Physique avec les systèmes vivants... et avec de l optique.

Dimension: px
Commencer à balayer dès la page:

Download "Physique avec les systèmes vivants... et avec de l optique."

Transcription

1 Physique avec les systèmes vivants... et avec de l optique. Antoine DELON : enseignant-chercheur au Laboratoire Interdisciplinaire de Physique Microscopie optique pour la biologie (biophotonique) antoine.delon@ujf-grenoble.fr

2 Plan La microscopie optique La microscopie de fluorescence La microscopie confocale Les mesures associées La super-résolution

3 Plan La microscopie optique La microscopie de fluorescence La microscopie confocale Les mesures associées La super-résolution

4 Les microscopes simples et composés The first well known users were van Leeuwenhoek and Hooke. Van Leeuwenhoek used a single lens microscope, Hooke used a compound microscope. The instruments used by Van Leeuwenhoek were far superior to those of Hooke, due to the fact that lens corrections were unknown at the time and the compound microscopes used by Hooke added the lens faults of ocular and objective. So it was Van Leeuwenhoek who made the most discoveries, also due to his sharp eyesight and his unfailing curiosity. Un microscope-loupe de Van leeuwenhoek Un microscope composé

5

6 Comment voir, avec une caméra CCD? Quel grandissement, quelle taille de pixel et combien de pixels?

7 Une limite (presque!) infranchissable :

8

9 d d

10 Considérons un objectif 60 d ouverture numérique 1. Au centre du spectre visible la tache de diffraction d un point source, a donc une taille, sur le capteur d une caméra CCD d environ : 0,6λ/ON G obj = 0,6 0,5 µm / 1 60 = 18 µm Les caméras CCD actuelles ont des pixels (carrés) de taille comprise typiquement entre 6 et 24 µm de côté. Un capteur de pixels couvre donc une zone de l échantillon comprise entre µm / 60 = 100 µm et µm / 60 = 400 µm

11 Plan La microscopie optique La microscopie de fluorescence La microscopie confocale Les mesures associées La super-résolution

12 La fluorescence, plus exactement la photoluminescence, est l émission d un rayonnement lumineux par suite de l absorption d un rayonnement incident (de longueur d onde plus courte) ; par exemple le papier, éclairé par de l uv (lumière noire), émet une lumière bleutée (cf. Laser Game!).

13 La microscopie de fluorescence est une microscopie fonctionnelle, car elle permet de localiser des molécules, de visualiser des compartiments cellulaires, de révéler un état cellulaire etc, grâce à des molécules ou particules fluorescentes. Elle impose donc en général un marquage en fluorescence des objets observés (même si l auto ou endo fluorescence existent).

14

15 Multi-Wavelength Immunofluorescence microscopy

16 Fluorescence de molécules organiques Diagramme de Jablonski

17 Exemple de spectres d absorption et d emission

18 Green Fluorescent Protein (GFP)

19

20 Nanocristaux fluorescents (quantum dots)

21 Lampe à arc au mercure Cube de fluorescence

22 Imagerie de molécules uniques immobiles (ADN) par microscopie à onde évanescente Cylindrical telescope Excitation λ = 633 nm z lock-in Detection DNA strands labelled with Alexa 647

23 Molécules fluorescentes attachées sur la surface de verre Lame de verre ou de quartz Brin d ADN attachés sur la surface Brin d ADN complémentaire, marqué par des fluorophores, se liant au brin d ADN attaché à la surface

24 Photobleaching of molecules anchored on a substrate s 5-10 s s 0 10 µm Individual Alexa 647 molecules Intensity (counts) T i m e ( s ) s 4-5 s 9-10 s µm cdna strands, labelled with several Alexa647 Intensity (counts) E x p o n e n tia l m o d e l τ m o y = 4.2 s T im e (s ) 1 2 3

25 Schematics of the experimental setup. A low concentration of fluorescent ligands is introduced in the extracellular medium such that a constant rate of membrane molecules is being labeled during the imaging sequence. Oblique illumination of the sample is used to excite predominantly fluorescent ligands that have bound to the cell surface while not illuminating the molecules in the above solution. Biophys J. 99, p1303 (2011)

