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1 bulletin 2001/1 SLBC 2001 p. 6

2 Bulletin de la Société Luxembourgeoise de Biologie Clinique n 1 SOMMAIRE Conseil d Administration de la S.L.B.C. et Comité de rédaction du Bulletin 6 Répertoire des annonceurs.. 7 MICROBIOLOGIE Laboratory diagnosis of HIV infection: role of combined HIV p24 antigen and antibody assays par Bernard WEBER 9 21 ième Journée Nationale de Biologie Clinique MARQUEURS TUMORAUX du Samedi 22 septembre 2001 au Centre Culturel Prince Henri à Walferdange Utilisation rationnelle des marqueurs tumoraux Dr. Georges GILSON.. 18 La thyroglobuline en tant que marqueur tumoral Jean Paul HOFFMANN. 19 Les marqueurs urinaires du cancer de la vessie A. De BOURCY.. 20 Syndromes neurologiques Paranéoplasiques Pr. René Louis HUMBEL. 21 MICROBIOLOGIE/IMMUNOLOGIE Diagnostic des infections à papillomavirus Pr. Bernard WEBER 22 L Interaction moléculaire d un anticorps avec un antigène peptidique M. PUTZ.. 23 Demande d adhésion à la S.L.B.C.. 24 Instructions de la rédaction 25 SLBC 2001 p. 7

3 LABORATORY DIAGNOSIS OF HIV INFECTION: ROLE OF COMBINED HIV P24 ANTIGEN AND ANTIBODY ASSAY Bernard Weber Laboratoires Réunis Kutter-Lieners-Hastert, Luxemburg und Institut für Med. Virologie, Universitätskliniken Frankfurt SUMMARY Although HIV antibody assays have achieved a high quality standard, there is still a residual risk for blood donor screening and laboratory diagnosis of HIV infection due to the diagnostic window prior to seroconversion. Atypical courses with delayed antibody response, genetic variability of HIV and laboratory errors are unusual sources of false negative results. Additional HIV antigen testing or nucleic acid amplification from individual samples is not performed or performed only in certain centers due to technical and financial limitations. Combined HIV p24 antigen and antibody assays have been developed in recent years by the diagnostic industry. Combined HIV assays are rarely used for blood donor screening because of the low sensitivity of the antigen detection module and their impaired specificity in comparison to third generation EIAs. New assays with a detection limit of HIV p24 Ag below 10 pg/ml and improved specificity will be licensed this year. They will represent an alternative to separate antigen and antibody testing for laboratory diagnosis and to nucleic acid amplification assays from (mini)pools of blood donor samples. KEY WORDS Primary HIV infection, diagnostic window, HIV-1 RNA, HIV Ag, Nucleic acid amplification test (NAT) INTRODUCTION Since the first enzyme immunoassays (EIA) for blood donor screening and laboratory diagnosis of HIV infection were licensed over 15 years ago, the quality of these tests has been continuously improved by the use of recombinant antigens and synthetic peptides (second test generation), and the sandwich EIA technology (third test generation) (Figure 1). There is however a residual risk for false-negative results (Table 1). The potential causes include the diagnostic window in the pre-seroconversion phase, genetic variability, atypical seroconversions, delayed or absent immune response in the advanced stages of infection, and laboratory reporting errors. The prevalence of HIV-1 group M non-b subtypes (subtypes A-J) and HIV-2 infections are increasing relatively quickly in Europe. HIV-1 Group O infections remain a rarity. The epidemiological significance of HIV-1 Group N, described only recently, is not yet known (1). The genetic variability represents a challenge in particular for the early detection of HIV infection. In the seroconversion phase, false-negative results or delayed detection of antibody response are observed in infections with HIV-1 non-b subtypes and HIV-2 (1, 2). In recent years, the sensitivity for detection of HIV-1 non-b subtypes has been optimized. However, seroconversion samples with HIV-1 non-b subtypes are difficult to obtain in order to permit an extensive evaluation of the sensitivity of newly developed tests. Atypical seroconversions with delayed immune response are rare, but the exact frequency is unknown (3). Individual cases of HIV-antibody-negative infections, which were described in the late 1980 s and early 1990 s (4), could not be confirmed by monitoring of high-risk SLBC 2001 p. 8

