Institut Universitaire de Technologie IUT d Auvergne Site d Aurillac Département Génie Biologique 100 rue de l égalité Aurillac

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1 Institut Universitaire de Technologie IUT d Auvergne Site d Aurillac Département Génie Biologique 100 rue de l égalité Aurillac Institut National de la Recherche Agronomique INRA NOUZILLY Bernard Marie Soutenance le 20 Juin ème année bioinformatique Année

2 Remerciements Remerciements Je tiens tout d abord à remercier Madame Svetlana Uzbekova pour m avoir permis de réaliser ce stage, m avoir donné tous ces conseils et fait confiance sur les manipulations réalisées. Merci à Aurore Thélie et Pascal Papillie pour leur aide et leurs conseils, toujours prêts à répondre aux questions que je leur ai posées. Merci à toute l équipe Ovocyte pour son accueil.

3 Résumé Résumé Ce stage de fin d études a été réalisé dans les laboratoires de l unité de recherche PRC (Physiologie de la Reproduction et des Comportements) à l INRA de Tours pendant 10 semaines. L équipe d accueil a pour objectif l amélioration de la production d embryons des animaux domestiques in vitro. Le but des travaux menés durant ce stage été de rechercher les gènes différentiellement exprimés dans l ovocyte bovin pendant la maturation in vitro en présence ou absence des cellules du cumulus* qui entourent l ovocyte à l intérieur d un follicule in vivo. L analyse des ARN par l hybridation d un réseau de gènes (macroarrays) et la RT-PCR en temps réel ont été les méthodes utilisées dans ce but. Les travaux ont portés sur des ovocytes récoltés sur des ovaires bovins et maturés in vitro. Les différentes techniques de la biologie moléculaire ont été utilisées, telles que l extraction d ARN, la RT-PCR ainsi que des techniques de bioinformatique telles que l analyse d images, le traitement statistique des données, la recherche de séquences homologues dans des bases de données. Mon travail a permit de comparer l expression génique entre l ovocyte immature et mature avec ou sans cumulus par l hybridation des macroarrays et déterminer un certain nombre des gènes potentiellement différentiels. Ces résultats sont validés par RT-PCR en temps réel pour les gènes OOSP1-var1, OOSP1-var2 et PRDX2. Le travail effectué ouvre des perspectives sur l analyse d autres gènes impliqués dans le déroulement de la maturation ovocytaire.

4 Abstract Abstract This stage of the end of study was carried out in the laboratory Oocyte and follicle in the Physiology of the Reproduction and the behaviours Department of INRA (Nouzilly) during ten weeks. This team has for the objective the improvement of embryos production of domestic animals in vitro. The goal of the work undertaken during this stage was to look for the genes differentially expressed in the bovine oocyte during in vitro maturation either in presence or absence of the cells of cumulus, which surround the oocyte inside the follicle in vivo. The analysis of RNA by hybridization of cdna macroarray and the real time RT-PCR were the methods used in this study. The work was performed on the oocytes collected from bovine ovaries and than matured in vitro. The various techniques of molecular biology were used, such as total RNA extraction, RT-PCR, and also bioinformatics tools such as programmes for image analysis, statistical data treatment and search for homologous sequences in data bases. My work has permitted to compare the gene expression profiles between immature and mature oocytes, maturing either with or without cumulus, by using the hybridization of the macroarrays. This work allowed to determine a certain number of potentially differentially expressed genes. These results were validated by real-time RT-PCR for genes OOSP1-var1, OOSP1-var2 and PRDX2. These results opened the perspectives for the analysis of other genes involved in oocyte maturation process.

5 Sommaire Sommaire Remerciements Résumé Abstract Introduction Présentation L INRA en France Quelques chiffres La recherche L INRA de Tours Le pôle Biologie animale et élevage Présentation de l UMR Organisation de l unité L équipe Follicule, ovocyte et développement Objectifs des recherches Matériel et méthodes Biologie moléculaire L extraction d ARN PCR RT-PCR Gel de migration PCR temps réel Macro arrays Caractérisation de macro array OOT Caractérisation de macro array MEM Marquage des cibles et hybridations des macro arrays Traitement informatique des données Scanner Storm ImaGene Analyse d expression génique, normalisation Identification des séquences par BLAST Résultats et discussion Extraction d ARN et analyse Marquage et hybridation Marquage Hybridation des membranes Hybridation avec Oligovecteur Déshybridation des membranes Hybridation avec cibles complexes Analyse d expressions géniques Choix des gènes différentiellement exprimés Validation d expression génique différentiel par RT-PCR en temps réel Conclusions Annexes Glossaire Table des sigles Bibliographie

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7 Schéma récapitulatif des manipulations Récolte des ovocytes à partir d ovaires prélevés dans les abattoirs T0 Après 24H de maturation in vitro élimination du cumulus MIV CEO MIV CDO Extraction des ARN d ovocytes ARNm Reverse Transcription ARNm ADNc Amplification ADNc SMART PCR Contrôle sur gel d électrophorèse Marquage sondes complexes 33 P Hybridation MEMBRANES

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9 Introduction Introduction La gamétogenèse chez les mammifères a pour but de produire des gamètes* capables de générer un embryon* viable afin d assurer la reproduction. Les ovocytes* se forment dès la vie fœtale. A la naissance, l ovaire bovin présente une réserve approximative de ovocytes. Seuls quelques uns parviendront au terme de leur développement et délivreront, lors de l ovulation*, un ovocyte capable d assumer avec succès la fécondation et le développement à terme. L ovocyte favorise la formation et la différenciation du follicule*. En parallèle, l ovocyte initie sa croissance et se différencie sous l influence du follicule ovarien. Il acquiert progressivement des compétences uniques qui vont lui permettrent de reprendre la méiose, d être fécondé et de soutenir le développement embryonnaire préimplantatoire. La qualité d un ovocyte se traduit par son aptitude à atteindre l état mature (métaphase II de la méiose), être fécondé normalement (monospermie*) et par la capacité de l embryon résultant à se développer normalement jusqu à terme. Le but des recherches menées dans le cadre de ce travail été de rechercher et de valider les gènes qui sont différentiellement exprimés dans l ovocyte bovin pendant la maturation in vitro en fonction de la présence ou de l absence de cellules du cumulus. En effet, lors de sa maturation le follicule passe par deux étapes. La première est la maturation nucléaire. A cette étape le follicule se retrouve bloqué en Métaphase II de méiose. La deuxième est la maturation cytoplasmique au cours de laquelle les ARNm* sont traduits en protéines. Malgré que le stade MII soit atteint dans les deux cas, les ovocytes maturés dénudés sont moins aptes à la fécondation et au développement. Pour étudier la différence entre les contenus transcriptomiques de ces ovocytes maturés différemment, les follicules vont donc être mis en maturation in vitro dans deux conditions différentes : avec et sans leurs cellules du cumulus. Lorsque l on observe ces ovocytes au microscope après la MIV*, on s aperçoit qu ils ne possèdent pas de différences morphologiques, ils sont tous en métaphase II de méiose. On a donc effectué des comparaisons au niveau des ARNm en utilisant la méthode d hybridations des macroarrays afin de voir s il existe ou non des différences selon le mode de maturation. Pour modèle, une banque d ADNc de gènes exprimés spécifiquement par l ovocyte bovin (banque SSH, gènes orthologues d espèces modèles, approche in silico) a été créée au laboratoire, et une macroarray a été produite à partir de cette banque. 1

