Magali Giral ITERT-UN, CHU Nantes

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1 Magali Giral ITERT-UN, CHU Nantes

2 Source DIVAT Nantes Age receveur> >2000

3 Les causes de perte des greffons après la première année Adapté de Pascual M, NEJM vol 346, page 581 Causes de perte des greffons après 1 an Dysfonction chronique des greffons 50% des cas Patients décédés avec un rein fonctionnel 50% des cas Néphropathie chonique du transplant 30 à 40 % des cas (NCT) Autres causes de dysfonction chronique 10 à 20 % des cas Rejet chronique immunologique NCT origine mixte Non spécifique Toxicité aux anticalcineurines Récidive maladie initiale RHCA FI/AT Maladie de novo Rejet aigu Infection BK V Reflux urétéral

4 Causes immunologiques - Acute and sub-clinical rejection - HLA matching - Panel reactive antibodies - Re-transplantation - Post graft immunisation - C4d binding - Auto-immunity - Direct and indirect allo-immunity/regulation - non compliance Facteurs de progression Blood pressure / Vascular disease Doppler ultrasound RI >0.80 Dyslipidemia Obesity Nephron mass Tabacco Diabetes mellitus Proteinuria >800 mg/24 h Nephrocalcinosis ECHEC Causes non immunologiques - Donor Factors - Delayed graft function - Ischaemic time - Donor and recipient sex - Donor and recipient age - African-American race - Renal function Creatinine at 1, 6, 12 months - Change in GFR between 6 and 12 months autres causes - CMV disease - BK virus nephropathy - CNI toxicity - Reccurrent glomerulopathy or disease - Uro-vesical reflux - Graft pyelonephritis

5 1 ème limite : l absence d anticipation au diagnostic Acute Graft Rejection Beta-Blocker Proteinuria Converting Enzyme Inhibitors anti class II anti class I High Blood pressure CNI tox Kidney Biopsy : Active chronic humoral rejection GA, C4d+ and anti donor Ab

6 Limites en transplantation 2 ème limite : l immunosuppression PAS ASSEZ d immunosuppression TROP d immunosuppression REJET INFECTION NEPHROTOXICITÉ Immunosuppression à long terme CANCER/infecti on

7

8 Ajustement du traitement Prévention de l over-immunosuppression (toxicité, infections, cancer) Prévention du rejet Détection de la tolérance Traitement personnalisé

9 Place des Biomarqueurs dans l estimation du devenir des greffes Qu est ce qu un biomarqueur mesure et est un indicateur objectif d un processus biologique normal, pathogène ou d une réponse pharmacologique à une intervention thérapeutique Biomarkers Definitions Working Group Les caractéristiques d un Biomarqueur sont : précis Specifique Utilisable largement Interprétable rapidement Peu invasif

10 Inserm U643 Identification de biomarqueurs pour le prognostic et l aide à la décision d clinique: Clinic Bench Fort risque Suivi plus attentif et adaptation du traitement immunosuppresseur Faible risque Réduction des immunosuppresseurs Chronic rejection Tolerance Recherche Fondamentale Pré-clinique Translationnelle

11 Biopsies Avantages: fournissent le maximum d information Désavantages: Invasif, risque de complications, cher, erreur d échantillonnage La Biopsie représente 0.02% du greffon Erreur d échantillonnage Sang Avantages: Non-invasif, pas cher Désavantages: Distant de le greffe Urine Avantages: Non-invasif, pas cher, proximité de la greffe (rein) Désavantages: influence de la non stérilité, variation dans la journée.

12 transplantation rénale Créatinine sérique ou la clearance de la creatinine et la proteinurie Avantage: Non-invasif et pas cher Désavantage: trop tardif Dosage des immunosuppresseurs Avantage: cible thérapeutique Désadantage: Niveau d IS empirique et grande variabilité individuelle Le dosage des anticorps Anti-HLA, DSA Avantage: indique une réponse anti donneur Désavantage: peuvent être présents sans conséquence immédiate pour le greffon BIOPSY

13 Donor cytotoxic T lymphocyte precursor assay Weimar et al., Nephrol. Dial. Transplant /81 receveurs de greffe de donneur vivant de foie. Pas de réponse cytotoxique anti donneur après arrêt IS (nle contre third partie). => 1 seul patient développe un rejet après arrêt de l IS

14 Cellules T ou PBMC co-injectées Avec les antigènes du donneur dans la patte de souris immunodéficientes Mesure de la taille de la réponse inflammatoire Indique la réactivité cellulaire T Suppressed DTH response of cells from tolerant recipients and intact response in a patient who lost tolerance (VanBuskirk et al., J. Clin. Invest 2000) No correlation between DTH assay and outcome or humoral sensitization after kidney and pancreas transplantation (Pelletier et al., Am. J. Transplant.2002).

