ÉPIDÉMIOLOGIE ET DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES DERMATOPHYTOSES

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1 ÉPIDÉMIOLOGIE ET DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES DERMATOPHYTOSES Copyright des illustrations : Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, Faculté de Médecine de Montpellier-Nîmes. Objectifs pédagogiques - Connaître l'épidémiologie (écologie, kératinolyse, «terrain» favorisant, modes de contamination, «contagiosité») des dermatophytoses, et les noms des Dermatophytes le plus fréquemment isolés en Europe. - Connaître les différentes formes cliniques des dermatophytoses. Savoir reconnaître une lésion évocatrice d'une épidermophytie, d'une teigne et d'un onyxis dermatophytique. - Connaître les principes et modalités des différentes techniques mises en œuvre dans le cadre du diagnostic biologique des dermatophytoses, notamment celles que le clinicien doit exiger du laboratoire (prélèvement de qualité, examen direct correctement effectué, cultures). Savoir ainsi prescrire et interpréter les examens de laboratoire nécessaires au diagnostic d'une dermatophytose cutanée ( = «épidermophytie»), d'une teigne et d'un onyxis dermatophytique. - Connaître l intérêt de la recherche d une fluorescence sous rayonnement ultra-violet dans le diagnostic de certaines dermatophytoses. - Dans le cadre du diagnostic biologique des dermatophytoses, reconnaître la prééminence de la mise en évidence, par l examen direct, du Champignon à l état «parasitaire». - Dans le cadre du diagnostic biologique des dermatophytoses, connaître les modalités d isolement et d identification des Champignons par culture mycologique. - Savoir ce que le clinicien est en droit d'attendre du laboratoire (confirmation de la dermatophytose, précision du mode de contamination par l'identification du Dermatophyte, révélation d'une association de plusieurs Champignons sensibles à des thérapeutiques différentes) et dans quels délais. - Connaître les principes du traitement des dermatophyties et les indications de l'éviction scolaire en cas de teigne (législation). Plan de cours I - INTRODUCTION...2 I.1 - Dermatophytes... 2 I.2 - Dermatophytoses... 3 I Onychomycoses dermatophytiques... 3 I Dermatophytoses de la peau glabre... 5 I Teignes... 5 I Folliculites suppurées... 6 II - RECHERCHE D UNE FLUORESCENCE SOUS RAYONNEMENT ULTRA-VIOLET («LAMPE DE WOOD»)...8 III - PRÉLÉVEMENTS...8 IV - EXAMEN DIRECT...10 IV.1 - Examen direct «à frais» IV.2 - Examen direct après coloration V - CULTURES...11 V.1 - Isolement V.2 - Identification... 14

2 I - INTRODUCTION Pour le clinicien, les buts du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéophanériennes sont : - confirmer la mycose, ou, au contraire, sur la base d une réponse négative, réorienter le diagnostic ; - identifier l'(ou les) agent(s) fongique(s) incriminé(s) et adapter au mieux la thérapeutique ; - comprendre la pathogénie de la mycose et amoindrir (voire supprimer) les facteurs favorisant son développement. Dans ce cadre, la démarche mise en oeuvre par le laboratoire est influencée par : - la symptomatologie clinique ; - les facteurs épidémiologiques inhérents au patient ; - le «terrain» immunitaire sous-jacent. D une manière générale, le diagnostic biologique d'une dermatophytose repose sur : - la révélation d'une éventuelle fluorescence sous rayonnement ultra-violet de certaines lésions fongiques du cuir chevelu ou de la peau ; - la mise en évidence du (ou des) Champignon(s) à l'état parasitaire par examen direct du produit biologique prélevé ; - l isolement et l identification de ce(s) Champignon(s) par cultures. L'évaluation de la sensibilité in vitro du Champignon à divers antifongiques («antifongigramme») est