Plateforme Transgenèse/Zootechnie/Exploration Fonctionnelle IBiSA. «Anexplo» Service. Cryoconservation/ Décontamination. Catalogue des prestations

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1 Plateforme Transgenèse/Zootechnie/Exploration Fonctionnelle IBiSA «Anexplo» Service Cryoconservation/ Décontamination Catalogue des prestations 20/03/13 - Page 1 sur 10

2 Présentation du service de Cryoconservation/ Décontamination Le service de Cryoconservation/ Décontamination est un service de la Plateforme Transgenèse/Zootechnie/Exploration Fonctionnelle «Anexplo», labellisée IBiSA (Toulouse, Midi-Pyrénées). En plus des prestations purement techniques, le service assure différentes activités de formation : stagiaires, formation nationale (formation continue Inserm), chercheurs et clients du service. Prestations de service proposées Archivage : cryoconservation d embryons cryoconservation de sperme Introduction de lignées : reviviscence de lignées murines décontamination de lignées murines par transfert d embryons décontamination de lignées murines par fécondation in vitro Modèles murins L archivage des modèles murins fait appel à des techniques de congélation lente des embryons au stade 2-cellules, embryons issus d un accouplement naturel ou obtenus par fécondation in vitro. Une méthode alternative de congélation de sperme est proposée pour certains fonds génétiques (hybrides, FVB) et en cours de mises au point pour les autres fonds. Modèles rats Les techniques d archivage de lignées de rats consanguins par cryoconservation sont en cours de développement. Des prestations concernant cet archivage seront proposées prochainement. Sites de Cryoconservation/ Décontamination Localisation et compétences spécifiques Le service de transgenèse est localisé sur plusieurs sites géographiques, le site UMS US006 CREFRE réalise, d une part, en routine les diverses techniques de cryoconservation, décontamination, reviviscence d embryons provenant d embryothèques et, d autre part, assure le développement de nouvelles techniques de cryoconservation, le site IPBS (Institut de Pharmacologie et Biologie Structurale, Rangueil) propose les prestations suivantes : la décontamination, la reviviscence de lignées et la congélation d embryons. Les développements technologiques autour de la cryoconservation et de la dérivation de cellules ES à partir de blastocystes KO font également partie des attributions de ce site. Présentation des sites le laboratoire de cryoconservation de l UMS US006 CREFRE est situé dans le service de zootechnie au sein de la zone protégée. Il est composé : 20/03/13 - Page 2 sur 10

3 de 2 pièces pour l'hébergement de souris (zone EOPS et quarantaine), d'un laboratoire équipé pour la manipulation d'embryons de souris, d une pièce équipée d un Freezal et du matériel pour la congélation de tissus de souris transgéniques (embryons, sperme et ovaires). le site IPBS, situé au sein de la zootechnie, est composé, d une zone animalerie répondant aux normes actuelles et aux exigences de la transgenèse (zone protégée appelée «zone transgénique»), qui comporte deux pièces pour l hébergement des souris nécessaires aux expérimentations, placées sous la responsabilité d'un animalier, D une pièce comprenant un freezal et du matériel pour la congélation de tissus de souris transgéniques (embryons et ovaires), équipement disponible sur réservation aux personnes formées et munies d un badge d accès. Personnel Formé et compétent, présent à temps plein ou en alternance dans des équipes de recherche, le personnel peut répondre aux diverses sollicitations. Le personnel du service participe au travail du réseau national ROCAD dans le groupe de travail WP7 intitulé «Amélioration des techniques d échange et de préservation de lignées de souris» (réseau pour la standardisation et l optimisation des ressources et des compétences existantes au bénéfice de la communauté scientifique). Accès aux prestations du service de Cryoconservation/ Décontamination Le client doit prendre contact avec le service afin de présenter son projet, de choisir l approche technologique la mieux adaptée, les mises au point particulières et d évaluer les coûts et les délais de réalisation. Une fois la prise de contact effectuée, le client doit remplir une fiche de demande de prestation ainsi que les fiches de prestations spécifiques (éventuellement accompagnées d'un devis). Il s engage alors à respecter les conditions de prestation émises par le service pour le bon déroulement de celles-ci. Sur le site web Anexplo, une page «intranet» est accessible aux clients du service de Cryoconservatrion/ Décontamination. Elle permet d accéder aux fiches de demande de prestation ainsi qu aux fiches de prestations spécifiques. Contacts Site web : Pour une meilleure gestion des dossiers, il est recommandé d adresser les fiches complétées par aux contacts suivants, disponibles sur le site web de la plateforme : UMS US006 CREFRE : cryodeconta.us006-crefre@inserm.fr IPBS : gtransgenes@ipbs.fr 20/03/13 - Page 3 sur 10