15 test biochimique utilisé pour détecter la présence d anticorps ou d antigène dans le sérum par exemple Un ou deux anticorps peuvent être utilisés, l un spécifique de l antigène (primary Ab) et l autre spécifique du complexe Ag-Ac (secondary antibody) Le second anticorps est couplé à une enzyme L addition du substrat spécifique de l enzyme permet l émission d un signal mesuré par densité optique

16 Substrate (colourless) Enzyme-linked 2 Ab ENZYME Converted substrate 1 antigen-specific Ab Antigen capture Plate-bound Antibody

17 Substrate (colourless) Enzyme-linked 2 Ab ENZYME Converted substrate 1 antigen-specific Ab Plate-bound antigen

18 Détection d anticorps : identification des anticorps anti-hla dans le sérum des patients transplantés Détection d Antigène: Le dosage du CD30 s (marqueur des LT activés) dans le serum est un indicateur de devenir de la greffe et peut être mesuré en pré et en post transplantation (marqueur du rejet aigu) Sengul et al. Tranplantation 2006;81(8):

19 Test immunologique basé sur la technique ELISA Permet la numération des cellules qui sécrètent des molécules particulères comme les cytokines (IFN) Le principe est la capture des molécules sécrétées par les cellules testées sur une surface préparée. Les cellules sont éliminées par lavage et le complexe immun est révélé par une technique ELISA utilisant un substrat insoluble don t la précipitation produit des spots colorés. Très sensible et reproductible

20 Plaque recouverte d un anticorps anti cytokine Les cellules sont incubées sur la plaque dans les puits Les cellules sécrètent des cytokine qui sont capturées par l anticorps spécifique Les cellules sont retirées par lavage Un anticorps marqué est ajouté Révélation des spots par coloration

21 Quantifies the frequency of previously activated or memory T cells that respond to donor antigen by the production of a selected cytokine (each spot correspond to a single antigen-experience T cell) ELISPOT sur sang périphérique de la réactivité des lymphocytes T contre le peptide HLA-DR du donneur Najafian et al. J Am Soc Nephrol 2002;13(1):252-9

22 Donne une appréciation global du répertoire des cellules T avec la possibilité de révéler des perturbations qui peuvent être spécifiques de situations immunologiques particulières. Apprècie la région hypervariable CDR3 (chaine B du TCR régulée par le réarrangement Vb-Db-Jb) directement impliquée dans la reconnaissance du peptide : Distribution de longeur de la région Accumulation des transcrits du Vb

23 TcLandscape Analysis of the TCR repertoire (V chain usage and CDR3 length distribution) (Guillet, J. Immunol. 2002) APC MHC antigen TCR CDR2 CDR1 CDR3 TCR CMH II N N CDR1 CDR2 V x D x J x CDR3 chain C C chain T Lymphocyte

24 CDR2 CDR1 TCR N N CDR1 CDR2 chain C C chain Immunoscope CDR3 CMH II V x D x J x CDR3 CDR3 length in aa TcLandscape V /HPRT ratio V families CDR3 CDR3 lengths lengths Percentage of perturbations TcLandscape Topview Guillet et al., J. Immunol., 2002, 168,, 5088 Guillet et al., Current Opinion., 2001, 13,, 566 Sébille et al., J. Immunol., 2001, 167,, 3082 Gagne et al., J. Immunol., 2000, 164:1553 Brouard et al., J. Immunol., 1999, 162:3367

25 L ARN est extrait, amplifié et converti en ARN compémentaire (crna) Le crna est marqué avec un des deux marqueurs fluorescent Cyanin 3 (vert) and Cyanin 5 (rouge) Des échantillons tests sont marqués en vert et les échantillons de référence sont marqués en rouge. Les gènes sur exprimés par rapport aux gènes de référence apparaissent en rouge et ceux sous exprimés apparaissent en vert. Le crna est déposé sur le microarray qui contient des milliers de gènes appelés probes qui couvrent le génome entier (pangénomique) ou des gènes spécifiques (dédicated microarra) Scanned image of a microarray

26 Blood Analysis 30,000 DNA spots 12,440 genes RNA extraction SAM (vs CR) Reverse transcription PAM

27 Training set: Used to identify gene expression signature that can discrimate groups Test set: Idenpendent samples used to test the disciminative power of the gene signature identified in the training group Statistical Analysis of Microarray (SAM): Identification of differential expression of genes between sample groups that is statistically significant Predictive Analysis of Microarray (PAM): Identification of a minimum number of genes that can correctly classify samples in their respective groups