exceptionnellement justifiée et n a que très peu d intérêt en pratique courante. Ni la recherche d anticorps spécifiques, ni celle d'antigènes fongiques circulants ne sont justifiées dans le cadre du diagnostic des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes. La biologie moléculaire (détection de Champignons dans le matériel biologique, identification spécifique ) reste encore actuellement du domaine de la recherche. L ordonnance prescrivant l examen mycologique d'une dermatophytose sera donc rédigée ainsi : «Examen mycologique d une lésion de : prélèvement, examen direct et cultures (isolement et identification)». L éventuelle recherche d une fluorescence sous lampe de Wood pourra être mentionnée si elle n a pas été effectuée par le clinicien. I.1 - Dermatophytes Le vocable de «Dermatophytes» désigne en fait un groupement artificiel de Champignons filamenteux «imparfaits» (ou Deutéromycètes), kératinolytiques, appartenant, d après la classification la plus largement utilisée (Emmons, 1934), aux trois genres : Epidermophyton, Microsporum et Trichophyton (lorsqu elles sont connues, leurs formes sexuées sont classées dans le genre Arthoderma, au sein de l Ordre des Onygénales). Les Dermatophytes, comme toutes les Onygénales, peuvent dégrader des protéines fibreuses diverses et possèdent, en particulier, des enzymes kératinolytiques. Si la plupart des espèces sont terricoles et ubiquistes, certaines (saprobiontes) décomposent les kératines dispersées dans le milieu extérieur (poils, cornes, plumes...) et peuvent occasionnellement se révéler «pathogènes» (Ex. : M. gypseum). D'autres dégradent aussi bien la kératine vivante que la kératine morte (Ex. : T. mentagrophytes). Quelques-unes ne sont connues que strictement sous forme parasite de l'homme et des animaux (Ex. M. canis, en particulier chez le jeune Chat et l'enfant). Parmi ces dernières, certaines sont inféodées à l'homme (Ex. E. floccosum, M. audouini, T. rubrum, T. schoenleini, T. soudanense, T. violaceum). Résistantes, les spores des Dermatophytes sont présentes dans l environnement : sur le sol, dans la terre, dans le pelage des Mammifères, sur des objets divers La contamination se fait par voie directe (inter-humaine, animale ou tellurique) ou indirecte (vêtements et chaussures, instruments de toilette et de coiffure, parterres d établissements sportifs et tapis de salles de gymnastique, bords de piscines de loisirs ou de rééducation, bacs de douches, matériels agricoles, outils, instruments de

3 soins aux animaux, cages d animaux domestiques, stalles, enclos, etc ). On peut ainsi citer quelques exemples classiques de contamination : contacts entre chevelures dans les collectivités d enfants et teignes trichophytiques (T. violaceum, T. soudanense, ) ; promiscuité avec un jeune Chat et lésions cutanées circinées et/ou teigne microsporique à M. canis ; Hamster ou Cobaye sur l épaule et lésion cutanée circinée, voire folliculite suppurée du cou (T. mentagrophytes) ; jardinage et lésion cutanée circinée à M. gypseum ; échanges de chaussures ou de vêtements dans les clubs sportifs (T. rubrum, ) ; spores de Trichophyton spp. anthropophiles sur les tondeuses de certains coiffeurs ; spores de T. verrucosum sur les stalles d élevages bovins et folliculites suppurées L installation et le développement des Dermatophytes sur leurs hôtes sont conditionnés par des facteurs généraux (âge, ) et locaux de défense. Actuellement, ils sont grandement favorisés par les divers savons et topiques, par la diffusion des antibiotiques antibactériens, par l excès d utilisation des corticoïdes, et par la multiplication des cas d immuno-déficience. L implantation d un Dermatophyte nécessite une «permissivité» locale de l épiderme, du follicule pilaire ou de