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11 Hybridation sur réseaux DESHYBRIDATION PUIS Hybridation avec cibles complexes pour mesure l expression Hybridation avec oligovecteur pour evaluer la quantité ADN déposé membranes Permet de mesurer et quantifier chaque spot Scanner Storm Analyse avec le logiciel ImaGene et Excel Quantification Choix des différentiels avec Excel Exemple de tableau Excel pour le choix des différentiels Validation des différentiels par PCR en temps réel

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13 Introduction On réalise également ces comparaisons sur les protéines d ovocytes issues de ces conditions afin d élargir les recherches sur la différence d expression et voir si des différences existent au niveau de la traduction plus qu au niveau des ARNm. 2

14 Présentation 1. Présentation 1.1. L INRA en France L INRA a été fondé en 1946 dans le contexte de reconstruction national d aprèsguerre et du projet de modernisation de l agriculture française. Son objectif est alors de répondre aux attentes exprimées par la société (suffisance alimentaire de la nation.). Aujourd hui les défis scientifiques et sociaux sont différents et l INRA a donc modifié ses approches afin d y répondre. Il a pour missions de produire et diffuser des connaissances scientifiques, de concevoir des innovations et des savoir-faire pour la société, d éclairer les décisions des acteurs publiques ou privés, de développer la culture scientifique et technique et participer au débat science/société et de former à la recherche et par la recherche. Il s agit d un établissement public à caractère scientifique et technologique (EPST*) Quelques chiffres L INRA* compte hommes et femmes en Il est organisé en 14 départements scientifiques dans le domaine de l agriculture, de l alimentation et de l environnement. 21 centres de recherche régionaux, près de 200 sites de recherche et d expérimentation dans toute la France. 257 unités de recherche. Deuxième institut de recherche en France, il a développé un fort ancrage régional. Cependant, l agriculture, l alimentation et l environnement sont également des enjeux internationaux. Il est le premier institut européen de recherche agronomique. Actuellement il est un des acteurs majeurs de la construction de l espace européen de la recherche La recherche Différents secteurs sont mobilisés pour mener les recherches et coopèrent avec des chercheurs d autres instituts ou de l enseignement supérieur, en France et à l étranger. Elle est séparée en 14 départements scientifiques et 21 centres régionaux. Avec 74% de ses effectifs implantés en province sur plus de 150 sites, l institut est présent dans la quasi-totalité des régions françaises, y compris l outre-mer. Les centres INRA sont impliqués dans des projets de recherche sur des enjeux européens ou internationaux majeurs. Depuis 1998, l Inra s est engagé dans une politique d ouverture. En 2005, plus de la moitié des unités de recherche sont des UMR* L INRA de Tours Le centre INRA de Tours situé à Nouzilly en Indre et Loire a été crée en Ses recherches sont entièrement consacrées à la reproduction et à la santé des animaux d élevage. Ce centre est un des grands pôles mondiaux de recherche animale grâce à l homogénéité des thèmes de recherche dans des domaines complémentaires tels que la reproduction et santé animale, la qualité des produits et sécurité sanitaire des aliments, l étude des comportements Les recherches sont réparties en quatre unités de recherche et cinq unités expérimentales. Tout ceci mobilisant plus de cinq cents personnes. Les recherches menées sur le centre sont réparties en deux pôles principaux : Santé animale et santé publique, et le pôle Biologie animale et élevage. 3

15 Présentation Le pôle Biologie animale et élevage Le pôle Biologie animale et élevage comporte trois sous unités : Aviculture qui s intéresse à la biologie des oiseaux, Comportement et bien être animal dont les recherches portent sur les comportements animaux liés à la reproduction, aux relations sociales et à l ingestion, La reproduction et sa régulation qui cherche à améliorer la connaissance des cycles sexuels femelles et de la production de spermatozoïdes afin de perfectionner les techniques actuels de maîtrise de la reproduction et également de perfectionner la conception et la mise en pratique de nouvelles techniques d élevage Présentation de l UMR Au sein du département de Physiologie Animale et Systèmes d élevage de l INRA, l unité de Physiologie de la Reproduction et des Comportements (PRC) mène des recherches fondamentales et appliquées sur la fonction de reproduction des mammifères domestiques (bovins, ovins, caprins, équins et porcins) et sur les comportements animaux liés à la reproduction, aux relations sociales et à l ingestion. Le but de ces recherches et de produire mieux, à moindre coût mais tout en respectant les animaux et l environnement. L association de l unité avec le CNRS*, l Université François Rabelais et la Faculté de Médecine de Tours et les Haras Nationaux permet d élargir le champ des compétences de l unité Organisation de l unité L unité de recherche compte 136 agents permanents répartis entre les équipes de recherche et les services communs. L activité de recherche s effectue au sein de sept équipes de recherche constituées autour de grands thèmes L équipe Follicule, ovocyte et développement Le thème de recherche central de l'équipe est l'amélioration du rendement de la fécondation qui passe par une acquisition de connaissances concernant la régulation locale et endocrine de la croissance folliculaire, la différenciation cellulaire et moléculaire de l'ovocyte et le dialogue entre l'ovocyte et les compartiments somatiques du follicule. Ces connaissances sont exploitées dans le cadre de plusieurs applications nécessitant l'optimisation de la croissance folliculaire et de la qualité des ovocytes qui en résultent Objectifs des recherches La qualité d un ovocyte se traduit par son aptitude à atteindre l état mature, être fécondé normalement et par la capacité de l embryon* résultant à se développer normalement jusqu à terme. L objectif principal de l équipe est donc de comprendre les différentes étapes de la différenciation de l ovocyte le menant à cette qualité afin d en maîtriser la réalisation in vitro et améliorer les techniques d assistance à la reproduction. Le développement de nouvelles biotechnologies est rattaché à ces techniques. Tout ceci implique une maîtrise du développement embryonnaire précoce et une connaissance de la viabilité embryonnaire qui sont les critères de la qualité des gamètes. 4