26 Imagerie de molécules uniques, en mouvement Real-Time Single-Molecule Imaging of the Infection Pathway of an Adeno-Associated Virus Quelques trajectoires d'un virus AAV, marqué avec de la cyanine (80% des virus marqués avec une seule Cy) : diffusion in solution (1 and 2) ; touching at the cell membrane (2) ; penetration of the cell membrane (3) ; diffusion in the cytoplasm (3 and 4), penetration of the nuclear envelope (4), and diffusion in the nucleoplasm

27 Plan La microscopie optique La microscopie de fluorescence La microscopie confocale Les mesures associées La super-résolution

28 Deux problèmes dus aux échantillons épais : (en plus de la diffraction)

29 Deux problèmes dus aux échantillons épais : (en plus de la diffraction) A cause de la diffusion, des rayons sont déviés et forment un flou autour des points images.

30 Deux problèmes dus aux échantillons épais : (en plus de la diffraction) A cause de la diffusion, des rayons sont déviés et forment un flou autour des points images. Les points sources situés en dehors du plan de mise au point, donnent des rayons qui forment des tâches dans le plan de détection (dues à la profondeur de champ).

31 M. Minsky avait proposé (1957) d illuminer l échantillon en un seul "point" et de collecter uniquement la lumière qui vient de ce point, à travers un sténopé ou "pinhole" (centré sur l image de ce point). Détecteur ponctuel Aujourd hui, on reconstitue l image point par point de l objet, en balayant celui-ci avec un faisceau laser.

32 µ-scope confocal = laser (balayage) + pinhole Conchello et Lichtman 2005

33 La microscopie de fluorescence plein champ est caractérisée par une relativement grande profondeur de champ, càd par une faible résolution selon z. En éclairant l objet point par point avec un faisceau laser on améliore la résolution en z : c est la microscopie confocale. Plein champ Confocal

34

35 Remarque : M.Minsky n avait pas réalisé l importance de la possibilité de réaliser des coupes optiques. En combinant un faisceau laser avec un pinhole, l extension longitudinale de l image d un point (la réponse impulsionnelle ou PSF) est considérablement diminuée en microscopie confocale. z r PSF plein champ PSF confocale Curieusement, c est une invention plus moderne (totalement inimaginable à l époque de Minsky), la microscopie à 2 photons, qui permet, grâce à l utilisation d un laser de très grande puissance instantanée, de limiter considérablement la diffusion de la lumière ainsi que ses effets.

36 Microscopie à 2 photons z Aire du faisceau Intensité sur l'axe Intensité 2 sur l'axe Pas de pinhole! L'absorption de 2 photons simultanés nécessitant une grande densité d'énergie é.m., celle-ci se fait uniquement au foyer de l'objectif.

37 Microscopie à 2 photons J.C. Vial, P.Vérant Laboratoire de Spectrométrie Physique, UJF J. Coles et al. INSERM, Neuro-Imagerie Fonctionnelle et M étabolique La lumière de longueur d onde double (2λ) est 2 4 fois moins diffusée (diff. Rayleigh) Projection verticale d une pile d images acquises in vivo de 150 à 300 µm sous la dure mère (par pas de 2 µm) dans le corte x d une souris Nude 48h après radiothérapie par microfaisceaux. Les quantités de colorants injectés sont: 100 µl d une solution de 100 mg.ml -1 de FITC-dextran et 50 µl une solution de 5 mg.ml -1 de sulforhodamine B. La coloration des capillaires en jaune p rovient de l'émission simultanée des 2 colorants alors que les "boules rouges" sont des corps cellulaires (vraisemblablement des astrocytes) qui ont capté le colorant diffusible uniquement lorsqu'ils ont subit l'irradiation X ( ici sous forme de surdosagen 3 bandes horizontales)