la matière unguéale, et en première intention, l ouverture d une «porte d entrée» : égratignure (outil de jardinage, peigne, brosse, ), griffure (Chat, Hamster, ), macération (notamment au niveau des petits plis), absence pré-pubertaire de sécrétion sébacée (teignes de l enfant), microtraumatismes unguéaux (marche «sportive», danse classique, tennis, ), Une fois le Dermatophyte implanté, ses possibilités de filamentation, puis de dissémination, sont tributaires du niveau de défenses, notamment cellulaires, que peuvent lui opposer la peau et les phanères. Un déficit, même transitoire, de l immunité cellulaire locale est donc un facteur favorisant la dermatophytose. Mais un sidéen ne présente pas plus de risques qu un immuno-compétent de «rencontrer» un Dermatophyte, même si les lésions cutanéophanériennes développées sur ce terrain immunodéprimé semblent classiquement plus florides. Ces Dermatophytes déterminent ainsi des pathologies cutanéo-phanériennes nommées dermatophytoses. Celles-ci atteignent surtout la peau et les ongles et, actuellement plus rarement, le cuir chevelu et la région de la barbe. I.2 - Dermatophytoses Les dermatophytoses sont liées au parasitisme de la peau et des phanères par certains Dermatophytes dont les plus fréquemment isolés en Europe sont actuellement : T. rubrum (65 %), T. mentagrophytes (15 %), M. canis (10 %). Tous les Dermatophytes peuvent envahir la peau et les ongles, alors que seulement quelques-uns attaquent les cheveux et les poils. Les formes cliniques selon la localisation sont actuellement dans l'ordre de fréquence : - les onychomycoses, en particulier des orteils; - les dermatophytoses de la peau glabre; - les teignes; - les folliculites suppurées. Très exceptionnellement, un terrain profondément immunodéprimé permet la dissémination viscérale (maladie dermatophytique). I Onychomycoses dermatophytiques Elles touchent beaucoup plus souvent les ongles des orteils (en particulier le premier et le cinquième) que ceux des doigts (souvent contaminés par grattage d'une autre lésion dermatophytique). La lésion débute au bord libre de l'ongle ou au niveau du sillon latéro-distal. L évolution se fait vers l onycholyse avec dyschromie et hyperkératose sous-unguéale. L envahissement de la table de l ongle détermine une onychodystrophie. Le diagnostic différentiel le plus fréquent est le psoriasis. Le Dermatophyte habituellement impliqué est T. rubrum, parfois T. mentagrophytes. En fait, tout Dermatophyte peut être isolé. La fragilisation de l'ongle pendant de longs mois (même sous traitement) favorise la colonisation secondaire par d'autres Champignons filamenteux (opportunistes comme Scopulariopsis brevicaulis et Fusarium spp.).

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5 I Dermatophytoses de la peau glabre On entend par «peau glabre» le revêtement cutané dépourvu de poils et de cheveux. A l'exception des paumes des mains et des plantes des pieds, elle est néanmoins porteuse d'un fin duvet, y compris chez le jeune enfant. Toute surface du tégument peut être le siège de ces lésions plus ou moins prurigineuses. Cependant, trois grandes entités cliniques sont individualisées : * La dermatophytose cutanée circinée (Syn. désuet : herpès circiné) est une lésion érythématovésiculo-squameuse de croissance centrifuge rapide, généralement due à T. rubrum ou M. canis. Une forme tropicale due à T. concentricum, particulièrement extensive, est dite dermatophytose imbriquée (tokelau). Sous nos climats, T. rubrum peut déterminer une dermatophytose polymorphe diffuse. * La dermatophytose inguino-crurale (anciennement : eczéma marginé de Hebra) est une localisation particulière de la précédente. Souvent unilatérale et due essentiellement à T. rubrum, parfois