4 Table 1: HIV Blood Donor Screening and Laboratory Diagnosis: Sources of Error false negative results Genetic variability: p24ag anti-hiv EIA NAT (PCR) Diagnostic window: anti-hiv EIA (p24 Ag) false positive results Interferences: p24ag anti-hiv EIA Contamination: NAT Inhibition, aliquoting effect: NAT HIV RNA (Plasma) HIV p24 Ag HIV Comb. Assay (4th Gen. EIA) 3rd Gen EIA 2nd Gen EIA 1st Gen EIA Days after Exposure Figure 1: Diagnostic window of specific markers of HIV infection groups and blood donor screening with nucleic acid amplification tests (NAT). These were artefacts caused by PCR contamination or false-positive cell culture results. False-negative results are occasionally observed in the late stages of HIV infection (5). The diminishing immune response to various epitopes of the virus and the formation of immune complexes are possible explanations for the limited sensitivity of HIV antibody assays in patients with advanced HIV infection (6). Such cases may not be relevant to the reliability of HIV laboratory diagnosis or blood donor screening, since these patients are usually known or clinically conspicuous. SLBC 2001 p. 9

5 The frequency of errors in laboratory testing provided that all specifications are met for correct laboratory diagnostics, starting with blood sampling up to availability of results is relatively small, at approximately 0.1 % (7). Over 90 % of the risk of a false negative result starts in the pre-seroconversion phase in the primary HIV infection (diagnostic window). The residual risk of an HIV infection by a seronegative blood donor during the acute HIV infection is estimated to be 1/493,000 1/ in healthy, unpaid donors in the United States and Germany (8). In emergency department patients and in high-risk groups, it ranges between 0.14 and 0.17 % (9, 10). The time interval between point of infection and detection of a seroconversion using third-generation antibody assays averages 22 days (Figure 1). In the primary HIV infection, a localized viral replication (eclipse) takes place first, and lasts for approximately 10 days. In exceptional cases, it can last for many months (Figure 2). Experiments conducted in the animal model indicate that the HIV-infected subject is not infectious during this phase of the incubation period (11). In the subsequent viremic phase, HIV RNA is the first and only detectable virus-specific marker for 1-5 days (Figures 1 and 3), followed by HIV p24 Ag. Peak values of over 10 8 HIV-1 RNA copies/ml plasma are reached before seroconversion (12). During the viremic phase, infectivity is very high due to disseminated replication, the high viral load, and the fact that the immune response is still absent. Early detection of HIV infection is important for reasons of infection security, prevention, and individual prognosis. An antiretroviral combination therapy during primary HIV infection reduces the likelihood of a rapid progression to the AIDS stage. Moreover, the frequency of opportunistic infections, skin and mucous membrane diseases, as well as respiratory infections, is reduced (13). Exposure Seroconversion Localized viral replication NAT Eclipse Viremia NAT Detection Weeks after Infection Figure 2: Diagnostic window and nucleic acid amplification REDUCING THE DIAGNOSTIC WINDOW NAT and HIV Ag detection make it possible to reduce the residual risk of blood and blood products, and to improve the early detection of primary HIV infection in high-risk groups. The following options are possible, in theory: (i) (ii) (iii) NAT from a single donation and antibody screening NAT from a single donation without antibody screening NAT from minipools and antibody screening SLBC 2001 p. 10

6 (iv) Separate HIV p24 Ag and antibody screening in the individual donation HIV RNA (Plasma) Concentration HIV p24 Ag HIV-Ab (v) Days after Exposure Combined HIV p24 Ag and antibody screening in the individual donation Figure 3: Kinetics of virus-specific parameters in the course of a primary HIV infection (i) With NAT testing, the diagnostic window is reduced by 50 % (11 days, Figure 1) and the residual risk is reduced by over 50 %. In theory, all potentially infectious viral carriers are excluded using the NAT technique, because no infectivity is observed during primary infection in the animal model before appearance of HIV-1 RNA (12). The advantages of NAT are offset by its technical limitations. The automated processing of large numbers of samples, especially nucleic acid extraction, is not possible at this time or it is possible only with limitations. Using the methods established so far, the sensitivity for HIV-1 B and non-b-subtypes differs (14), HIV-2 and HIV-1 Group O are not amplified using different commercial methods. The detection limit of NATs varies according to sample and batch. Fluctuations of up to a factor of 30 have been observed with commercial tests (8). In up to 5 % of cases, the lower detection limit is not reached, and the test batch must be repeated. Despite methods to eliminate amplificates, there is a risk of contamination. In a prospective study to optimize the laboratory diagnosis of primary HIV infection, falsepositive results were observed more frequently with NAT than with the p24 antigen assay (15). (ii) NAT cannot be used as a standalone method for the laboratory diagnosis and screening of blood donors, because false-negative results are observed in infected subjects with a low viral load independent of the HIV-1 subtype (16). (iii) HIV-1 RNA amplification is currently performed from pooled donors in European blood banks as a more cost-effective alternative to single-sample testing (17). A decisive factor for the sensitivity of nucleic acid detection is the pool size and the sensitivity of NAT. With mini-pools of 10 samples and a detection limit of 200 copies of HIV-1 RNA/ml, the diagnostic window is reduced by 9.8 days (44 %) compared with antibody determination, approximately 2 days later than with single sample testing (18). With a pool size of 100, the time advantage is 7.8 days compared with antibody determination. A total of 2.5 days are gained as compared with p24 antigen detection. By testing larger pools and/or using less sensitive NAT, the gain in sensitivity is low compared with HIV p24 Ag testing. SLBC 2001 p. 11