16 Matériel et méthodes 2. Matériel et méthodes 2.1. Biologie moléculaire L extraction d ARN à partir d ovocytes bovins. Toutes les manipulations avec des ARN doivent être faites dans les conditions «RNAse-free», c'est-à-dire qu il faut porter des gants, stériliser tous le matériel et nettoyer préalablement la paillasse. L extraction des ARN commence par une lyse des ovocytes. Les groupes d ovocytes stockés dans des microtubes dans un tampon de préservation d ARN «RNAlater» (Ambion, UK) sont soumis à un choc thermique en intercalant des bains dans de l eau à 37 C et dans l azote (3 fois 1 min). Ajouter ensuite une solution de lyse «TriPure Isolation Reagent» (Roche Dianostics, Germany) à température ambiante. La quantité définie de l ARN messager de la luciférase bactérienne est incorporée à chaque échantillon à cette étape-la, et va permettre de normaliser les différentes extractions car elle est mise dans les mêmes proportions dans chaque tube. Une fois les cellules lysées il faut récupérer l ARN. On ajoute le glycogène, qui s agglomère et fixe l ARN, permettant la précipitation la plus efficace. Vortexer les tubes et attendre 15 minutes à température ambiante afin de lyser les cellules. Le chloroforme ajouté ensuite, va permettre de ségréger en plusieurs phases les produits : phase inférieure- les protéines, interphase - l ADN et phase supérieure - l ARN. Il faut attendre 10 minutes à température ambiante le temps que les trois phases se forment. Centrifuger 15 minutes à 4 C à RPM pour bien séparer les phases. Après la centrifugation il faut récupérer l ARN qui se trouve dans la phase aqueuse avec une pipette et transférer dans un autre tube. Il faut ensuite faire précipiter l ARN par l ajout d un volume équivalent d isopropanol et laisser à -20 C pendant minimum 20 minutes. Centrifuger 25 minutes à 4 C et RPM afin de former un culot. Ensuite le surnageant est éliminé et le culot doit être lavé avec ETOH à 75%, suivi par la centrifugation 15 minutes à 4 C et RPM. Éliminer le surnageant et ajouter 450μl d ETOH à 100%, centrifuger 10 minutes à 4 C et RPM. Éliminer le surnageant, assécher les tubes sans toucher le culot, déposer les tubes sous la cloche à vide d air. Laisser 10 minutes sous la cloche afin d assécher les tubes au maximum. Puis reprendre le culot dans de l eau stérile RNAse-free en ajustant le volume à la concentration voulue (équivalent d un ovocyte par μl) et stocker les tubes à -80 C afin de 5

17 Figure 1. Appareil à PCR Source : personnelle

18 Matériel et Méthodes préserver les ARN. Les tubes doivent être clairement identifiés, comportant la date d extraction, le nom de l échantillon et la concentration d ARN. (Annexe 1) PCR La PCR (anglais : polymerase chain reaction) est une technique permettant d amplifier in vitro des séquences d ADN par répétition de réactions d élongation en présence d amorces nucléotidiques spécifiques et d une ADN polymérase (issue d une eubactérie thermophile vivant dans des sources chaudes (70 à 75 C) : Thermus aquaticus) qui est stable jusqu à environ 100 C. Son principe repose sur la répétition de trois processus : Dénaturation des deux brins d ADN par une augmentation de la température jusqu à 95 C. Les molécules d ADN sont alors monocaténaires*. Hybridation des amorces oligonucléotidiques, appelés primers, complémentaires d une séquence de l ADN monocaténaire cible. Pour cette étape la température est descendue entre 40 et 65 C afin de permettre une bonne fixation des amorces. Elongation à l aide d une ADN polymérase thermostable, la Taq polymérase, à partir des amorces. La température optimale de cette étape est de 72 C. On va ensuite dénaturer par la chaleur les produits de ce premier cycle. On réalise une nouvelle hybridation des amorces (ADN provenant du premier cycle d amplification), chaque brin sert de matrice à la polymérase. A chaque cycle on double le nombre de copies du fragment d ADN. Après n cycles on obtient 2n molécules. (Annexe 2) Figure RT-PCR Cette technique a été développée pour permettre la détection et la mise en évidence d un ARN même rare dans un organe, tissu ou cellule. Il faut en premier lieu extraire les ARN totaux (mélange des ARN messagers, de transfert, ribosomaux ) des tissus étudiés. Les ARN messagers sont ensuit transcrit in vitro en ADN complémentaire (ADNc) monocaténaire grâce à une enzyme : la Transcriptase inverse (anglais : reverse transcriptase, RT) et les amorces comportant plusieurs bases T (15-18) sur son extrémité 5 (oligo dt), qui se lie à la queue polya sur l extrémité 3 des ARN messagers. Cet ADNc (complémentaire) 6