T. mentagrophytes, elle débute sur la face supéro-interne de la cuisse. En se chronicisant, elle demeure asymétrique par rapport au pli inguinal, peut se bilatéraliser, et même gagner le périnée et le pli inter-fessier. * Les dermatophytoses des extrémités, dues aux mêmes Dermatophytes, sont plus fréquentes aux pieds qu'aux mains. La dermatophytose interdigitoplantaire (ou «pied d'athlète») débute le plus souvent par une fissure à bords blanchâtres décollés au niveau du quatrième espace, et gagne progressivement la plante, le dos du pied et les autres espaces par contiguïté. L'atteinte unguéale secondaire survient fréquemment. Il est important de différencier, grâce à l'examen mycologique, la véritable dermatophytose des mains, interdigitale et/ou palmaire, d'autres dermatoses vésiculo-squameuses palmo-plantaires (disydrose ou psoriasis par exemple), mais également de réactions allergiques à distance de lésions dermatophytiques des pieds, se manifestant par des vésicules dysidrosiques, prurigineuses, mais ne renfermant pas de Champignon. Bien souvent sont associées chez un même patient, lésions inguino-crurale, interdigito-plantaire et onychomycose, en particulier lorsque l'agent causal se révèle être T. rubrum. I Teignes Progressivement devenues rares actuellement, ces dermatophytoses du cuir chevelu se subdivisent en trois entités anatomo-cliniques : microsporiques, trichophytiques et favique. Localisation particulière d'une dermatophytose cutanée, elles évoluent soit vers une colonisation de la tige pilaire (teignes tondantes : microsporiques, trichophytiques), soit vers une importante prolifération au niveau de l'ostiole, puis une propagation dans le derme (favus). * Les teignes tondantes microsporiques sont caractérisées par des zones arrondies, squameuses et prurigineuses, où les cheveux sont cassés à 3-4 millimètres du cuir chevelu. Les Champignons impliqués sont M. canis, M. audouini langeroni et M. gypseum. * Les teignes tondantes trichophytiques sont souvent de diagnostic clinique plus difficile. Dans les plaques squamo-croûteuses confluentes, les cheveux sont ou cassés très courts au ras du cuir chevelu, ou contournés, inclus dans l'épaisseur des squames. Les principales espèces responsables sont : T. violaceum, T. soudanense et T. tonsurans. * La teigne favique, devenue exceptionnelle de nos jours en Europe occidentale, est cliniquement polymorphe : forme classique avec godets, formes impétigoïde, pityriasique, cicatricielle... Son évolution, chronique, aboutit à une alopécie cicatricielle définitive. Elle est due à T. schoenleini.

6 N.B. : En fait, un consensus s est instauré entre la grande majorité des épidémiologistes, mycologues et cliniciens thérapeutes en faveur d une attitude moins coercitive en matière d éviction scolaire, notamment en ce qui concerne les teignes seiches microsporiques, le plus souvent d origine féline et peu contagieuses d enfant à enfant. Reste au législateur à actualiser les textes I Folliculites suppurées Certains termes, désuets de nos jours, permettaient de distinguer quelques formes topographiques : sycosis (ou mentagre) de la région de la barbe ou du cou, kérion de Celse du vertex ou de la nuque. Au plan anatomo-clinique, les pustules folliculaires du sycosis tendent à s'agglomérer et essaimer à distance. Celles du kérion constituent un macaron inflammatoire surélevé, rouge vif, bien délimité, ponctué d'orifices folliculaires dilatés. En fait, toutes les formes intermédiaires peuvent exister, et d'autres formes topographiques sont actuellement fréquentes (jambes...). Les Dermatophytes généralement isolés sont T. mentagrophytes, T. verrucosum et T. violaceum. Par ailleurs, l'évolution de certaines teignes tondantes peut également se faire vers la suppuration.