7 However, NAT is more cost-effective in pools than antigen determination in individual donations (19). (iv) Separate HIV Ag and antibody screening in the individual donation is carried out systematically in a few European countries and in the United States during blood donor screening. Although the technical and financial cost is lower than for NAT in individual donations, the efficiency of this strategy in relation to the cost/benefit analysis is questioned (9). (v) Fourth-generation HIV screening assays that make combined HIV Ag and antibody detection possible in one test batch have been licensed since 1997 (20-26). These combined assays offer the advantage of early detection of HIV infection via Ag detection at a more or less equal technical burden and financial cost as with HIV antibody testing using third-generation EIAs. COMBINED HIV AG AND ANTIBODY DETERMINATION: STATE OF THE ART ( ) Five different combined HIV p24 Ag and Ab assays (fourth-generation HIV EIA or HIV combined assay) have been licensed in Europe since Approximately one-third of the solid phase is coated with monoclonal antibodies for HIV p24 Ag detection. The remaining binding capacity is available for antibody detection (sandwich or indirect EIA). With the exception of one test kit, the HIV combined assays exhibit a relatively high detection limit of the HIV antigen module (> 30 pg p24 Ag/ml, Table 2). For this reason, they cannot substitute single antigen determination with sensitive commercially available EIAs (detection limit: 3 5 pg/ml, Table 2) (27, 28). Using HIV combined assays the diagnostic window is reduced by 4-5 days as compared with antibody detection alone (Figure 1). HIV-1 subtypes and HIV-2 are detected with a different, usually lower, sensitivity than with single p24 antigen assays. Different combination assays detect only partly HIV-1 Group O and HIV-2 strains in low dilutions (21, 24). Since approximately one-third of the binding capacity for antibody detection is not available, there is a risk with HIV combined assays of a second diagnostic window in the transition phase between the declining p24 antigen level and a beginning seroconversion. In extreme cases, the antibody activity is so low that the measured absorbance lies in the threshold range (Figure 4). False-negative results in the course of a primary infection have not yet been described for HIV combined assays, however. In possibly very rare, atypical courses with seroconversion before p24-ag can be detected, the primary infection is detected earlier with the third generation EIA than with the HIV combined assay due to the higher sensitivity of the antibody alone test (Figure 5). SLBC 2001 p. 12

8 4. Gen HIV EIA 3. Gen HIV EIA 3. Gen HIV EIA HIV-1 p24 Ag EIA Index s/co cut-off Day of Blood Sampling Figure 4: Example of a primary HIV infection with borderline results from the HIV combined tests with beginning seroconversion SLBC 2001 p. 13

9 Table 3: Initial specificity of 4th generation HIV screening assays Assay Collective Number of samples tested No. of false positive results Author Enzymun-Test HIV Combi Blood donors % Gürtler et al Enzygnost Integral Blood donors % Brust et al VIDAS HIV DUO High risk population 29, % Ly et al Table 3: Sensitivity of 4 th generation assays in comparison to single HIV p24 Ag assays Test Name 4th Gen. EIAs VIDAS HIV DUO Ultra (Biomérieux) AxSYM HIV Ag HIV O Plus (Abbott) HIV-Ag-Ab Combination Assay (Murex) Cobas Core HIV Combi (Roche Diagn.) VIDAS HIV DUO (Biomerieux) Enzygnost HIV Integral (Dade-Behring) Vironostika HIV Uni-Form II Ag/Ab (Organon Teknika) Genscreen Plus HIV Ag-Ab (Biorad) * Enzymun-Test HIV Combi (Roche Diagn.) HIV Ag Elecsys HIV Ag (Roche Diagn.) Coulter HIV Ag (Coulter) VIDAS HIV p24ii (Biomerieux) HIV AG-1 Monoclonal (Abbott) Detection Limit pg p24 Ag/ml Licensed PEI or CE * * * 9/ * * 1991 SLBC 2001 p. 14

