de la biochimie. Elle a permis de comprendre beaucoup de mécanismes de régulations de gènes et a ouvert de grandes opportunités d applications notamment en médecine où il a rendu possible de cibler les cellules cancéreuses. [7] 5. Sources bibliographiques [1] TRAVAUX PRATIQUE DE BIOCHMIE,, T.Soldati, 2010 [2] GFP, (consulté le ) [3] PCR, (consulté le ) [4] Yeast ressource center, (consulté le [5] SYBR Green I (SG), (consulté le ) [6] Electrophorèse sur gel d agarose, (consulté le ) [7] Roger Y Tsien laboratory, (consulté le ) "J'atteste que dans ce texte toute affirmation qui n'est pas le fruit de ma réflexion personnelle est attribuée à sa source et que tout passage recopié d'une autre source est en outre placé entre guillemets" Michèle Forestier Coralie Fournier Christophe Freyre - 8 -