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8 II - RECHERCHE D UNE FLUORESCENCE SOUS RAYONNEMENT ULTRA- VIOLET («LAMPE DE WOOD») Les voies biochimiques utilisées par certaines espèces particulières de Dermatophytes pour dégrader les molécules organiques constitutives de la peau et des phanères (notamment la kératine) aboutissent à la présence, dans les tissus colonisés, de substances spontanément fluorescentes sous un rayonnement ultra-violet d'une fréquence donnée. L'examen de ces dermatophytoses ainsi «éclairées» à l'aide de la lampe de Wood peut révéler cette fluorescence, et donc fortement étayer le diagnostic positif de mycose. La teinte de la fluorescence oriente vers un type de Champignon (éventuellement vers un diagnostic différentiel non mycologique). L'étendue des zones cutanées fluorescentes permet un bilan d'extension de l activité du Champignon et guide le geste de prélèvement en vue de l'examen mycologique proprement dit. Toutefois, l'absence de fluorescence nette n'infirme en rien le diagnostic de mycose. En pratique courante, cet examen para-clinique fait donc partie intégrante du diagnostic de certaines dermatophytoses. Une fluorescence verte sous rayonnement ultra-violet des petits cheveux cassés courts est en effet un argument majeur du diagnostic de certaines teignes tondantes microsporiques, notamment des teignes à Microsporum canis (également à M. audouini langeroni) et, plus accessoirement en Europe, du favus à Trichophyton schoenleini. Ce sont, bien entendu, ces petits cheveux fluorescents qui seront prélevés en priorité en vue de l'examen mycologique. Pour en savoir plus D'autre part, au cours de toute lésion microsporique de la peau (dermatophytose circinée à Microsporum), le duvet peut être colonisé par le Champignon, de la même manière que le cheveu au cours des teignes, notamment en périphérie des lésions. De plus, c'est au niveau des poils follets et duvets que les Dermatophytes, en particulier les Microsporum, subsistent après un traitement insuffisant. Leur fluorescence doit donc être systématiquement recherchée (bien qu'inconstante si le poil, trop fin, est peu parasité). A noter : la fluorescence rouge sous rayonnement ultra-violet d'une lésion cutanée inguinocrurale oriente le diagnostic vers un érythrasma, lésion due à une Bactérie du genre Corynebacterium. III - PRÉLÉVEMENTS En fait, les dermatophytoses peuvent ressembler à d'autres dermatoses cutanéo-phanériennes (eczéma nummulaire, psoriasis, pelade...). Pour éviter les erreurs diagnostiques, et donc les échecs thérapeutiques, l'examen mycologique s'impose. De l'efficacité du geste de prélèvement et de la quantité du matériel biologique prélevé dépend le succès des étapes ultérieures du diagnostic mycologique. Les prélèvements doivent être effectués avant tout traitement antifongique par voie générale ou en application locale. Les précautions d'usage de stérilité visent, entre autres, à éviter la contamination du matériel biologique par les Bactéries, mais également par des Levures ou des Champignons filamenteux présents dans le milieu extérieur ou à l'état saprobiontique chez le patient : conditions optimales d'asepsie, stérilité du matériel de prélèvement et de recueil Le matériel stérile utilisé pour le prélèvement est fonction du type et de la localisation de la lésion et du produit biologique à recueillir : écouvillon humidifié au moyen d un peu de liquide physiologique stérile, curette de Brocq fenêtrée, scalpel mousse (c'est à dire non aiguisé) ou vaccinostyle, pinces à épiler, ciseaux fins, pinces et ciseaux à ongles, bistouri d'harouet (ou Punchbiopsy ),