4 Engagements du service Equipements Le service possède tout le matériel et les équipements nécessaires à la manipulation d embryons, à la réalisation de l archivage et la décontamination de lignées ainsi qu à leur élevage. Les équipements sont surveillés et vérifiés par le personnel et/ou par des sociétés extérieures compétentes par l intermédiaire de contrats de maintenance. Hygiène & Sécurité et éthique Les utilisateurs doivent respecter les règles d hygiène et sécurité. En cas d urgence ou simplement de problème, l utilisateur doit contacter le personnel du service. Stockage des données Les données et dossiers clients sont sauvegardés et archivés à la fois sur support papier et par informatique. Les résultats Les résultats sont retranscrits sur la partie «bilan & résultats» des fiches de prestation. Une fois complétées, ces fiches prestation sont retournées au client et les résultats validés par celui-ci. Tarifs Les prestations réalisées en routine font l objet d une tarification précise, réévaluée chaque année. Des demandes plus particulières peuvent être étudiées et faire l objet de l établissement de propositions plus spécifiques. Publications Les clients s engagent à citer le service dans le paragraphe «remerciements» ou «matériel et méthodes» des publications émanant de résultats obtenus avec ses équipements ou/et l intervention du personnel du service, ainsi que dans tout type de communication (posters et présentations orales). 20/03/13 - Page 4 sur 10

5 Prestations de service Cryoconservation d embryons Principe et méthode L'utilisation de la souris comme modèle expérimental s'est considérablement accrue ces dernières années avec la création d'animaux modèles génétiquement modifiés. Il est donc devenu indispensable de cryoconserver à long terme ces modèles murins très précieux pour des raisons à la fois économiques, sanitaires et génétiques. C'est pourquoi des techniques d'archivage on été développées dès La congélation des embryons se fait au stade 2 cellules. Ils sont obtenus par accouplement naturel. Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f03 Fiche archivage décontamination anexplo/tg/f12 Fiche identité lignée ou anexplo/tg/f14 Fiche identité lignée simplifiée Validation de la demande de prestation par le service Embryons congelés : congélation homozygote : 100 à 200 congélation hétérozygote (1) : 200 à 300 congélation hétérozygote (2) : 200 à 300 (IPBS) congélation hétérozygote (3) : 300 à types de contrôles sont effectués : contrôle in vitro : décongélation de paillettes par lot de congélation et suivi de leur développement jusqu au stade blastocyste (60 à 80 % de blastocystes obtenus). contrôle in vivo : réimplantation d embryons décongelés pour chaque lignée afin d évaluer la capacité à obtenir des nouveaux-nés (au moins 2 nouveau-nés obtenus, dont 1 positif). les souriceaux nés sont génotypés. Réception des produits (fournis par le client) souris Réalisation de la prestation (anexplo/tg/f06 Fiche suivi congélation embryons) congélation des embryons contrôles in vitro et in vivo (souriceaux nés génotypés par le client) Bilan envoyé «bilan et résultats» de la fiche archivage décontamination F03 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des paillettes ou stockage à long terme Validation de la prestation par le client TG/MO09 Engagements du client Nous vous demandons de fournir de vos élevages 5 à 10 mâles en âge de reproduire (âgés de 8 semaines minimum). Les mâles peuvent être homozygotes ou hétérozygotes en fonction du choix d archivage que vous ferez : congélation homozygote : fournir 5 à 10 mâles homozygotes et des lots hebdomadaires de 10 femelles donneuses homozygotes âgées de 3 semaines issus de vos élevages congélation hétérozygote (1) :fournir 5 à 10 mâles homozygotes et les femelles donneuses sauvages sont commandées par le service chez les fournisseurs agréés 20/03/13 - Page 5 sur 10

6 congélation hétérozygote (2) : fournir 5 à 10 mâles hétérozygotes et la quantité de femelles donneuses hétérozygotes nécessaires (environ 40 à 60) congélation hétérozygote (3) : fournir 5 à 10 mâles hétérozygotes et les femelles donneuses sauvages sont commandées par le service chez les fournisseurs agréés Sélection : les souriceaux nés seront génotypés par le client. 20/03/13 - Page 6 sur 10

