Examens virologiques en pratique médicale

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1 Examens virologiques en pratique médicale Moyens techniques pour faire un diagnostic positif: Diagnostic direct Diagnostic indirect Pr V. Giordanengo

2 Examens virologiques en pratique médicale Diagnostic Est-il encore direct là??? = recherche du virus ou d un de ses constituants (protéines virales ou génome viral) Diagnostic Serait-il passé indirect par là =??? recherche des anticorps

3 Diagnostic Indirect = Détection d Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome - Western-blot Culture cellulaire PCR RT-PCR «Dater l infection» Infection récente «Déjà vu le virus» Statut sérologique Immunofluorescence

4 Diagnostic indirect ou sérologie: Prélèvement Diagnostic indirect Détecter les Ac Ac spécifiques dirigés contre le virus Sérum Prélèvement de sang en tube sec gélosé Acheminé au laboratoire à température ambiante. Centrifugé au laboratoire Simple Facile. Le sérum est utilisé pour réaliser les sérologies prescrites. Autres liquides biologiques : liquide céphalo-rachidien (LCR), liquide amniotique, liquide pleural, liquide de lavage broncho-alvéolaire (LBA)...

5 Diagnostic indirect ou sérologie: recherche AC Techniques: Épitopes viraux ELISA (tests unitaires ou en plaques) = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay AC du sérum à tester Puits colorés = Positifs AC anti AC-humain AC sont-ils des IgG ou IgM? Si AC anti IgM => puits colorés si présence d IgM

6 Diagnostic indirect ou sérologie: recherche AC ELISA Agglutination (latex rubéole) Test rapide Western blot

7 En conclusion: rechercher des AC Pour le diagnostic d une infection en cours: 2 prélèvements à 15 jours d intervalle Titre ou taux AC augmente Pour connaître le statut sérologique («cicatrice laissée par le passage du virus») = savoir si un patient a déjà rencontré un virus précis IgM signe une infection récente Recherche d IgG Pour diagnostic des primo-infections +++ Apparition des Ac entre deux sérums prélevés à 15 jours d intervalle 2 sérums : sérum précoce (neg) sérum tardif (pos) Pour le HIV et le HCV une sérologie positive pour la première fois Obligatoire de vérifier le résultat sur un second prélèvement

8 Diagnostic Indirect = Détection d Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome - Western-blot Culture cellulaire PCR RT-PCR «Dater l infection» Infection récente «Déjà vu le virus» Statut sérologique Immunofluorescence

9 Diagnostic direct : détection du virus ou de ses composants Prélèvements: Récipient sec stérile (Aspiration naso-pharyngée, selles, urines, LCR ) Divers difficile fragile. Écouvillon stérile immergé dans un milieu de transport Techniques: (gorge, vésicules, conjonctives) Diagnostic direct «rapide» Tube de sang ou de plasma Diagnostic direct par culture héparinate de lithium (CMV) ou EDTA (EBV, HIV) Diagnostic direct par biologie moléculaire La qualité du prélèvement conditionne le résultat Il faut des cellules ++++ gratter sur les berges afin de récupérer des cellules vivantes et non de la nécrose Acheminer au laboratoire dans les 4 heures

10 Diagnostic direct «rapide» détection du virus ou de ses composants Résultats en quelques heures Technique: Cellules déposés sur une lame de verre Ag sont détectés par immunomarquage Négatif Positif AC Protéines virales Indications Prise en charge rapide Infections respiratoires (grippe, VRS) Chez les patients immunodéprimés (CMV)

11 Diagnostic direct «rapide» détection du virus ou de ses composants Résultats en quelques heures Technique: Cellules déposés sur une lame de verre Ag sont détectés par immunomarquage Négatif Positif AC Protéines virales Indications Prise en charge rapide Infections respiratoires (grippe, VRS) Chez les patients immunodéprimés (CMV) Femme enceinte (HSV)

12 Diagnostic direct : Immunofluorescence IF grippe A

13 Diagnostic direct : Immunofluorescence IF VRS

14 Diagnostic direct : Immunofluorescence

15 Diagnostic Indirect = Détection d Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome - Western-blot Culture cellulaire PCR RT-PCR «Dater l infection» Infection récente «Déjà vu le virus» Statut sérologique Immunofluorescence

16 Diagnostic direct par culture: détection du virus ou de ses composants Les différentes étapes du diagnostic par culture virale: Inoculation du prélèvement sur différents supports cellulaires Recherche 3 fois/sem d un effet cytopathique Si ECP: identification Coloration Immunomarquage spécifique Neutralisation

17 Diagnostic direct par culture: détection du virus ou de ses composants Les différentes étapes du diagnostic par culture virale: Inoculation du prélèvement sur différents supports cellulaires Recherche 3 fois/sem d un effet cytopathique Si ECP: identification Coloration Immunomarquage spécifique Neutralisation

18 Diagnostic direct par culture: détection du virus ou de ses composants Les différentes étapes du diagnostic par culture virale: Inoculation du prélèvement sur différents supports cellulaires Recherche 3 fois/sem d un effet cytopathique Si ECP: identification Coloration Immunomarquage spécifique Neutralisation

19 Diagnostic direct par culture: détection du virus ou de ses composants Avantage: Sensibilité Prouve le caractère infectieux du virus Permet d isoler la souche Contraintes: Hotte à flux laminaire, Matériel jetable et stérile

20 Diagnostic Indirect = Détection d Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome - Western-blot Culture cellulaire PCR RT-PCR «Dater l infection» Infection récente «Déjà vu le virus» Statut sérologique Immunofluorescence

21 Diagnostic direct par biologie moléculaire: détection de ses composants Par amplification génique: Par PCR ou RT-PCR suivant le génome Permettant le recopiage d une portion limitée du génome viral => Détection possible: PCR qualitative (pos ou nég) Quantitative (HIC, HBV, HCV, EBV) = charge virale Suivi parfois du séquençage nucléotidique = séquence exacte

22 dntp! Taq polymérase! Amorces! Tampon! Matrice! ADN! 30 cycles" 95 C!55 C!72 C! Dénaturation "Hybridation "Elongation!

23 Diagnostic direct par biologie moléculaire Avantage: Sensibilité Technique quantitative = Charge virale Séquence exacte adaptation thérapeutique Quantité d ADN Synthétisé Au cours du temps Contraintes: Risque de contamination Séquence exacte de l ADN synthétisé

24 Diagnostic Indirect = Détection d Ac par différentes techniques Diagnostic Direct = Détection du virus ou de ses composants - Technique ELISA Isoler le virus Détecter les Ag Détecter le génome - Western-blot Culture cellulaire PCR RT-PCR «Dater l infection» Infection récente «Déjà vu le virus» Statut sérologique Immunofluorescence

25 UN EXEMPLE

26 VHB et marqueurs directs Protéines de surface portant l Ag HBs Ag HBs Sang Capside portant l Ag HBc Ag HBe Génome : ADN ADN VHB

27 VHB et marqueurs directs + indirects Protéines de surface portant l Ag HBs Ag HBs Sang Ac anti-hbs Capside portant l Ag HBc Ag HBe Ac anti-hbc Ac anti-hbe Génome : ADN ADN VHB