19 Matériel et méthodes obtenu va alors servir de matrice à une réaction de PCR utilisant un couple d amorces spécifiques de la séquence de l ARN d intérêt. La RT est réalisée à partir des échantillons conservés à une concentration de 1 ovocyte par µl. La réaction est amorcée avec un oligo-dt(15). Après l ajout des amorces (0,5 µg/µl), la première étape de la RT est lancée. Les échantillons sont dénaturés pendant 5 minutes à 65 C. Ensuite le tampon de RT (5x), les dntp (10mM), le DTT (0,1M), la RNAsin et le MMLV-RT (200U/µl, Invitrogen) sont ajoutés. La RT dure 50 minutes à 37 C. L incubation finale de 15 minutes à 70 C permet d inactiver l enzyme RT. L appareil utilisé pour cette réaction est un thermocycleur. Les transcrits converti en ADNc peuvent être amplifiés. Un mix PCR est préparé à l aide de dntp (10mM), MgCL2 (25mM), tampon PCR (10x), des amorces spécifiques sens et antisens (25pmol/µl) et de la Taq polymérase. Le cycle thermique type est : 95 C pendant 5 minutes ce qui permet d activer la Taq polymérase, puis une répétition plusieurs fois de l enchaînement suivant : 30 secondes à 94 C, 30 secondes à 58 C, 40 secondes à 72 C. Après tous les cycles une incubation à 72 C pendant 4 minutes est nécessaire pour compléter toutes les élongations. Les échantillons sont conservés à 12 C par le thermocycleur, puis pour une conservation longue peuvent être transférés à -20 C ou visualiser tout de suite les fragments obtenus par un gel d électrophorèse. La difficulté de la RT-PCR est la contamination de la préparation des ARNs par de l ADN génomique (ADNg). Les amorces nucléotidiques se fixent tout aussi bien sur l ADN monocaténaire issue des ARN que sur l ADNg contaminant. Afin d éviter ces contaminations on peut travailler à partir d ARN polyadénylés purifiés. On peut également traiter les échantillons d ARN avec une désoxyribonucléase, dépourvue d activité ribonucléase, qui va éliminer toute trace d ADNg sans dégrader les ARN (Annexe 3 et 4) Gel de migration Une fois la PCR réalisée il faut visualiser les produits d amplification. Pour cela on va faire migrer les produits de PCR sur un gel d électrophorèse. Ce gel est composé d agarose à différents pourcentages selon la taille des fragments d ADN à séparer. Plus les molécules sont petites, plus le gel doit être concentré. On utilise le plus souvent des gels de concentration comprise entre 1 et 2.5% d agarose. On fait fondre l agarose (sous forme de poudre) dans un tampon (TBE*) et on ajoute un produit polymérisant, le BET* (intercalant de l ADN très cancérigène, permettant une visualisation des fragments sous UV)). 7

20 Figure 2. Appareil pour la migration sur gel d agarose. Source : personnelle Figure 3. Exemple de gel de migration après révélation sous UV Source : personnelle Figure 4. Appareil à PCR en temps réel Source : personnelle

21 Matériel et Méthodes On coule le mélange ainsi obtenu dans un support et on laisse polymériser environ vingt minutes. On obtient alors un gel percé de puits dans la partie supérieure dans lesquels on va déposer les échantillons préalablement mélangés à un tampon de charge. On dépose également un marqueur de poids moléculaire afin de connaître la taille des fragments. On démarre alors la migration d électrophorèse pendant environ une demi heure à 100 volts. Figure 2 Une fois la migration terminée on va révéler sous UV. On obtient alors une image qui permet de savoir si l amplification à correctement fonctionnée ou pas. Figure PCR temps réel Le principe de la PCR en temps réel est le même que celui de la PCR. La différence vient du fait que l on détecte en temps réel la quantité d ADN double brin. On utilise pour cela un fluorophore, le SYBR Green. Il est capable de se lier à l ADN double brin. Sous sa forme libre il n est pas fluorescent. Lié à l ADN il devient très fluorescent. Il est très stable : après 30 cycles d amplification il possède encore 94% de son activité. L appareil à PCR classique est couplé à un microspectrofluorimètre ce qui permet de lire la fluorescence émise. Figure 4 Le mélange initial au début de l amplification contient la Taq polymerase, des dntp, de l ADN dénaturé, les amorces et le fluorophore non lié. Les amorces vont se coupler à l ADN. Le fluorophore se lie alors au double brin ce qui se traduit par une augmentation de la fluorescence. Vient ensuite l étape d élongation pendant laquelle le nombre de molécules de fluorophore lié à l ADN synthétisé augmente on observe donc une augmentation de la fluorescence. L appareil la mesure à la fin de chaque étape d élongation. Après le dernier cycle de PCR, la température est rapidement élevée à 95 C pour dénaturer l ADN puis elle est abaissée à la température de couplage ce qui provoque la reformation de l ADN double brin. La température est ensuite élevée lentement à 95 C. La fluorescence est lue en continue pendant cette remontée. Le SYBR Green est fluorescent tant qu il est lié à l ADN double brin. Lorsque l ADN se dissocie, le SYBR Green est libéré dans le milieu ce qui va entraîner une diminution progressive de la fluorescence. Lorsque 50% de l ADN double brin est dissocié, la fluorescence chute brutalement. La température mesurée alors correspond à la Tm* du produit synthétisé. (Annexe 5) La plaque à PCR utilisée pour cette manipulation est préparée ultérieurement à l aide du robot eppendorf. Ce robot permet de remplir les puits de la plaque et d effectuer les 8

22 Figure 5. Robot eppendorf Source : personnelle

23 Matériel et Méthodes mélanges entre les échantillons et le Mix PCR (préparé ultérieurement) de la manière la plus précise possible. La plaque comporte la gamme de dilutions d ADN spécifique à la concentration connue pour la mesure de la quantité de matrice correspondant dans nos échantillons d ADNc. Egalement, les contrôles négatifs et les échantillons d ADNc en duplicates- ou triplicates sont déposés dans des puits différents de la plaque. La programmation du robot s effectue à l aide d un ordinateur intégré. Il faut programmer chaque étape minutieusement afin d obtenir dans chaque puit le produit et la quantité attendus. Une fois le cycle du robot terminé, la plaque est déposée dans l appareil à PCR temps réel et la PCR est lancée. Figure 5 (Annexe 6) Macroarray La macroarray est une membrane de nylon sur laquelle les nombreux fragments d ADNc amplifiés par PCR et correspondant au différents gènes sont spottés en ordre précis. L ADN spotté est dénaturé est fixé sur la membranes, ce qui permet de l hybrider avec l ADN complémentaire marqué et de lire ses signaux Caractérisation de macroarrays OOT* La macroarray OOT comporte la collection de gènes bovins ovocyte-spécifiques qui a été obtenue au laboratoire (Pennetier et al., Biology of Reproduction 2005, vol. 73, pp ). Les membranes comportent 2400 dépôts, tous en réplicat. Il y a 79 spots de contrôles, 349 spots vides et 1972 spots de clones issus de cette banque d ADNc ovocytaire et des collections USDA. Le vecteur de clonage des clones issus de la banque ovocytes est le plasmide pcrii, celui pour les clones issus des banques USDA est le plasmide psport. La séquence de l amorce T7 est représentée par les différents plasmides utilisés pour les clonages. Les échantillons spotés sont déposés en cinq dépôts successifs ce qui permet d avoir une quantité d échantillons plus importante que en un dépôt. Après le spotting les membranes sont traitées. Elles sont trempées dans une solution de dénaturation pendant 20 minutes. Puis les membranes sont traitées avec une solution de neutralisation pendant 20 minutes. Ensuite elles passe 2H au four à 80 C puis elles sont crosslinker aux UV courts (1 minute 30 secondes) ce qui permet de fixer les dépôts sur la membrane. 9