28 A typical representation of microarray data: «Heatmap»: Upregulated genes in red Downregulated genes in green Individual samples Individual genes

29 The quantity of DNA is monitored throughout the PCR reaction A fluorescent probe (Sybr Green) fixes to double strand DNA, thus the quantity of fluorescence is relative to the quantity of PCR product during the exponential phase of the reaction A cycle threshold is established (Ct) which is used to calculate the quantity of DNA Two types of quantification are possible: 1. Relative quantification: the quantity in all samples in a given experiment is expressed relative to the quantity in a reference sample 2. Absolute quantification where a standard curve is performed with dilutions of a sample of known concentration

30 Samples: Biopsies Peripheral blood Urine Examples: Allomap test to diagnose acute rejection in heart transplant recipients based on the expression of 11 genes in the peripheral blood. To date the only test that has achieved FDA approval is the AlloMap test. Deng et al. Am J Transplant 2006;6(1): A peripheral blood biomarker of chronic antibody-mediated rejection Ashton-Chess et al. J Am Soc Nephrol 2008;19(6):

31 Nouvelles techniques pour mesurer des milliers de protéines simultanément dans un échantillon par spectrométrie. Exemples en Transplantation: Diagnostique du rejet aigu par analyse protéomiques des urines Shaub et al. J Am Soc Nephrol 2004;15(1):219-27

32 FOXP3 + CD25 + cell numbers /µl of blood * * HV CR DF-Tol Sta HV CR DF-Tol Sta 6,6% 2,5% CD25 % FOXP3 on CD4+CD25 high FOXP3 (Braudeau transplantation 2006)

33 Combinaison de données cliniques (age, genre, HLA mismatch etc.) à un temps donné post post transplantation pour prédire le devenir de la greffe à 5 et 10 ans. Ex: Time-dependent receiver-operator characteristic curves. Beaucoup plus prédictif que la créatinémie

34 Brouard et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104(39): Hypothèse: Identifier une signature de la tolérance et chercher cette signature dans le sang périphérique de patients sous IS en vue d arrêter leur IS sans risque.

35 Immunosuppressive drug-free patients Long-term stable graft function without any IS for at least 1 year (mean 8.8+/-4.9) (Cockcroft creatinine clearance > 60 mls/min/1.73m2 with absent or low grade proteinuria <1g/day). IS WITHDRAWAL Créatinemia µmol/l * 10 patients identified throughout France: Roussey-Kessler et al., Am. J. Transplant., years o OP-Tol Sta CR

36 "No higher incidence of opportunist infections" «Slow IS withdrawal» «Young donor age»

37 Towards a blood transcriptional signature of operational tolerance in kidney transplant recipients Chronic rejection: Histological signs of chronic antibody-mediated rejection (TG, C4d +, anti-hla + ). (Solez, Am. J. Transplant, 2007)(Colvin, JASN, 2007). Progressive degradation of their renal function (creatinine clearance < 60 mls/min/1.73m 2 and/or proteinuria >1g/day) Age-matched healthy volunteers: Normal blood formula and no infectious or other concomitant pathology for at least 6 months prior to the study. Long-term stable patients: Stable kidney graft function at > 5 years post-transplantation while under MMF or azathioprine, and maintenance steroids +/- CNI

38 Transcriptional profiling of peripheral blood by microarray 75 patients-16 healthy volunteers 30,000 DNA spots 12,440 genes Blood SAM (vs CR) Microarray Analysis PAM Training Groups Test Groups TOL CR Normal TOL-Test CR-Test MIS Stable AR Number Brouard, Mansfield et al, PNAS, Sep 07

39 Discrimination of operational tolerance and chronic rejection Training group 49 gènes TOL CR 893 genes PAM Tolerance 49 genes Brouard, Mansfield et al, PNAS, Sep 07

40 Recognition of operational tolerance in an independent test group Training group STA Test group TOL-Test TOL CR P(TOL): 99.9% Tolerance 49 gènes CS Bitherapy Brouard, Mansfield et al, PNAS, Sep 07

41 Detection of operational tolerance signature in 12% of stable patients Training group STA Test group TOL-Test TOL CR P(TOL): 99.9% Tolerance 49 gènes CS Bitherapy P(TOL) :99% P(RC) :82% Brouard, Mansfield et al, PNAS, Sep 07