7 Cryoconservation de sperme Principe et méthode La congélation de sperme lorsqu elle est possible (selon le fond génétique et conservation de la lignée sous forme hétérozygote) est une alternative intéressante à la congélation d embryons car elle évite de nombreux accouplements et réduit considérablement le nombre d animaux utilisés et donc l espace. Le sperme est congelé avec un cryoprotecteur, en paillettes, dans des vapeurs d azote. Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f03 Fiche archivage décontamination anexplo/tg/f12 Fiche identité lignée ou anexplo/tg/f14 Fiche identité lignée simplifiée Contrôles effectués : contrôle par fécondation in vitro : décongélation d une paillette de sperme. Les spermatozoïdes sont mis en contact avec des ovocytes de femelles sauvages du même fond génétique que le mâle. Les embryons obtenus au stade deux cellules sont réimplantés dans des femelles porteuses, les souriceaux nés sont génotypés. Engagements du client Nous vous demandons de fournir de vos élevages 5 mâles qui ont déjà eu des descendants. Les mâles peuvent être homozygotes ou hétérozygotes. Sélection : les souriceaux nés seront génotypés par le client. Validation de la demande de prestation par le service Réception des produits (fournis par le client) souris Réalisation de la prestation prélèvement et congélation de sperme contrôle : décongélation de sperme, fécondation in vitro, réimplantation, obtention des souris (génotypage,par le client) Bilan envoyé (anexplo/tg/f07 Fiche suivi reviviscence) «bilan et résultats» de la fiche archivage décontamination F03 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des paillettes ou stockage à long terme Validation de la prestation par le client TG/MO09 20/03/13 - Page 7 sur 10

8 Reviviscence de lignées murines Principe et méthode Pour limiter au maximum les risques de contamination dans les services de zootechnie, les nouvelles lignées sont introduites par transfert d embryons. Le risque de contamination par cette méthode est très faible. Il s agit, à partir d embryons frais ou congelés, ou de sperme congelé, de faire repartir la lignée sous sa forme respirante. Dans le cas d embryons frais : à réception, les embryons sont lavés dans quelques gouttes successives de milieu M2 et placés en culture dans du milieu M16 jusqu à réimplantation, quelques heures après dans l infundibulum de femelles pseudo-gestantes, Dans le cas d embryons congelés : les embryons sont décongelés le jour de la réimplantation suivant le protocole fourni, lavés dans quelques gouttes successives de milieu M2 et placés en culture dans du milieu M16 jusqu à réimplantation, quelques heures après dans l infundibulum de femelles pseudogestantes. Après sélection par génotypage, les animaux seront transférés dans le service de zootechnie dont dépend le client. Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f03 Fiche archivage décontamination anexplo/tg/f12 Fiche identité lignée ou anexplo/tg/f14 Fiche identité lignée simplifiée Validation de la demande de prestation par le service Commande des souris porteuses Réception des produits (fournis par le client) embryons certificat sanitaire (géniteurs) Réalisation de la prestation (anexplo/tg/f07 Fiche suivi reviviscence) décongélation si embryons congelés contrôle embryons réimplantation obtention des animaux (génotypagepar le client) TG/MO09 Engagements du client Fournir si possible un certificat sanitaire du laboratoire qui expédie les embryons indiquant le statut sanitaire des géniteurs au moment de la congélation. En absence de contrôle ou en cas de présence de virus, un contrôle sanitaire virologique sera fait chez la mère porteuse après sevrage des souriceaux issus de la manipulation. Celui-ci sera à la charge du client. Bilan envoyé «bilan et résultats» de la fiche archivage décontamination F03 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des animaux d intérêt Validation de la prestation par le client Envoi des embryons Dans le cas d embryons frais : les embryons au stade 2 cellules sont envoyés par courrier express dans un tube eppendorf contenant du milieu M2 et entouré de parafilm ; le transport ne doit pas excéder 24h, Dans le cas d embryons congelés (venant d embryothèques comme le Jackson Laboratory ou l EMMA) : les embryons congelés sont reçus conditionnés dans une paillette ou un cryotube, à l intérieur d un container saturé en vapeur d azote type «voyageur»,. Il est impératif que ce container soit scellé (ce qui garantit le maintien de la température pendant le transport). Sélection : les souriceaux nés seront génotypés par le client. 20/03/13 - Page 8 sur 10