24 Matériel et Méthodes Certaines membranes OOT sont traitées différemment. Elles subissent la dénaturation et la fixation uniquement par l UV- crosslinking Caractérisation de macroarrays MEM* Les membranes MEM présentent 2304 dépôts, aucun réplicat. Les spots sont répartis comme suit : 896 dépôts nommés BCAT : 882 clones du répertoire «Embryon bovin» et 14 témoins négatifs (puits vides). Le vecteur de clonage* est le plasmide puc dépôts BCBC : 377 clones du répertoire «Glande mammaire bovin et caprin», dont vecteurs de clonage* sont les plasmides pgem, puc18 et psport6, et 7 témoins négatifs (H2O) dépôts BCBB : 637 clones du répertoire «Muscle bovin» (vecteur puc18) et 2 témoins négatifs (puits vides).. 32 dépôts XCAA correspondant à de l ADN Arabidopsis cloné dans le plasmide pbs 23 témoins XKAA de kit Lucidea d Amersham (10 témoins Calibration, 8 témoins Ratio, 3 témoins Utility et 2 témoins Négative. 330 témoins négatifs XWAB (H2O) On a donc au total 1928 clones présents sur les membranes et 376 témoins négatifs. La séquence de l amorce RP1 est représentée par les différents plasmides utilisés pour les clonages* Marquage des cibles et hybridation des macro arrays La première hybridation à réaliser est celle de l oligovecteur marqué sa séquence est présente dans tous les clones spottés sur les macroarrays. Celle-ci permet de mesurer le taux d ADN de chaque spot afin d effectuer une correction des valeurs obtenues avec les cibles complexes. Le mélange de marquage est constitué de l oligonucléotide (Oligovecteur RP1 ou T7) a marqué (1 µg), d un tampon Kinase, 50 µci du γ33p ATP à 3000 Ci/mmol (10 mci/ml), 1 µl de T4 Kinase et d eau. Après incubation 60 minutes à 37 C, la réaction est arrêtée par l ajout d EDTA. Ensuite on purifie l oligonucléotide marqué de dntp33 libres. Pour cela on utilise une mini-colonne remplie par des particules de Cephadex 10

25 Matériel et Méthodes G50 (Pharmacia-biotech). Le passage du mélange par cette colonne à l aide de la centrifugation d une minute à 800g suffit pour que l oligo marqué purifié se trouve dans le tube. Rajouter 5 µg de l oligo froid (non nucléaire) et passer au comptage. Le comptage permet de calculer l efficacité du marquage. Il est réalisé à l aide d un compteur. Pour faire ce comptage il faut prélever 2 µl de sonde purifiée et ajouter 2 ml de liquide à scintillation. Le compteur donne alors le nombre de cpm (coups par minutes) par µl de sonde marquée. Une fois l oligonucléotide marqué, il faut passer à l étape d hybridation sur les macroarrays. La première étape est la préhybridation. Il faut humidifier les membranes dans une solution de 2x SSC qui va permettre de les enrouler dans les tubes à hybridation, les spots vers l intérieur du tube. Le tampon d hybridation a été préchauffé au bain marie (65-70 C) et il a été ajouté du sperme de saumon dénaturé qui va servir à bloquer les spots sur les membranes. Après une incubation d une heure, le 2xSSC est retiré et remplacé par le tampon d hybridation (5xSSC, 5xDenhard, 0.5%SDS, 100 µg/ml de l ADN de sperme du saumon). La préhybridation se déroule à 42 C dans le four pendant 3 à 4H. Après cette incubation il faut passer à l hybridation des cibles. L oligovecteur radioactif est ajouté au tampon d hybridation neuf à 45 C ( cpm par ml de tampon). Le tampon utilisé pour la préhybridation est éliminé et remplacé par celui contenant l oligovecteur marqué. Après incubation une nuit à 42 C dans le four à hybridation, la sonde est récupérée (réutilisée ou évacuée). Les membranes sont lavées dans les tubes à l aide d un tampon de lavage. Ce tampon est préparé à partir de SSC et de SDS. Les concentrations finales sont : 2x SSC / 0,05% SDS. Le tampon de lavage est ajouté dans le tube, agité puis incubé 5 minutes à température ambiante. Puis les membranes sont rincées deux fois à 42 C avec une incubation de 5 minutes dans le même tampon. Ensuite les membranes sont séchées sur papier Whatman puis misent sous plastique et exposées dans une cassette avec un écran capturant la radioactivité (Amersham) pendant la nuit afin de réaliser un scanner et contrôler l hybridation. (Annexe 7) Une fois le scanner des membranes réalisé, vient l étape de déshybridation qui permet de nettoyer les membranes de toutes traces de radioactivité. Une étape de contrôle est obligatoire afin de vérifier que les cibles se sont bien déshybridées. Il faut exposer les membranes dans la cassette pour une nuit puis refaire un scanner. L image obtenue ne doit présenter aucun spot. (Annexe 7 bis) La première hybridation à réaliser est celle de l oligovecteur. Celle-ci permet de mesurer le taux d ADN de chaque spot afin d effectuer une correction des valeurs obtenues avec les 11