9 Les prélèvements doivent être abondants et effectués essentiellement dans la zone de multiplication du Champignon. Les produits biologiques prélevés sont : * les squames (scalpel mousse, curette de Brocq) * les cheveux, poils et duvets (pinces à épiler) * les fragments d'ongles et la matière sous-unguéale (scalpel mousse, curette de Brocq) * le pus des folliculites (écouvillon) Pour en savoir plus Il convient d'insister sur le fait que, pour ce type de prélèvements, l'utilisation de l'écouvillon est un pis-aller. Il ne doit, en aucun cas, être utilisé seul pour les lésions du cuir chevelu, les folliculites suppurées, les atteintes unguéales, les lésions cutanées sèches. Cette mauvaise pratique est la cause de la plupart des fausses négativités. Ces dernières entraînent alors l'abandon du traitement antifongique envisagé par le praticien sur l'épidémiologie et l'aspect clinique de la lésion, et retardent le diagnostic, déterminant ainsi un préjudice certain, notamment dans les cas de teignes et de lésions suppurées (risque de dissémination à l'entourage, cicatrices). D autre part, l'application de cellophane adhésive n'a, en pratique, aucun réel intérêt en mycologie. Au contraire, elle est souvent la cause de la fausse négativité de l'examen. Les modalités du prélèvement dépendent de la lésion, de son siège, de son aspect. L'important est de récupérer, en chaque site prélevé, un maximum de matériel pour un examen direct abondant, des cultures efficaces, éventuellement un nouvel examen direct et de nouvelles cultures en cas de «doute». En pratique, suivant les différents types de lésions cutanéo-phanériennes, il est souhaitable d'obtenir : - une trentaine de squames (ou plus, si possible) prélevées, au-dessus d'une boîte de Petri entr ouverte, avec un scalpel mousse ou une curette, sur le relief vésiculeux périphérique d une lésion circinée (le centre, squameux, est en voie de guérison), en périphérie d une fissure interdigitoplantaire, - au moins une quinzaine de cheveux ou poils parasités, prélevés à la pince en exerçant une légère traction. Les poils parasités n'offrent aucune résistance, alors qu'il est inutile d'insister sur un poil ne venant pas spontanément. Si la lésion est suppurée, une gouttelette de «pus» sourd au niveau de l'ostiole, à recueillir sur un écouvillon humidifié avec du liquide physiologique stérile. Au cours des teignes «endothrix», les cheveux sont très fragilisés, augmentés de diamètre, cassés très courts ou enfouis et contournés dans les squames. Lors des teignes microsporiques, les cheveux parasités sont souvent fluorescents sous rayonnement ultra-violet et cassés à quelques millimètres au-dessus du cuir chevelu (sensation de «petite brosse» au toucher), car soutenus par les gaines épithéliales (aspect blanchâtre). - un maximum de fragments d'ongles et de matière sous-unguéale. En cas d'onychomycose sous-unguéale, il faut recueillir, à l'aide d'un scalpel et/ou d'une curette, toute la matière sousunguéale, jusqu'à la limite de décollement de la tablette, cette limite signant le front d'avancée du Champignon (les derniers fragments prélevés renferment les filaments les plus jeunes). Seule la présence de taches de leuconychie superficielle justifie le prélèvement de fins copeaux réalisés par grattage au scalpel de la surface de la tablette unguéale, ou du matériel finement crayeux obtenu en creusant chaque plaque blanchâtre avec une curette. Le conditionnement et le transport de ces produits biologiques se font en récipients stériles (tubes, flacons, petites boîtes de Petri, ) bien fermés. L ajout de quelques gouttes de liquide physiologique stérile à l écouvillon est conseillé pour éviter la dessication. Les fragments de tissus (biopsies, ) destinés à l'examen mycologique doivent être conditionnés dans du liquide physiologique stérile, sans fixateur, totalement séparés de ceux, fixés, destinés à l'anatomopathologiste. D une manière générale, la longue survie à sec et à température ambiante des Champignons dans les squames, cheveux et poils, fragments d ongles et de matière sous-unguéale permet un envoi à distance sans risque de détérioration. Le produit biologique ainsi prélevé sera ensuite partagé en deux parties sensiblement égales par le laboratoire pour effectuer en parallèle examen direct et culture.