9 Décontamination de lignées murines par transfert d embryons Principe et méthode Pour faire rentrer une nouvelle lignée de souris transgéniques avec un statut sanitaire compatible avec celui du service de zootechnie souhaité, ou pour des raisons expérimentales, il est parfois nécessaire de décontaminer la lignée par transfert d embryons. Ceci se fait au stade 1 ou 2 cellules. Les embryons peuvent être obtenus soit : après accouplement dans une zone extérieure à notre service ou sous isolateur (réservation IPBS) avec des mâles fertiles potentiellement contaminés, à partir d embryons frais ou congelés reçu de l extérieur. Conseil : pensez à demander au laboratoire, s il est possible d obtenir des embryons frais ou congelés de la lignée que vous voulez introduire, c est le moyen le plus rapide et le moins coûteux de décontamination. Engagements du client Fournir un certificat sanitaire du laboratoire qui expédie les embryons ou les mâles fertiles pour accouplement. Selon le statut sanitaire des géniteurs, un contrôle sanitaire virologique sera fait ou non chez la mère porteuse après sevrage des souriceaux issus de la manipulation. Celui-ci sera à la charge du client. Envoi des embryons dans le cas d embryons frais : les embryons au stade 1 ou 2 cellules sont envoyés par courrier express dans un tube eppendorf contenant du milieu M2 et entouré de parafilm ; le transport ne doit pas excéder 24h, Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f03 Fiche archivage décontamination anexplo/tg/f12 Fiche identité lignée ou anexplo/tg/f14 Fiche identité lignée simplifiée Validation de la demande de prestation par le service Commande des souris porteuses Réception des produits (fournis par le client) souris transgéniques certificat sanitaire (géniteurs) Réalisation de la prestation récupération des embryons ou récupération du sperme et fécondation in vitro réimplantation obtention des animaux (génotypage par le client) contrôle sanitaire Bilan envoyé (anexplo/tg/f07 Fiche suivi reviviscence) bilan sanitaire «bilan et résultats» de la fiche archivage décontamination F03 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des animaux d intérêt Validation de la prestation par le client TG/MO04 TG/MO06 TG/MO09 dans le cas d embryons congelés (venant d embryothèques comme le Jackson Laboratory ou l EMMA) : les embryons congelés sont reçus conditionnés dans une paillette ou un cryotube, à l intérieur d un «voyageur», container saturé en vapeur d azote. Il est impératif que ce container soit scellé (ce qui garantit le maintien de la température pendant le transport), pour l IPBS, le personnel de la zootechnie prélèvera les oviductes des femelles gestantes hébergées sous isolateur (bouchon vaginal du jour) et les fera passer au service transgenèse qui procèdera dans des conditions stériles, au prélèvement des embryons, à leur lavages et réimplantation dans une femelle pseudogestante EOPS. Sélection : les souriceaux nés seront génotypés par le client. 20/03/13 - Page 9 sur 10

10 Décontamination de lignées murines par fécondation in vitro (FIV) Principe et méthode Pour limiter au maximum les risques de contamination dans les services de zootechnie, les nouvelles lignées sont introduites par transfert d embryons au stade 1- ou 2-cellules. Le risque de contamination par cette méthode est très faible. Les embryons sont obtenus par la technique de fécondation in vitro avec des mâles fertiles. Ces mâles potentiellement contaminés sont hébergés dans une zone extérieure au service, et prélevés suivant une procédure adaptée. Nous vous conseillons en priorité, de développer la production de votre lignée dès sa réception dans la zone d hébergement. Le jour de la FIV, les spermatozoïdes sont mis en contact avec des ovules de femelles «donneuses sauvages» dans notre laboratoire. Le lendemain de la FIV, les embryons au stade 2 cellules sont réimplantés dans des femelles pseudogestantes. Après sélection par génotypage, les animaux seront transférés dans le service de zootechnie dont dépend le client. Engagements du client Fournir 2 mâles fertiles âgés de 3 à 6 mois (qui ont déjà eu des descendants). Fournir un certificat sanitaire du laboratoire qui expédie les mâles. Selon le statut sanitaire des géniteurs, un contrôle sanitaire virologique sera fait ou non chez la mère porteuse après sevrage des souriceaux issus de la manipulation. Celui-ci sera à la charge du client. Premier contact contact par , téléphone, rencontre, échanges, etc. Remise de documents (à remplir par le client et à retourner au service) anexplo/tg/f01 Fiche de demande de prestation anexplo/tg/f03 Fiche archivage décontamination anexplo/tg/f12 Fiche identité lignée ou anexplo/tg/f14 Fiche identité lignée simplifiée Validation de la demande de prestation par le service Réception des produits (fournis par le client) souris ou embryons certificat sanitaire Réalisation de la prestation (anexplo/tg/f07 Fiche suivi reviviscence) bilan sanitaire fécondation in vitro congélation des embryons contrôles in vitro et in vivo ou décontamination, réimplantation contrôle sanitaire TG/MO09 Bilan envoyé «bilan et résultats» de la fiche archivage décontamination F03 complété et envoyé Remise du produit mise à disposition des paillettes ou stockage à long terme Validation de la prestation par le client Sélection : au sevrage, les souriceaux nés seront génotypés par le client. 20/03/13 - Page 10 sur 10