26 Figure 6. Scanner Storm Source :

27 Matériel et Méthodes cibles complexes. Ensuite, après l étape de déshybridation, la cible complexe est hybridée selon un autre protocole. Les cibles complexes sont des ADNc amplifiés par la méthode SMART-PCR obtenue à partir des ARN d ovocytes à des stades différents de maturation (immatures, maturés dans les cellules du cumulus et maturés dénudés). Elles sont ensuite marquées avec des désoxyribonucléotides (dctp) portant du 33 P. La préhybridation et l hybridation sont effectuées dans un tampon SuperHyb (Amersham) à 68 C pendant H. Les lavages sont plus stricts : 2 fois 2xSSC/0.5%SDS 15 min 65 C, puis 2 fois 30 min 0.2xSSC/0.1%SDS à 68 C. Les membranes sont hybridées ainsi : OOT10 et MEM1 : Ovocytes immatures (T0) OOT9 et MEM2 : Ovocytes maturés dans le cumulus* (MIV* CEO*) OOT12 et MEM3 : Ovocytes maturés sans le cumulus* (MIV CDO*) Apres une nuit d exposition, image doit être scanné pour révéler les signaux Traitement informatique des données Scanner Storm Le scanner Storm est un imageur qui permet de faire des autoradiographies sur un écran sensible (écran au phosphore) ou de visualiser et d analyser des signaux fluorescents. Ici c est le marquage radiographique au 33P qui est utilisé. Les échantillons (membranes) sont exposés à un écran au phosphore dans une cassette. Lors du scanner de cet écran le signal radioactif est transformé en signal fluorescent qui peut être lu par l imageur. La résolution la plus fine est de 50 microns/pixels sur une fenêtre de scan maximale de 43 par 36 cm. On obtient alors une image de l hybridation des membranes en nuances de gris. Figure ImaGene L image au format *.gel obtenue par Storm peut être lue par le logiciel ImaGene 5.0, qui va reconnaître les spots marqués et les quantifier en comptant leur intensité en pixels. Ce logiciel permet de placer des grilles autour des spots et calcule à partir de ces grilles l intensité de chaque spot. La surface du signal de chaque spot est alors quantifiée 12

28 Matériel et Méthodes et il ne reste plus qu à analyser chaque mesure afin de savoir la quantité relative de cible fixée sur chaque spot. 12

29 Tableau 1. Exemple de tableau pour le traitement des données des macro arrays Figure 7. Impression d écran du résultat d une analyse par le logiciel Blast Source :

30 Matériel et Méthodes Analyse d expression génique, normalisation Les données récupérées à l aide d ImaGene sont transférées sous Excel pour réaliser une approche statistique des données. Les intensités brutes sont corrigées de façon à obtenir des valeurs comparables les unes aux autres. D abord, on les normalise par la médiane de tous les signaux non vide (pas de flag 2), minimisant les différences expérimentales entre hybridations. On peut effectuer la transformation logarithmique des données pour visualiser la corrélation entre les membranes. Ensuite, les valeurs normalisées obtenues avec des cibles complexes sont normalisées par les valeurs d oligovecteurs correspondants, tenant compte de la quantité d ADN déposée (pour chaque spot on divise la valeur normalisée de cible complexe par la valeur normalisée d oligovecteur). Une fois la normalisation terminée, on calcule le ratio entre les situations expérimentales qui nous intéressent et on peut choisir les gènes différentiellement exprimés. Une comparaison entre les ovocytes immatures et matures (ration T0 versus MIV CEO) et une comparaison entre les ovocyte maturés dans COCs et dénudés (ratio MIV CEO versus MIV CDO) sont réalisées. Les valeurs des ratios sont classées. Ensuite, les clones dont le ratio est supérieur à un seuil fixé (ici 3.0 et 1.4 pour les comparaisons mentionnées ci-dessus) sont récupérés de la liste afin de connaître les gènes surexprimés qui vont être étudiés. Les clones à ratios inférieurs à un seuil (0.75) sont également récupérés ce sont les clones sous exprimés. Les tableaux alors obtenus vont permettre de choisir les gènes potentiellement différentiels, qui vont être ensuite validés par PCR en temps réel. Tableau Identification des séquences par BLAST Les identifications des gènes présents sur les macroarrays ne sont pas toutes connues. Par contre, on dispose de leurs séquences. Le logiciel Blast, disponible sur Internet sur le site du ncbi ( permet de comparer des séquences à des banques de données. Il est alors possible, si la séquence du gène est connue dans les banques, de trouver son identité, ou de déterminer la séquence la plus proche chez d autres espèces pour pouvoir l identifier par homologie et étudier correctement ce gène. Figure 7 13

31 T0 MIV DO 1500 nt 500 nt Figure 8. Gel de migration contrôle de la RT- PCR Marqueur (100 bp DNA ladder) 2- T0 3- T0 4- T0 5- MIV CDO 6- MIV CDO 7- MIV CDO MIV CDO 9- MIV CEO 10- MIV CEO 11- MIV CEO 12- RT + (réalisée le 11/04/06) 13- RT (H2O) Figure 9. Gel de migration. Contrôle de la RT PCR

32 Résultats et discussion 3. Résultats et discussion 3.1.Extraction d ARN et analyse On suit le protocole décrit en Matériels et Méthodes et annexe 1 pour faire l extraction d ARN totale suivi par la conversion des ARN messagers en ADNc (RT). L extraction a été réalisée à partir d ovocytes collectés sur des ovaires bovins et mis en maturation in vitro dans les deux cas de figures étudiés et à partir d ovocytes à T0, c'est-à-dire immatures. L extraction a été réalisée sur plusieurs groupes de 10 ovocytes à T0, ovocytes à maturation dans le cumulus* et ovocytes à maturation sans le cumulus*. Une fois l extraction terminée, on est passé à la RT-PCR. Deux types de RT-PCR ont été effectués : 1. RT en utilisant «SMART PCR cdna Synthesis» kit (Clontech). Ce kit permet de générer les ADNc en pleine longueur et de les amplifier tous de façon linéaire par PCR. 2. RT classique avec amorçage oligo-(dt) 15 Les produits de la SMART RT-PCR sont contrôlés sur gel d agarose. Sur le gel Figure 8 on voit le marqueur de poids moléculaire dans le 4eme puit. Trois puits précédents correspondent au pools d ADNc amplifiés à partir d échantillons d ovocytes immatures T0 (1), MIV CEO (2) et MIV CDO (3). Les produits amplifiés sont de tailles différentes et sont représentées comme une «smire», ce qui est normal. Ces produits vont être marqués et utilisés en tant que cibles complexes qui seront hybridées sur les membranes. La RT classique est contrôlée par la PCR amplifiant l ADNc de β actine avec des amorces sens et anti-sens spécifiques. On contrôle les produits d amplification sur gel d agarose à 1,5%. On dépose les échantillons, les contrôles positif (RT réalisée sur l ovocyte le 11 avril 2006) et négatif (H2O) en mélangeant 8μl de produit PCR et 2μl de tampon de charge dans chaque puit. On dépose également le marqueur de taille et on lance la migration 30 minutes à 100 volts. Après révélation sous UV on obtient l image de la Figure 9. Le marqueur est dans le premier puit. Ensuite on a, dans l ordre, trois puits contenant des échantillons à T0, quatre avec les échantillons MIV CDO, trois avec les échantillons MIV CEO et les deux contrôles, positif et négatif. Le fragment d environ 450 pairs de bases est bien correspondant à l actine (432 pb prévu) est visible dans tous les échantillons sauf 14