10 4. Gen. EIA (Test 1) 4th Gen. EIA (Test 2) 3. Gen. EIA HIV1 p24 Ag 4. Gen. EIA (Test 3) PCR 20 Index s/co cut-off 0 Day after Blood Sampling Figure 5: Seroconversion with atypical course of HIV antigen and antibody COMBINED HIV AG AND ANTIBODY DETERMINATION: NEW DEVELOPMENTS The first EIAs of the second generation of HIV combination assays with increased sensitivity and improved specificity will be licensed in the course of the current year. The HIV Ag detection limit is below 10 pg p24 Ag/ml. As-yet unpublished results show that, with a fourth-generation EIA with a detection limit of 3.3 pg/ml, the time difference compared with NAT is about 2 days. A further HIV combined assay with a highly sensitive antigen module exhibited an initially reactive specificity of % in 3550 unselected blood donors. The comparative third-generation comparison assay achieved a specificity of only %. These initial, yet-unpublished results show that these new HIV EIAs may represent an alternative to separate antigen determination in the diagnostic laboratory and blood donor screening, and possibly to NAT in (mini-) pools. REFERENCES 1. Apetrei C, Loussert-Ajaka I, Descamps D, Damond F, Saragosti S, Brun-Vezinet F, Simon F. Lack of screening test sensitivity during HIV-1 non-subtype B seroconversions. AIDS 1996; 10: Christiansen CB, Jessen TE, Nielsen C, Staun-Olsen P. False negative anti-hiv-1/hiv- 2 ELISAs in acute HIV-2 infection. Vox Sang 1996; 70: Burin des Roziers N, Coste J, Courouce A, Bibollet-Ruche F, Guillard A, Nasr O. Detection of HIV-1 RNA in two consecutive blood donations screened negative for HIV antibodies. Vox Sang 1998; 75: Imagawa DT, Lee MH, Wolinsky SM, et al. Human immunodeficiency virus type 1 infection in homosexual men who remain seronegative for prolonged periods. N Engl J Med 1989; 320: SLBC 2001 p. 15

11 5. Weber B. Multicenter evaluation of the new automated Enzymun-Test anti HIV 1+2+ subtype O. J Clin Microbiol 1998; 36: Ascher DP, Roberts Ch, Fowler A. Acidification modified p24 antigen capture assay in HIV seropositives. J Aquired Immune Defic Syndr 1992; 5: Report of the Interorganizational Task Force on Nucleic Acid Amplification Testing of Blood Donors. Nucleic acid amplification testing of blood donors for transfusiontransmitted infectious diseases. Transfusion 2000; 40: Aubuchon JP, Birkmeyer JD, Busch MP. Cost-effectiveness of expanded human immunodeficiency virus-testing protocols for donated blood. Transfusion 1997; 45: Clark SJ, Kelen GD, Henrard DR, Daar ES, Craig S, Shaw GM, Quinn TC. Unsuspected primary human immunodeficiency virus type 1 infection in seronegative emergency department patients. J Infect Dis 1994; 170: Ly TD, Edlinger C, Vabret A. Contribution of combined detection assays of p24 antigen and anti-human immunodeficiency virus (HIV) antibodies in diagnosis of primary HIV infection by routine testing. J Clin Microbiol 2000; 38: Murthy KK, Henrard DR, Eichberg JW, Cobb KE, Busch MP, Allain JP, Alter HJ. Redefining the HIV-infectious window period in the chimpanzee model: evidence to suggest that viral nucleic acid testing can prevent blood-borne transmission. Transfusion 1999; 39: Van Gemen B, Kievits T, Schukkink R, van Strijp D, Malek LT, Snooknanan R, Huisman HG, Lens P. Quantification of HIV-1 RNA in plasma using NASBA during HIV-1 primary infection. J Virol Meth 1993; 43: Berrey MM, Schlaker T, Collier AC, Shea T, Brodie SJ, Mayers D, Coombs R, Krieger J, Chun TW, Fauci A, Self SG, Corey L. Treatment of primary human immunodeficiency virus type 1 infection with potent antiretroviral therapy reduces frequency of rapid progression to AIDS. J Infect Dis 2001; 183: Triques K, Coste J, Perret Jl et al. Efficiencies of four versions of the Amplicor HIV-1 Monitor test for quantification of different subtypes of human immunodeficiency virus subtype 1. J Clin Microbiol 1999; 37: Daar ES, Little S, Pitt J, Santangelo J, Ho P, Harawa N, Kerndt P, Glorgi JV, Bai J, Gaut P, Richman DD, Mandel S, Nichols S, Los Angeles County Primary HIV Infection Recruitment Network. Diagnosis of primary HIV infection. Los Angeles County Primary HIV Infection Recruitment Network. Ann Intern Med 2001; 134: Barlow KL, Tosswill JHC, Parry JV, Clewley JP. Performance of the Amplicor human immunodeficiency virus type 1 PCR and analysis of specimens with false-negative results. J Clin Microbiol 1997; 35: Roth WK, Weber H, Seifried E. Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations for hepatitis C virus, hepatitis B virus, and HIV-1 in a blood bank setting. Lancet 1999; 353: Le Corfec E, Le Pont F, Tuckwell HC, Rouzioux C, Costaglioa D. Direct HIV testing in blood donations: variation of the yield with detection threshold and pool size. Transfusion 1999; 39: Quinn TC, Brookmeyer R, Kline R, Shepherd M, Paranjape R, Mechendale S, Gadkari DA, Bollinger R. Feasibility of pooling sera for HIV-1 viral RNA to diagnose acute primary HIV-1 infection and estimate HIV incidence. AIDS 2000; 14: Gürtler L, Mühlbacher A, Michl U, Hofmann H, Paggi GG, Bossi V, Thorstensson R, Villaescusa RG, Eiras A, Hernandez JH, Melchior W, Donié F, Weber B. Reduction of the diagnostic window with a new combined p24 antigen and human immunodeficiency virus antibody screening assay. J Virol Meth 1998; 75: Ly, T D, Laperche S, Couroucé AM. Early detection of human immunodeficiency virus infection using third- and fourth-generation screening assays. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20: Portincasa P, Grillo R, Pauri P, Colao MG, Valcavi PP, Speziale D, Mazzarelli G, De Majo E, Varaldo PE, Fadda G, Chezzi C, Dettori G. Multicenter evaluation of the new SLBC 2001 p. 16

