Principe de la microscopie par absorption biphotonique. La microscopie à 2 photons

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1 Principe de la microscopie par absorption biphotonique

2 L optique non-linéaire ou 1 photon + 1 photon = 1photon!

3 Principe de la fluorescence Absorption Emission e 1 > e 2 λ 1 < λ 2 e 2 = hν 2 e 1 = hν 1 Orbitale haute Orbitale basse Noyau Noyau

4 Principe de la fluorescence à 2 photons Absorption de 2 photons infrarouges e 1 < e 2 et e 1 +e 1 > e 2 Emission d un photon visible λ 1 > λ 2 e 2 = hν 2 e 1 = hν 1 e 1 = hν 1 Orbitale basse Orbitale haute Noyau Noyau

5 Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons état excité état excité σ a σ a τ σ s état de base section efficace σ 1ph ~ σ s état de base τ, fenêtre de survie de l état intermédiaire σ 2ph ~ σ s σ a τ 10-16cm cm cm s

6 Absorption Bi-photonique Probabilité d excitation bi-photonique : E2ph = P 2 / (t.f) P = puissance moyenne t = durée d impulsion F= fréquence de répétition Condition nécessaire pour l absorption biphotonique : Une très haute densité en photons que ce soit d un point de vue spatial (concentration par focalisation, objectif à grande ouverture numérique) ou d un point de vue temporel (utilisation d une source pulsée laser femto ou pico seconde)

7 Lasers pulsés temps 10ns 10ns 20 W P 100fs 100 kw P 10ns 100fs Mode continu temps Mode pulsé temps

8 Lasers accordables LASER USUEL milieu dispersif laser miroir Pompe miroir 99/1 LASER ACCORDABLE (690nm à 1015nm) Prisme milieu dispersif laser Pompe miroir 99/1 miroir

9 Lasers pulsés Aspect spectral et gamme d excitation des fluorochromes E Domaine temporel A Domaine spectral T Oscillation continue, absence de localisation temporelle E λ Oscillation continue, forte localisation spectrale A T λ=5 à 8nm Oscillation pulsée, localisation temporelle des impulsions Oscillation pulsée, étalement spectral λ

10 Lasers pulsés Compensateur de largeur d impulsion 150 fs ajustement de la largeur 80 fs P 1 P 2

11 Dispositif de microscopie bi-photonique MAO LASER PULSE INFRA-ROUGE ACCORDABLE ( nm) S LASER DE POMPE VERT UNITE DE BALAYAGE ET DE DETECTION STATIF DE MICROSCOPE

12 L installation de microscopie confocale et bi-photonique du site IAB Source laser pulsée Tsunami/MilleniaVIII Microscope confocal Zeiss LSM510 NLO

13 Effet biphotonique Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons excitation 488 nm solution de FITC cône d illumination (fluorescence!) Spot biphotonique au foyer de l objectif excitation 976 nm objectif x10 cône d illumination (pas de fluorescence)

14 Microscopie photonique 3D Propriétés de sectionnement optique Filtrage confocal Absorption biphotonique AXE OPTIQUE Tache de diffraction en microscopie conventionnelle Eliminer la lumière hors focale Lumière réfléchie - fluorescence Méthodes optiques Solution reposant sur la formation de l image Créer de la lumière uniquement dans le plan focal Fluorescence Méthodes optiques non-linéaires Solution reposant sur l illumination

15 Photodégradation Fluorescence 1 photon excitation 488 nm objectif Fluorescence 2 photons excitation 976 nm gel de FITC émission fluorescente zone photodégradée

16 section xy Photodégradation Zone de photodégradation section xz Fluorescence 2 photons GFP 0,6 µm Plan photodégradé

17 Absorption bi-photonique Visualisation de molécules métaboliques par auto-fluorescence dans des cardio-myocytes en culture in vitro Coupe optique d une fibre myocardique NADH Excitation bi-photonique λ = 714nm Flavoprotéines Excitation mono-photonique λ = 488nm Crédits: K. Guerrero, A. Kuznetsov, Y. Usson

18 Absorption bi-photonique Visualisation de molécules métaboliques par auto-fluorescence Section optique axiale d une fibre myocardique in vitro Coupe XZ 50 µm NADH Excitation bi-photonique λ = 714nm Emission 420nm

19 Absorption bi-photonique Visualisation de molécules métaboliques par auto-fluorescence dans des hépatocytes en culture in vitro NADH Excitation bi-photonique λ = 714nm Flavoprotéines Excitation mono-photonique λ = 488nm Crédits: A. Kuznetsov, Y. Usson

20 Respiration mitochondriale dans des hépatocytes en culture in vitro contrôle substrat DHA découpleur complexe I substrat, octanoate substrat, oléate inhibiteur, roténone 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 NADH FLAVO 0,4 0,2 0 contrôle DHA DNP octanoate oléate roténone

21 Application en milieu turbide Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons excitation 488 nm objectif excitation 976 nm mileu diffusant émission fluorescente

22 Fluorescence 1 photon Fluorescence 2 photons excitation excitation émission émission diffusion raman diffusion raman

23 Résolution 1P vs 2P Absorption à 1P : linéairement proportionnelle à la puissance Distance de résolution à 1P : R 976 nm = 2 x R 488 nm Absorption à 2P : proportionnelle au carré de la puissance Intensité du spot à 976 nm Probabilité d absorption 1P à 976 nm Probabilité d absorption 2P à 976 nm Intensité du spot à 488 nm Probabilité d absorption 1P à 488 nm Distance de résolution : R (2P)976 nm = 1,37 x R (1P)488 nm -0,5 0 0,5

24 Conclusion Avantages de la microscopie à deux photons : Source laser infrarouge : -> grand pouvoir de pénétration dans les tissus faible diffusion et faible absorption -> rayonnement inoffensif pour les cellules vivantes -> accordabilité : autorise l ajustement de l excitation à un grand nombre de fluorochromes Absorption bi-photonique : -> confinement de la photodégradation au niveau du plan focal -> amélioration du rapport signal/bruit dans les coupes optiques sériées -> localisation assurée du photobleaching dans les expériences de FRAP et autres expérimentations reposant sur le photoblanchiment

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