33 Figure 10. Images des membranes hybridées avec l oligovecteur. En haut MEM avec RP1. En bas OOT avec T7. Com paraison du Log du Signal total des 3 m em branes Com paraison du Log du Signal Total des 3 m em branes 6,5 6,3 7 6,5 6,1 5,9 5,7 6 5,5 5,5 5,3 5,1 4,9 5 4,5 4,7 4,5 4,5 4 3,5 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6, ,5 6 6,5 OOT 10 (traitement 1) MEM1 Graphique 2 Graphique 1 Cible Oligo RP1 Oligo T7 Ovocytes T0 Ovocytes MIV CEO Ovocytes MIV CDO Radioactivité de la cible Quantité utilisée pour 1 ml de tampon (cpm/ µl) d hybridation (cpm) Tableau 2. Résultat des comptages 7

34 Résultats et discussion négatif, comme attendu. Tous les échantillons sortent donc on en conclut que l extraction et la RT-PCR ont été réalisées avec succès et que les échantillons d ARNm ont correctement été retrotranscrits et amplifiés. Ces ADNc vont être utilisés ensuite pour la PCR en temps réel. 3.2.Marquage et hybridation Marquage Les produits de marquage des oligovecteurs et cibles complexes ont été récupérés dans un volume de 50 µl. 2 µl ont été utilisé pour le comptage. Les résultats sont dans ce tableau. Tableau Hybridation des membranes Hybridation avec Oligovecteur Les membranes sont hybridées une première fois avec l oligovecteur RP1. Le résultat obtenu est bon pour les trois membranes MEM mais il semble que ce vecteur ne soit pas présent sur les membranes OOT. Il faut donc déshybrider les membranes et faire une nouvelle hybridation avec un autre vecteur. Le nouveau vecteur utilisé est le vecteur T7. Le scanner montre que ce vecteur est bien présent sur les six membranes mais le signal des membranes MEM est moins bon qu avec le vecteur RP1. Pour l analyse des données et la normalisation les membranes MEM seront donc traitées avec les résultats obtenus avec le vecteur RP1 et les membranes OOT avec ceux obtenus avec le vecteur T7. Figure 10 À l aide du logiciel ImaGene 5.0 on a mesuré les signaux de chaque spot. Une grille a été placée pour chaque membrane. L intensité de chaque spot a été mesurée dans un rond d un diamètre fixe de 25 pixels. L hybridation avec l oligovecteur a également permis de vérifier si les trois membranes de chaque lot sont identiques. On a donc traitées les données issues de cette hybridation en calculant le Log du signal total de chaque membrane. Puis ces valeurs ont été comparées les unes aux autres et nous avons obtenu les Graphiques 1 et 2. Sur le graphique 1 on voit très bien que les trois membranes MEM sont identiques. En effet aucun point ne 15

35 Figure 11. Image obtenue après la déshybridation des membranes MEM et OOT. Figure 12. Images obtenues après l hybridation des sondes complexes. En haut MEM (T0, MIV CEO, MIV CDO). En bas OOT (T0, MIV CEO, MIV CDO).

36 Résultats et discussion diverge de la courbe. Par contre, sur le graphique 2 qui montre le même résultat mais pour les membranes OOT on voit très bien que des points divergents entre les membranes 9/12 et 10. Cette différence est due au fait que la membrane 10 a été traitée différemment des deux autres membranes. On observe donc une variation dans l hybridation de l oligovecteur. Ce résultat nous permet de normaliser les valeurs qui seront obtenues avec la sonde complexe et de pouvoir ainsi comparer les trois membranes de la même manière Déshybridation des membranes L étape de déshybridation des membranes doit être contrôlée afin de vérifier qu elles ne présentent plus de spots. On réalise donc un nouveau scanner des membranes. L image obtenue montre que la déshybridation s est déroulée correctement. Figure Hybridation avec les cibles complexes Après contrôle de la déshybridation des membranes l étape d hybridation avec les cibles complexes peut commencer. Là aussi cette étape doit être contrôlée par un scanner. L image obtenue montre les spots qui se sont allumés grâce aux sondes complexes. Il reste à analyser ces données. Figure 12 Les intensités des signaux ont été mesurées avec les mêmes grilles que pour oligovecteur Analyse d expression génique Une fois l acquisition d image et la mesure d intensité des spots réalisées, on a obtenu un grand nombre de données brutes qu il a fallut analyser afin de pouvoir tirer des conclusions et choisir les gènes différentiellement exprimés. Les médianes de chaque hybridation ont été calculées et ces valeurs ont été utilisées pour la normalisation. Les valeurs brutes de signal total obtenues par l hybridation de la sonde complexe ont été normalisées par celles obtenues par l hybridation de l oligo à l aide de la formule = (valeur brute sonde complexe/médiane des valeurs brutes sonde complexe) / (valeur brute oligo/médiane des valeurs brutes oligo). Ensuite, les ratios entre les situations d intérêt ont été fait : les données normalisées ont été comparées deux à deux (T0 versus MIV CEO et MIV CEO versus MIV CDO). Les valeurs de ces ratios obtenus ont été classées en ordre décroissant. On a fixé un seuil pour les clones surexprimés à 1,4 et un pour les gènes sous exprimés à 0,75. 16