12 HIV DUO assay for simultaneous detection of HIV antibodies and p24 antigen. New Microbiol 2000; 23: Weber B, Fall EMB, Berger A, Doerr HW. Reduction of Diagnostic Window by New Fourth- Generation Human Immunodeficiency Virus Screening Assays. J Clin Microbiol 1998; 36: van Binsbergen J, Keur W, Siebelink A, van de Graaf FM, Jacobs A, de Rijk D, Nijholt L, Toonen J, Gürtler LG. Strongly enhanced sensitivity of a direct anti-hiv-1/-2 assay in seroconversion by incorporation of HIV p24 ag detection: a new generation vironostika HIV Uni-Form II. J Virol Meth 1998; 76: van Binsbergen J, Siebelink A, Jacobs A, Keur W, Bruynis F, van de Graaf M, van der Heijden J, Kambel D, Toonen J. Improved performance in seroconversion with a 4 th generation HIV antigen/antibody assay. J Virol Meth Yerly S, Simon F, Perrin L. Early diagnosis of primary HIV infections: using a combined screening test (p24 antigen and anti-hiv antibodies). Schweiz Med Wochenschr 1999; 27: Laperche S, Maniez-Montreuil M, Couroucé AM. Screening tests combined with p24 antigen and anti-hiv antibodies in early detection of HIV-1. Transfus Clin Biol 2000; 7 Suppl.1: S18-S Weber B, Mühlbacher A, Michl U, Paggi G, Bossi V, Sargento C, Camacho R, Fall EMB, Berger A, Schmitt U, Melchior W. Multicenter evaluation of a new rapid automated HIV antigen detection assay. J Virol Meth 1999; 78: SLBC 2001 p. 17

13 UTILISATION RATIONELLE DES MARQUEURS TUMORAUX Georges Gilson Laboratoire de Biochimie-Immunopathologie Centre Hospitalier de Luxembourg Il y a une quinzaine d'années, le domaine émergeant des marqueurs tumoraux donnait lieu à un vif intérêt de la part des biologistes et à de grands espoirs de la part des cliniciens et patients. Même si les expériences initiales concernant la spécificité et la sensibilité de la plupart de ces marqueurs ne se sont pas réalisées, l'utilisation judicieuse de ces tests combinée à une interprétation informée des résultats a conduit au cours des dernières années à une augmentation constante de leur utilité clinique. Les marqueurs tumoraux sont des macromolécules le plus souvent des protéines avec une composante carbohydrate ou lipide dont les taux sériques corrèlent avec la présence et la croissance de tumeurs malignes. Le marqueur tumoral idéal utilisable pour le diagnostic primaire devrait répondre aux deux critères suivants : - sécrétion dans la circulation sanguine à des concentrations mesurables uniquement par des cellules ayant subi une transformation maligne - sécrétion permettant des conclusions quant à la localisation de la tumeur Or il n'existe actuellement aucun marqueur tumoral répondant à ces conditions strictes. Par conséquent l'utilisation de ces marqueurs à des fins de diagnostic primaire doit se limiter à des groupes à haut risque et à des patients symptomatiques. L'utilité majeure de ces marqueurs réside dans le suivi d'une maladie établie, le contrôle de l'efficacité d'une thérapie, l'identification d'une tumeur résiduelle et, dans certains cas, dans la détermination d'un pronostic. L'utilisation correcte des marqueurs tumoraux peut bénéficier au patient et aider à réduire les coûts de traitement. Au contraire, l'utilisation peu judicieuse, voire anarchique, de ces tests conduit non seulement à une augmentation des coûts mais aussi à des décisions cliniques erronées et peut provoquer des situations traumatisantes chez le patient. SLBC 2001 p. 18