38 J.C. Vial, B. van der Sanden, et al. Spectro (UJF-CNRS) Coupe histologique (de 10 µm d'épaisseur) de muscle de la cuisse de souris. Les noyaux sont colorés par le Hoechst excité par absorption à 2 photons et la structure fibreuse est du collagène (de type 1 ou 2), visualisée par génération de second harmonique. La luminescence est détectée par épi-collection ("vers l'arrière"), alors que le second harmonique est détecté "vers l'avant". Microscopie optique non linéaire

39 Plan La microscopie optique La microscopie de fluorescence La microscopie confocale Les mesures associées La super-résolution

40 Biophys J. 99, p1303 (2011)

41 transport (d = v t) Le suivi de particules uniques d (m) t (s) diffusion (<r 2 > = 4D t) Science 294 p1929 (2001)

42 La diffusion est un processus aléatoire (marche au hasard) ; On ne peut pas définir une vitesse car celle-ci dépend du temps, ou de la distance, sur lequel elle est mesurée : "v" = "v" = r 2 t r 2 t 4Dt t r 2 1/ t 1/ r 2 /4D r 2 C'est un mécanisme très important pour les organismes vivants (transport de O 2 )

43 Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP): mobility (diffusion, interactions) Reits EA & Neefjes JJ. Nat Cell Biol. 3:E145-7 (2001)

44 Sprague et al.

45 Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS): number density and effective "diffusion" constant (viscosity, particle sizes, interactions, etc.) PNAS 104 p20320 (2007)

46

47

48 First measurements with actin-gfp living cells G(τ) G(τ) τ (µs) τ (µs) 1,015 1,010 G(τ) 1,005 1, τ (µs)

49

50 Fluorescence Resonance Energy Transfert

51 k T Donneur Accepteur Excitation λ exc, D Fluorescence λ fluo, D 1/τ D Excitation λ exc, A Fluorescence transférée λ fluo, A ecfp eyfp

52 Platform Optical Microscopy - Cell Imaging, IAB IFR73 - Fluorescence lifetime imaging (FLIM) (A. Grichine, C. Vourch) TCSPC 1000 Fluorescence Decay Curves Time, ns DyOGen Inserm U ns 1.6 ns 2.1 ns

53 Plan La microscopie optique La microscopie de fluorescence La microscopie confocale Les mesures associées La super-résolution

54 La super résolution A priori, les microscopes optiques ne permettent pas ne résoudre (i.e. de voir) des objets plus petits qu une fraction de la longueur d onde lumineuse : 0,61λ/ON ~ 0,25 µm Si on connaît bien la forme de la tache d Airy, on peut remonter à la position des points source, avec une précision >> largeur de la tache d Airy. Signal Largeur du spot S/B >> 1 Position

55 Les méthodes PALM (ou STORM) Photoactivated localization microscope (PALM) Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) Ces méthodes consistes à combiner une bonne connaissance de la tache d Airy (ou de la PSF) et à faire en sorte que les PSF des différentes molécules ne se recouvrent pas trop. Resolution limitations of traditional optical microscopes lead to blurry images of small cellular components such as mitochondria. However, if specific proteins are tagged with fluorescent molecules that can be activated one-ata-time, the positions of the molecules can be determined at a much finer level. The total position data is then assembled into an image at a resolution comparable to an electron microscope, but with the added benefit of being specific to only the desired target protein.

56 Premier montage «PALM» Betzig, Hess et al, 2006

57 La microscopie STED Il est possible, en utilisant un processus physique appelé émission stimulée (processus mise en œuvre dans le fonctionnement d un laser), de réellement réduire la taille du plus petit volume qui peut être adressé avec le faisceau laser de balayage d un microscope confocal.

58 Faisceaux à 532 nm et 355 (YAG triplé) Un seul faisceau à 532 nm (YAG doublé)

59 La microscopie SPIM La technique Single Plane Illumination Microscopy, consiste à éclairer un échantillon uniquement dans plan dont on est en train de faire l image, puis à recommencer avec un autre plan d illumination / acquisition, le tout avec différentes orientations de l échantillon. Cela permet de préserver l échantillon vis à vis des effets de phototoxicité, d adapter l épaisseur du plan à la nature de l échantillon et aux objectifs de l étude et d avoir une PSF plus sphérique.

60