37 Tableau 2. Choix des gènes différentiellement exprimés. 1,4 M IV 1 0,8 0,6 T0 DO 0,4 0,2 0 1,5 M IV 1 DO T0 0 Niveau d'expression relative (unité 2 arbitraire) Niveau d'expression relative (unité 1,2 0,4 DO M IV M IV DO 0,2 0,0 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 M IV DO T0 1,2 1 arbitraire) T0 0,6 0 T0 0,6 Gène PRDX2. Expression mesurée par PCR en temps réel Niveau d'expression relative (unité 1 arbitraire) Niveau d'expression relative (unité 1,2 0,2 0,8 0,4 Expression mesurée du gène PRDX2 par macroarray 0,8 1,0 Clone 2A1 du contig 30. Expression mesurée par PCR en temps réel Expression mesurée du contig 30 par macroarray 0,5 1,4 arbitraire) 1,2 1,6 arbitraire) 1,6 Niveau d'expression relative (unité Clone 3D5 du contig 91. Expression mesurée par PCR en temps réel 1,8 arbitraire) Niveau d'expression relative (unité Expression mesurée du contig 91 par macroarray 0,8 T0 0,6 0,4 0,2 0 M IV DO Graphique 3. Comparaison des données issues de l hybridation des membranes OOT et celles issues des PCR en temps réel.

38 Résultats et discussion On a extrait de la liste les valeurs supérieures et inférieures à ces seuils et on les a placé dans deux tableaux. Les clones sont triés selon le GeneID et les clones correspondant à gènes identiques ont été rassemblés. On a alors obtenu groupes des gènes potentiellement surexprimés et sous exprimés selon les états de maturation des ovocytes. Les résultats sont présentés dans le tableau 2. Cette liste sert pour le choix des gènes à valider Choix des gènes potentiellement différentiellement exprimés Le traitement des données effectué sur Excel a permis de choisir les gènes qui semblent être différentiellement exprimés. Nous avons déterminé 21 clones sur exprimés, 3 sous exprimés. Tableau 2 On a choisis pour la validation les clones 2A1 (fait partie du contig numéro 30, gène OOSP1 variant 1), 3D5 (fait partie du contig numéro 91, gène OOSP1 var 2) et PRDX2. Les gènes représentés par ces clones montrent une expression variable entre les étudiés (Graph. 3, colonne gauche). Les amorces spécifiques pour ces gènes été choisies : Clone 3D5 : représente le gène de «oocyte-secreted protein» OOSP1_var1 Amorce sens S1 : TGCCAAGATTAAACCCACACTATTTC Amorce anti-sens AS1 : TCATAATGAGCATCTGGTGAAACG Clone 2A1 : gène de «oocyte-secreted protein» OOSP1_var2 Amorce sens S3 : GCTGGGGATTGGTCAGACTTTC Amorces anti-sens AS4 : AACACACGACACGGGCATTTC Gène PRDX2 : peroxiredoxin2 Amorce sens S1 : GATTATGGCGTGCTGAAGGAAGATG Amorce anti-sens AS1 : GAGCGTCCCACAGGCAAGTC 17

39 Figure 13. Courbe de fusion de la luciférase. Figure 14. Courbe de fusion du gène 2A1. Figure 15. Courbe de fusion du gène 3D5. Figure 16. Courbe de fusion du gène PRDX2. 17

40 Résultats et discussion 3.3 Validation d expression génique différentiel par RT-PCR en temps réel On suit le protocole décrit dans Matériel et Méthodes et en annexe 5. La PCR a été réalisée à partir des échantillons d ADNc conservés à -80 C et dilué a la concentration 0.01 equivalent d ovocyte par µl. Le cycle thermique a été choisit en fonction des amorces utilisées. La première phase de 3 minutes à 95 C permet d activer la Taq polymérase. On a ensuite une répétition quarante fois des phases 30 secondes à 95 C, 30 secondes à 60 C et 20 secondes à 72 C. Une fois la réaction terminée on a obtenu la courbe de fusion (figure 13). La première PCR temps réel a été réalisée avec des amorces de luciférase. Cette étape va permettre de normaliser les valeurs obtenues avec les gènes choisis. La deuxième PCR est réalisée avec les amorces 2A1 et 3D5 ensembles. La troisième est réalisée avec les gènes PRDX2. On a obtenu les résultats présentés sur les Figures 14, 15 et 16. Les courbes de fusion montre que un seul fragment spécifique a été amplifié, et que on peut utiliser les données de la quantification. L efficacité de chaque PCR et les valeurs de quantification de chaque échantillon par rapport à une gamme standard sont présentées dans Annexes 8, 9, 10 et 11. Les valeurs de quantification de chaque échantillon par rapport à une gamme standard ont été traitées de la manière suivante : les moyennes ont été faites pour toutes les situations identiques. Puis les moyennes de chaque situation ont été normalisées par la moyenne de T0. Ensuite on a tracé les graphiques à partir de ces données normalisées. Ces graphiques sont présentés sur le graphique 3. En conclusion, les patrons d expressions géniques obtenus par l hybridation des macroarrays sont validés par RT-PCR en temps réel pour gènes OOSP1-var1, OOSP1-var2 et PRDX2 montrent une parfaite corrélation. Ces gènes-la peuvent être impliqués dans le déroulement de la maturation ovocytaire. 18

41 Conclusion Conclusion Les travaux menés ont permis de démontrer qu il existait une légère différence de transcrits selon la maturation des ovocytes. En effet, que les ovocytes aient été mis en maturation dans leur cumulus* ou sans leur cumulus* la quantité de transcrits est identique pour la majorité des gènes. Pourtant, la différence d expression de quelques gènes, observée par l hybridation de macroarrays, a été confirmée par une autre technique telle que la RT-PCR en temps réel. Ceci permet de valider les résultats obtenus sur l ensemble des gènes présents sur les macroarrays. Egalement, des recherches ont été entreprises sur l expression des protéines afin de voir si des différences existent au niveau de la traduction des ARN en protéines. Ce stage m as permis de découvrir le travail de technicien de recherche dans le cadre d un sujet d étude précis et suivit. J ai également put mettre en application les connaissances théoriques enseignées à l IUT. 19