10 IV - EXAMEN DIRECT Il s'agit, bien évidemment, de l'examen direct du matériel prélevé, et non de l'examen microscopique des produits de la culture! Dans le langage courant, cette évidence est pourtant loin d'en être une pour tout le monde... Cet examen direct, technique indispensable pour mettre en évidence le Dermatophyte sous un «état parasitaire», apporte en quelques minutes (alors que l'éventuelle croissance en culture et l'identification peuvent prendre plusieurs semaines) la preuve formelle de la dermatophytose. A elle seule, en effet, la positivité de l examen direct permet d impliquer un (ou plusieurs) Champignon(s) dans le processus pathologique en révélant, par exemple, la présence de filaments de Dermatophyte dans les squames, les fragments d ongles En cas de positivité de l examen direct, le diagnostic de mycose sera bien évidemment maintenu, même si les cultures restent ultérieurement négatives Pour en savoir plus Cette négativité des cultures s explique par l affaiblissement du Champignon du fait de l'ancienneté de l'infestation ou de traitements itératifs mais insuffisants. Ainsi, environ le tiers des diagnostics de mycose cutanéo-phanérienne, la moitié de ceux d'onychomycose dermatophytique des pieds, n'est porté que sur le seul examen direct! ou sont souillées par d'autres spores «contaminantes» présentes sur ou dans le matériel biologique prélevé. Pour en savoir plus Exemple de spores «contaminantes» : spores de Penicillium spp. qui germent au contact du milieu de culture. Le mycélium envahit alors la gélose, inhibant la croissance du Champignon attendu, aussi bien par compétition spatiale que par excrétion de molécules antifongiques. Un examen microscopique minutieux de la morphologie des éléments fongiques dans les produits biologiques permet de préciser le(s) type(s) de Champignon(s) impliqué(s). Il oriente ainsi son (leur) identification ultérieure par cultures. De plus, la constatation de la coexistence de plusieurs types de mycélium permet la détection de fréquentes associations. Pour en savoir plus Exemples d association : Dermatophyte + Levure dans les squames des lésions interdigitoplantaires ; Dermatophyte + opportuniste dans la matière sous-unguéale lors d onyxis «chronicisés» du fait de la non-efficacité de nombre d'antifongiques sur les opportunistes. Deux modalités d examen direct peuvent être mises en œuvre : IV.1 - Examen direct «à frais» L examen direct «à frais» se pratique directement sur le produit biologique, sans fixation ni coloration spécifique. Il est facilité par l utilisation d éclaircissants (p. ex. : lactophénol d'amann). Sont ainsi, par exemple, examinés les cheveux, poils et duvets (filaments intra-pilaires, spores endo- ou ectothrix), occasionnellement les squames très fines (filaments).

11 IV.2 - Examen direct après coloration Une des principales colorations utilisées en mycologie, la coloration en rose «fuchsia» foncé selon la technique de Hotchkiss-MacManus (HMM), adaptée de la coloration P.A.S. (acide periodique, réactif de Schiff) des histo-pathologistes, est particulièrement indiquée pour mettre en évidence les filaments des Dermatophytes dans les squames, les fragments d ongle et la matière sous-unguéale, et de certains Champignons opportunistes (Scopulariopsis brevicaulis, Fusarium spp., ) dans les ongles. Pour en savoir plus En présence d'acide periodique (du latin per : au-delà, et du grec iodês : violet [d où : iode] et non «périodique», du grec peri : autour de, et odos : chemin), les groupements hydroxyle des complexes polysaccharidiques des parois des cellules fongiques sont oxydés en aldéhydes. Agissant comme des réducteurs, les aldéhydes ainsi formés réagissent avec le réactif fuchsine-sulfureux de Schiff. V - CULTURES Le but des cultures est le développement et l isolement de colonies qui permettront l'identification du (ou des) Champignon(s) impliqué(s). Le résultat de cette identification doit être corrélé à l'image observée à l'examen direct. Autrement dit, le(s) Champignon(s) qui «pousse(nt)» doi(ven)t être celui (ceux) attendu(s) d'après le résultat de l'examen direct. V.1 - Isolement L isolement se fait par ensemencements pratiqués de façon stérile, classiquement sur tubes de gélose glucosée (2 %) de Sabouraud, contenant des antibiotiques antibactériens et des vitamines (en ayant soin de conserver une quantité suffisante de matériel biologique pour l'examen direct s il n a pas encore été effectué). L'adjonction de cycloheximide (Actidione ) dans une partie des milieux permet d'inhiber la croissance d'éventuels Champignons contaminants (mais, attention! il inhibe également celle de certaines Champignons opportunistes impliqués en pathologie humaine, notamment unguéale ). Pour en savoir plus Les exigences métaboliques de nombreux Dermatophytes nécessitent toutefois l'utilisation de géloses de culture conditionnées : - en grands tubes contenant au moins 20 ml de milieu refroidi incliné, de façon à ce que la pente soit la plus longue possible, s'arrêtant à 3 cm du bouchon, pour une aération maximale, le bouchon étant vissé à fond; - en boîtes de Petri de 9 cm de diamètre, contenant 30 ml de milieu pour optimiser la place disponible pour les colonies fongiques.