14 LA THYROGLOBULINE EN TANT QUE MARQUEUR TUMORAL J.P. Hoffmann Laboratoire National de Santé, LUXEMBOURG La thyroglobuline est une glycoprotéine iodée dimérique de poids moléculaire 660 kda. Elle est synthétisée dans les cellules folliculaires de la thyroïde et constitue le support pour la synthèse des hormones thyroïdiennes T4 et T3. La thyroglobuline peut être mesurée dans le sérum de tous les individus normaux. Sa concentration est le reflet de la masse de tissu thyroïdien différencié présent, de toute inflammation de la thyroïde, ainsi que du degré de stimulation du récepteur de la TSH par la thyréostimuline. Dans le cancer différencié de la thyroïde la thyroglobuline peut se présenter dans le sérum à des concentrations élevées, mais ne peut être utilisée dans un but diagnostique. Après ablation totale de la thyroïde, elle doit être non décelable dans le sérum. La présence de quantités mesurables dans le sérum indique la persistance ou la réapparition de tissu néoplasique. Ceci est à la base de l utilisation de la thyroglobuline comme marqueur tumoral pour le suivi post-opératoire de patients atteints de cancer de la thyroïde. Le but de ce suivi est la détection précoce d une rechute, qui peut être reconnue par des mesures sensibles de la thyroglobuline combinées à une scintigraphie totale à l iode 131 I. La thyroglobuline est une molécule très immunogène. Son dosage est actuellement basé sur des techniques de type sandwich utilisant des anticorps monoclonaux avec un marqueur soit isotopique (IRMA) soit froid (ICMA). Pour employer la thyroglobuline en tant que marqueur tumoral il faut que la sensitivité fonctionnelle de la méthode se situe aux alentours de 1 µg / litre. Des efforts ont été faits pour standardiser la mesure de la thyroglobuline avec la l introduction récente d un matériel de référence, le CRM 457. Malgré la disponibilité de cette préparation standard, des divergences substantielles subsistent encore entre les différentes méthodes de dosage. Dans le suivi de patients atteints de cancer thyroïdien il importe de doser la thyréoglobuline toujours avec la même méthode. La présence d auto anticorps anti-thyroglobuline pose un autre problème difficile et incomplètement résolu. Ces auto anticorps sont trouvés dans au moins 15% des patients atteints de cancer différencié de la thyroïde. En entrant en compétition avec les anticorps monoclonaux du coffret les anticorps anti-thyroglobuline peuvent interférer dans la mesure de la thyroglobuline, le plus souvent en la sousestimant. Il est donc nécessaire d associer une recherche d anticorps antithyroglobuline à tout dosage de thyroglobuline avant de valider un résultat. Une alternative consiste à appliquer en parallèle à tout dosage de thyroglobuline un test de récupération. Celui ci a pour avantage de reconnaître une interférence par les auto-anticorps et détecter un éventuel effet crochet dû à des concentrations très élevées en thyroglobuline, telles qu elles peuvent ce présenter dans des récidives de cancer thyroïdien. En tenant compte des pièges analytiques que peut comporter son dosage, la thyroglobuline est un marqueur précieux et indispensable dans le suivi postopératoire du cancer différencié de la thyroïde. SLBC 2001 p. 19

15 LES MARQUEURS URINAIRES DU CANCER DE LA VESSIE Alain de Bourcy Laboratoire de Biochimie-Immunopathologie Centre Hospitalier de Luxembourg Les tumeurs de la vessie sont classiquement diagnostiquées par cystoscopie est une technique invasive et coûteuse, ainsi que par l analyse cytologique des cellules malignes exfoliées dans les urines, technique qui présente une faible spécificité, surtout pour les lésions tumorales de faible grade. A cause de ces inconvénients de la cystoscopie et de la cytologie urinaire, on a eu l idée de rechercher des marqueurs tumoraux biologiques permettant de faciliter le dépistage du cancer de la vessie. Le marqueur idéal du cancer de la vessie devrait avoir un intérêt dans la surveillance régulière et prolongée (monitoring) de tumeurs vésicales afin d éviter ou d espacer les nombreuses cystoscopies de contrôle que doivent subir les patients à antécédent d épithélioma vésical. Comme les urines sont au contact direct d une tumeur de la paroi vésicale, il apparaît logique d orienter la recherche de marqueurs tumoraux vers des protéines libérées directement par la tumeur dans l urine. On peut ainsi escompter des concentrations urinaires de marqueurs tumoraux qui sont nettement plus élevées que les niveaux sériques correspondants. En ce qui concerne notre étude expérimentale, nous nous sommes focalisés sur les quatre marqueurs suivants : - le BTA, pour Bladder Tumor Antigen, - la BTF, pour Bladder Tumor Fibronectine, - deux protéines issues du cytosquelette, la cytokératine 18 et le CYFRA Cette étude nous a permis de dresser les conclusions suivantes : - Le CYFRA 21-1 est le marqueur tumoral qui, est le plus prometteur quant à une utilisation clinique dans le dépistage et le suivi des cancers de la vessie : il possède une sensibilité élevée (81,0 %) avec une spécificité acceptable (83,5 %). - La cytokératine 18 a une sensibilité faible (54,5 %) ne lui permettant pas de jouer un rôle en tant qu outil clinique de diagnostic du cancer de la vessie. Par ailleurs, la faible spécificité (72,0 %) obtenue chez les patients à épithélioma vésical suivis en rémission ne permet pas d envisager l utilisation de la cytokératine 18 en tant qu indice permettant au clinicien de décider de la durée des intervalles entre deux cystoscopies de contrôle. - Le BTA TRAK a une sensibilité faible (57,9 %), inacceptable en pratique clinique. La spécificité de 78,6 % est également médiocre : nous ne pouvons donc pas recommander une utilisation de ce marqueur tumoral en pratique clinique. - Le BTF présente une sensibilité faible (33,3 %), incompatible avec une utilisation en pratique clinique. Cependant, la spécificité du BTF est acceptable (93,8 %) et on pourrait imaginer une utilisation du BTF dans la surveillance des patients en rémission clinique après un épisode antérieur de carcinome vésical : SLBC 2001 p. 20