42 Down-regulated 49 Up-regulated 1 Brouard, Mansfield et al, PNAS, In press

43 Testing the predictive power of the tolerance footprint using RT-PCR in independent CR and TOL patients Bitherapy 33 genes (RT-PCR) Chronic dysfunction TOL 1 1 0,9 0,9 sensitivity 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 CR TOL Predicted Test Probabilities 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 CR TOL 0,2 0,2 0,1 0, CR CR TOL STA

44 Tribbles Homolog 1 (TRIB1) Partie I 3 membres TRIB-1, TRIB-2, TRIB-3 Développement embryonaire chez la drosophile (régulateur de la mitose) Tribbles Homolog 1: Protéine nucléaire (42kDa) Inhibiteur du FT AP-1 (Kiss-Toth, Cell Signal. 2006) (Kiss-Toth, J. Biol Chem. 2004) Brevet TRIB-1 and diagnostic of chronic rejection in human kidney transplantation No. 60/808, 122, INSERM TRIB-1 1 est sur-exprim exprimé dans le sang des patients en rejet chronique TRIB1 (relative mrna expression) HI STA+/- IS CR +/- IS * (Ashton-Chess et al., Sumitted)

45 TRIB1 TRIB-1 1 est sur-exprim exprimé dans le sang et les biopsies des patients en rejet chronique humoral Controles Stables (Ashton-Chess et al., Sumitted) ** * C4d+ TRIB Brevet TRIB-1 and diagnostic of chronic rejection in human kidney transplantation No. 60/808, 122, INSERM C4d- C4d- 1 yr *** C4d+ TRIB TRIB-1 1 est sur-exprim exprimé par monocytes/cd activés TRIB1 (fold change) HV Resting Monocytes LPS TRIB-1 1 est sur-exprim exprimé dans les phénom nomènes nes inflammatoires *** Cocktail Spondylarthrite ankylosante TRIB1 idc mdc (LPS) Dendritic cells HV mdc (CD40L) mdc (Cocktail) * Partie I * MS PP/SP rémitente

46 TRIB1 in rodent models of transplantation Clinic Bench DST Chronic rejection Tolerance LEW.1W LEW.1A LF Tolerance (LF) Chronic Rejection (DST) TRIB1 at D100 post transplantation 3 * H&E TRIB1 2 1 Heslan et al. Transplantation LF Tolerance (LF) DST Chronic Rejection (DST) In collaboration with E. Chiffoleau

47 TRIB1 (relative mrna expression) Greffon 3 * TOL (LF) CR (DST) TRIB1 (relative mrna expression) Sang 35 * TOL (LF) CR (DST)

48 Clinical validation Validation of biomarkers at 1 year post-transplantation Blood at 1 year 625 inclusions Biopsy at 1 year Government funding DHOS 2008 Prediction of chronic rejection at 3 months Blood at 3 months (pangenomic microarrays) 300 inclusions Biopsy at 1 year National Grant PHRC 2005

49 And Now? 200 stable patients To identify allograft recipients in whom IS withdrawal could be safely conducted To identify patient with chronic rejection TcLandscape Q-PCR Phenotype Clinical parameters Miqueu et al., 2008 (en préparation) Braud et al., 2007 Sivozhelezov et al Brouard et al., 2007 Baeten et al., 2006 Louis et al., 2006 Braudeau et al., 2007 Hourmant et al., Risk of Rejection Potential for Tolerance +1 Warning Signal for monitoring (new IS regimen, doses escalation, new protocols ) 0 Kidney Score Progressive reduction or withdrawal of IS drugs

50 Prospective, randomized CNI weaning in highly stable renal transplant recipients Double Blind Renal function - Gene expression DSA 1 end point: Improvement in renal function 2 end point: immunological events (rejection etc.) Validation of gene expression biomarkers

51 Acknowledgments INSERM U643, Nantes Jean-Paul Soulillou Sophie Brouard Magali Giral Univ. Of Stanford Minnie Sarwal Elaine Mansfield Li Li Christophe Braud Annaick Pallier Cécile Braudeau Maud Racapé Marina Guillet Catherine Ruiz Dominique Baeten Patrick Miqueu Stéphanie Louis Caroline Ballet Gwenaelle Roussey Alexandre Dupont Thanks to E. Thervet, C. Legendre, JF. Subra, E. Pillebout Anatomy-pathology lab, CHU, Nantes Anne Moreau Karine Renaudin

52 Ce document à été crée avec Win2pdf disponible à La version non enregistrée de Win2pdf est uniquement pour évaluation ou à usage non commercial.

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