Mesure des effets toxicologiques de nano-oxydes métalliques sur des cellules humaines in vitro NANOMIQUE N S Chevillard CEA DSV ircm
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- Gisèle Grondin
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1 Mesure des effets toxicologiques de nano-oxydes métalliques sur des cellules humaines in vitro NANOMIQUE N S Chevillard CEA DSV ircm
2 Toxicité des NPs métalliques Les nanoparticules métalliques sont très utilisées en chimie, électronique, composites, alimentaires, cosmétiques, applications médicales. Les matériaux TiO 2 p25 MILs : matériaux mésoporeux de l Institut Lavoisier MIL-100(Fe), MIL-100(Al) et Mil-100(Cr) (séparation, catalyse et médecine) Caractérisation physico-chimique Tests à haut débit Analyse mécanistique omique Pour un classement, vers un «safer by design» Modèles alternatifs
3 MILs MIL-100(Cr) linkers trimesate MIL-100(Cr) 25 Å 29 Å Cr C O H 2 O Trimère de Cr MIL-100(Fe) MIL-100(Al) MIL-100(Cr)
4 MILs XRPD patterns of MIL-100(Fe), MIL-100(Al) and MIL-100(Cr) NPs and TEM images
5 Linker dans le milieu (%) HPLC MILs Stabilité colloidale MIL-100(Fe) and (Al) NPs ont des tailles (230 +/-22 et 320 +/-36 nm), un potentiel zeta (-10 mv) similaires et une bonne stabilité colloidale dans les milieux de culture Par contre la mil-100(cr) est plus petite (146 +/-17 nm) et présente une bonne stabilité colloidale dans les deux milieux jusqu à 24h mais s aggrège ensuite dans le milieu MEM avec un potentiel zeta qui diminue de -10 à -4 mv Stabilité chimique Très faible dégradation pour les MIL-100 Fe et Cr dans les deux milieux de culture Par contre, la MIL Al est stable dans le milieu DMEM et instable dans le milieu MEM. Libération progressive du métal
6 MILs Profils d impédance cellulaire en temps réel
7 MILs Internalisation des NPs en cytométrie de flux Calu-3 Survie cellulaire en cytométrie de flux Microscopie confocale MIL-100-Fe fluorophore furazan (ne peut pas pénétrrer seul dans les cellules
8 MILs 2h ROS cytométrie en flux Ph2AX microscopie confocale Cycle cellulaire cytométrie en flux
9 Conclusions MILs les MIL-100(Fe, Al, Cr) NPs n induisent pes de toxicité sur les lignées p53+ (A 549 and Calu-3 (poumon) and HepG2 (foie) la MIL-100(Fe) est légèrement cytotoxique et génotoxique sur la lignée Hep3B p53 mutante à forte dose les différences en termes de taille, stabilité colloïdale et stabilité chimique n influent pas sur la toxicité pour le moment nous ne savons pas expliquer pourquoi la MIL-100(Fe) est plus toxique Singularité des NPs et importance de tester plusieurs types cellulaires Les MILs sont prometteurs pour les applications médicales compte tenu de leur grande capacité d encapsulation
10 Les mécanismes Transcriptome Expression Human Gene Expression 12x135K Arrays Spécifications : - 12 régions de sondes permettant d hybrider 12 échantillons sur une même lame - Chaque région (plex) mesure 8,9 x 6,5 mm - Taille des spots : 13 x 13 µm - 3 sondes par transcrits soit ~ transcrits ciblés Performance : - Testé dans les conditions du projet MAQC (MicroArray Quality Control) - Excellente reproductibilité (>99%) - Excellente concordance entre le microarray et la PCR quantitative (TaqMan)
11 Analyse du transcriptome qualité des ARNms HEK, HT29 et CAKI - 3 tailles SiO2-7, SiO2-25 et Si nm - 2 concentrations : IC10 et IC50-1 hrs après l exposition Nanodrop Profil Bioanalyzer d Agilent HEK : 1h Control SiO2-7 SiO2-25 SiO2-100 HT29 : 1h Controls SiO2-7 SiO2-25 SiO2-100 Caki:1h Control SiO2-7 SiO2-25 SiO h
12 Analyse du transcriptome Contrôle-qualité des hybridations Hek293 NimbleScan : - Analyse des intensités brutes : mesure du signal spécifique par rapport au bruit de fond
13 Analyse du transcriptome Contrôle-qualité des hybridations HEK293 SiO2 Box Plots : Normalisation des signaux par l algorithme RMA : Permet de rendre les signaux directement comparables entre les plex Corrélations de Pearson : Excellentes corrélations au sein des tripliquats 13
14 Analyse du transcriptome Vulcano plots Fold-change > 2 et p-value < 0,05 SiO2-7 vs 0 SiO2-25 vs 0 SiO2-100 vs IC IC50 14
15 Analyse du transcriptome Tableau bilan des listes de gènes Résultats de l analyse compilés dans un tableur Excel GeneTable : Tableau de transcrits (lignes) contenant les résultats des analyses statistiques GeneTable_RegOnly : Tableau qui ne contient que les transcrits UR ou DR Possibilité de filtrer les transcrits en fonction des colonnes STAT (ou STAT FDR) Annotations Résultat de l analyse statistique 15
16 Analyse du transcriptome LCE Adsorption non spécifique des ARNs sur les NPs Les logiciels commerciaux ne détectent pas ces biais! HEK SiO2 25 nm 2h HEK 293 NDCOOH 2h
17 Modèle Tridimensionnel Introduction Lignée A549, Culture interface air-liquide, milieu identique Structure jamais détruite une fois formée
18 Modèle Tridimensionnel Entretien, Étude Croissance continue et prolongée Étude possible sur plusieurs semaines / mois Adapté à un grand nombre d analyses histologie biologie cellulaire biologie moléculaire
19 Limite de la membrane Modèle Tridimensionnel Histologie Hématoxyline Éosine Bleu Alcian E-cadhérine KI 67
20 Modèle Tridimensionnel Histologie Microscopie électronique à transmission
21 Modèle Tridimensionnel Étude moléculaire Marqueurs de différenciation
22 Modèle Tridimensionnel Épithélium pulmonaire glandulaire, polarisé Pôle apical, structure pseudo-alvéolaires, activité sécrétrice Microvillosités, Surfactant / Mucus Différenciation Pôle basal, stratifié Modèle conforme aux recommandation européennes Pour l étude progression tumorale et réponse aux traitements toxicité de composés inhalés
23 Conclusions Les MILs 100 sont prometteuses pour les applications médicales Les TiO2 p25 ne sont ni cytotoxiques ni génotoxiques Un modèle 3D utile pour -la nanotox : épithélium stratifié, présence de cellules différenciées et de cellules de type souche, sécrétion de mucus humain -cancérologie, notamment pour tester des nanos pour radiosensibiliser et véhiculer de la chimiothérapie
24 Remerciements CEA DSV LCE Romain Grall Vincent Paget Sandrine Morel Krsitell Bastide CEA DRT Laboratoire Capteur Diamant Jean-Charles Arnault Hugues Girard Institut Lavoisier CNRS Patricia Horcajada Programme de Recherche Environnement Santé Travail A common European approach for the regulatory testing of nanomaterials
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