16 dans cette optique, on ferait subir des examens complémentaires à tous les patients présentant un BTF urinaire élevé. LES SYNDROMES NEUROLOGIQUES PARANEOPLASIQUES René Louis Humbel Laboratoire de Biochimie-Immunopathologie Centre Hospitalier de Luxembourg Certaines néoplasies peuvent altérer la fonction neurologique, en l'absence de tout envahissement tumoral ou métastatique du système nerveux. Ces syndromes neurologiques sont appelés "syndromes neurologiques paranéoplasiques". Ceux-ci peuvent prendre plusieurs aspects suivant qu'ils affectent le système nerveux central et/ou le système nerveux périphérique. Les symptômes neurologiques apparaissent de façon subaiguë en quelques semaines, voire même quelques jours et peuvent être profondément invalidants. Ils précèdent très souvent de plusieurs mois ou même d'années la découverte du cancer sous-jacent. Les atteintes du système nerveux central sont constituées par une encéphalite limbique, une encéphalite du tronc cérébral, une dégénérescence cérébelleuse subaiguë ou des opsoclonies-myoclonies. Une neuropathie subaiguë sensitive et une pseudo-obstruction intestinale témoignent de l'atteinte du système nerveux périphérique. Les atteintes qui touchent la jonction neuro-musculaire entraînent des paralysies musculaires (syndromes myasthéniques). Plus rarement l'affection provoque une dégénérescence des photorécepteurs rétiniens et entraîne une perte visuelle progressant vers la cécité. Divers types de tumeurs sont associés à des syndromes neurologiques paranéoplasiques. Les cancers les plus fréquents sont le cancer pulmonaire à petites cellules, les cancers du sein et de l'ovaire, la maladie de Hodgkin, le thymome. Divers anticorps peuvent être mis en évidence dans le sérum des malades. Ils résultent d'une réaction autoimmune croisée entre des antigènes exprimés par les cellules de la tumeur et par certaines cellules du système nerveux, d'où leur dénomination d'antigènes onconeuronaux. Plusieurs types d'anticorps ont été identifiés qui réagissent avec des constituants du noyau des neurones, du cytoplasme des cellules de Purkinje, des oligodendrocytes ou de la rétine. Ces anticorps sont spécifiques d'un type particulier de syndrome neurologique et du type de tumeur cancéreuse. La mise en évidence de ces anticorps est d'un grand intérêt pratique car elle permet de reconnaître l'origine de l'affection neurologique et incite à chercher activement un cancer, qui peut être débutant, à un stade où il peut encore être traité. SLBC 2001 p. 21