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14 Les milieux ainsi ensemencés sont conservés à 27 C au moins trois semaines avant que les cultures soient considérées comme négatives. En cas de positivité, se développeront en une à trois semaines (parfois plus pour certaines espèces) des colonies dont la forme, la consistance et la couleur, variables, seront des critères macroscopiques d identification des Dermatophytes. Ces délais de croissance, également véritables critères d identification, conditionnent, bien entendu, le délai de réponse définitive de la part du Laboratoire. Par ailleurs, la négativité des cultures (souvent du fait de prises antérieures d'antifongiques) n'infirme bien évidemment pas le diagnostic (en particulier quand l'examen direct est positif) et n'a aucune valeur de guérison d une dermatophytose précédemment prouvée tant que l'examen direct reste positif. V.2 - Identification L'identification de l espèce de Dermatophyte impliquée permet d adapter la thérapeutique et, souvent, de préciser le mode de contamination. Elle se fait sur des caractères morphologiques (macro- et microscopiques) et/ou physiologiques (vitesse de croissance, besoins vitaminiques,...). Le milieu glucosé d'isolement de Sabouraud favorise la croissance du mycélium des Dermatophytes, mais non leur sporulation. Or, en pratique, la morphologie microscopique des organes de reproduction asexuée est le critère majeur d identification spécifique de ces Champignons filamenteux. Il est donc nécessaire de repiquer les colonies sur des milieux d'identification non glucosés qui stimuleront la fructification des organes sporigènes et des spores (p. ex. micro- et macroconidies). Pour en savoir plus Les principaux milieux d identification des Dermatophytes et des Champignons filamenteux opportunistes utilisés en pratique courante par les mycologues sont : le milieu «Pomme de terre- Carotte», le milieu Lactritmel de Borelli, la gélose au malt et la gélose au Maïs ou corn meal agar. Les principaux critères d identification des Dermatophytes sont : - le délai d apparition des colonies et la vitesse de leur croissance ; - les caractères macroscopiques des colonies : forme (plane, bombée, cérébriforme, ), consistance (poudreuse, duveteuse, cotonneuse, dure, élastique, ), couleur (recto et verso), ; - les caractères microscopiques : mycélium (diamètre, régularité, ramifications, arthrospores, chlamydospores, ), macro- et microaleuriospores (abondance, dimensions, morphologie, échinulation, segmentation, ), ornementations du mycélium (nœuds, vrilles, chandeliers, ).

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16 * * * L essentiel Parasitisme de la peau et des phanères par les Dermatophytes (kératinolytiques) Onychomycoses dermatophytiques - Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Dermatophytoses de la peau «glabre» (dermatophytose cutanée circinée; dermatophytose inguino-crurale; dermatophytose interdigito-plantaire) - Trichophyton rubrum, T. mentagrophytes, Microsporum canis, Teignes du cuir chevelu (teigne tondante microsporique à M. canis, ; teigne tondante trichophytique à T. violaceum, T. soudanense, T. tonsurans, ; teigne favique) Foliculites suppurées dermatophytiques (sycosis, kérion, ) T. mentagrophytes, T. verrucosum, T. violaceum, Fluorescence verte des lésions de teigne tondante microsporique à M. canis, sous rayonnement ultra-violet (lampe de Wood) Modalités de prélèvement adaptées, examen direct (à frais ou après coloration - mise en évidence du Dermatophyte dans la peau et/ou les phanères - Pose de manière formelle le diagnostic, quel que soit le résultat ultérieur des cultures), cultures (isolement, identification - délai : 2 à 4 semaines) * * *