17 DIAGNOSTIC DES INFECTIONS À PAPILLOMAVIRUS Bernard Weber Laboratoires Réunis Kutter-Lieners-Hastert, Junglinster et Institut für Med. Virologie, Universitätskliniken Frankfurt Il existe plus de 70 types différents de Papillomavirus (HPV) pouvant induire une prolifération cellulaire au niveau des muqueuses et de la peau. Tandis que la grande majorité des Papillomavirus provoquent des lésions bénignes telles que des verrues et condylomes, un certain nombre de types oncogènes à «haut risque» sont associés à des tumeurs malignes cutanées génito-anales et le cancer du col de l utérus. Le cancer du col est la deuxième cause de cancer féminin dans le monde, l incidence mondiale est évaluée à environ cas par an. Chaque année, en France, 5400 nouveaux cas de carcinomes infiltrant avec environ 1600 décès sont enregistrés. L infection génitale à HPV est transmise par voie sexuelle, la prévalence des porteurs de virus est avec environ 50 % très élevée. En général HPV est éliminé chez la plupart des sujets après une durée de quelques mois. Des lésions précancéreuses et cancéreuses ne se développent probablement que chez des femmes porteuses de HPV oncogènes pendant de nombreuses années. Le dépistage en masse du cancer du col est basé en première approche sur l examen cytologie classique. La détection des HPV oncogènes comme outil pour améliorer le dépistage des lésions précancéreuses et/ou cancéreuses du col utérin fait l objet de travaux contradictoires. A l heure actuelle il est recommandé de réserver le diagnostic étiologique de l infection à HPV aux femmes de plus de 30 ans qui représentent les populations les plus à risques de développer des néoplasies intraépithéliales cervicales de haut grade (CIN3, dysplasie sévère et carcinoma in situ) et aux femmes avec des atypies cellulaires de nature mal définie (ASCUS). L HPV étant un virus non cultivable, le diagnostic de laboratoire repose essentiellement sur la mise en évidence du génome viral ou l immunohistochimie. La détection de l HPV DNA avec ou sans amplification génique à l avantage par rapport à l immunohistochimie d être plus sensible et elle peut être réalisée à partir d un simple frottis cervical prélevé par cytobrosse. Bien que la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) présente en théorie une sensibilité plus élevée que l hybridation en phase liquide, il n existe à l heure actuelle qu une seule trousse commerciale permettant la détection des HPV oncogènes par hybridation avec amplification du signal par chimiluminescence (Hybrid Capture II, Digène). Le test Hybrid Capture permet d effectuer une détermination semi-quantitative de la charge virale, présente une grande reproductibilité et permet grâce à des mélanges de sondes de mettre en évidence et de différencier de manière aisée entre HPV oncogènes (types 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 et 68) et à «bas risque» (types 6, 11, 42, 43 et 44). La détection d HPV DNA est effectuée depuis novembre aux Laboratoires Réunis Kutter-Lieners-Hastert. Sur les 381 prélèvements qui ont été analysés, des renseignements cliniques étaient disponibles dans 22,3 % des cas. La prévalence de HPV oncogènes à «haut risque» était de 32,8 %. Des infections à HPV types à «bas risque» étaient présentes dans 16,8 % des cas. D après les données cliniques recueillies, il semble qu un pourcentage élevé de femmes soumises au test de mise évidence de l HPV DNA sont considérées comme potentiellement à risque de cancer. L association du test HPV au frottis de dépistage permet une approche plus ciblée et plus économique en proposant essentiellement aux femmes positives pour les HPV SLBC 2001 p. 22

18 oncogènes avec ASCUS ou lésions pavimenteuses intra-épithéliales un rythme de dépistage plus rapproché et une surveillance plus attentive. SLBC 2001 p. 23

19 L INTERACTION MOLÉCULAIRE D UN ANTICORPS AVEC UN ANTIGÈNE PEPTIDIQUE Mike Pütz*, Fabienne Bouche*, Fred Fack*, Wim Ammerlaan*, Johan Hoebeke, Claude P. Muller* *Laboratoire National de Santé, Département d Immunologie, Luxembourg UPR 9021 CNRS, IBMC, Immunochimie des Peptides et des Virus, Strasbourg Les interactions protéines-protéines sont à la base de pratiquement tous les processus biologiques. La spécificité de ces interactions est essentielle pour préserver les fonctions et les cascades complexes de la reconnaissance au niveau moléculaire. En immunologie, par exemple un système sophistiqué est en mesure de distinguer entre le soi et le non-soi, et la reconnaissance spécifique est un requisite fondamentale. Dans notre étude nous avons mis en évidence les résidus importants dans un épitope peptidique pour la reconnaissance par un anticorps monoclonal, et tiré quelques conclusions concernant la structure de ce peptide lors de son interaction avec le paratope. Le peptide dérive de la protéine hémagglutinine du virus de la rougeole. Il a été montré dans notre laboratoire que ce peptide est en mesure d induire des anticorps protecteurs et neutralisants dans un système murin. Il représente donc un candidat potentiel pour être inclus dans un vaccin contre la rougeole. Nous avons synthétisé plusieurs sets d analogues substitués du peptide qui ont été analysés pour leur capacité d interagir avec un anticorps monoclonal par ELISA et par des mesures sur un instrument BIAcore3000. Ces résultats vont nous permettre de mieux concevoir nos antigènes peptidiques nécessaires pour le développement d un vaccin efficace contre la rougeole à base de peptides. SLBC 2001 p. 24

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