Epreuve orale de biologie / DOCUMENTS

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1 Epreuve orale de biologie / DOCUMENTS Thème : membranes biologiques et jonctions entre cellules Sujet : des jonctions étanches (sujet pouvant être proposé dès la 1 re année) Le candidat prendra connaissance des documents : aucune présentation n est attendue en début d entretien avec l interrogateur. Cette épreuve, qui complète l exposé de synthèse, est donc une «interrogation dialoguée autour de quelques documents», menée par l interrogateur. Les analyses et interprétations seront développées au cours du dialogue. La muqueuse intestinale limite l organisme du contenu du tube digestif. Elle est pour l essentiel constituée d entérocytes, cellules très jointives et liées entre elles par des jonctions serrées. Le document ci-dessous permet de situer certains éléments contribuant à ces jonctions serrées. Document 1 A. Organisation tridimensionnelle d un entérocyte ; B. MET réalisé après cryofracture ; C. MET d une coupe fine. Les niveaux de cryofracture et de coupe fine sont indiqués. Ils peuvent être facilement repérées à l aide du schéma A. 1. Vers le cytosol. 2. Vers la lumière intestinale. 3. Microvillosités des entérocytes (= bordure en brosse). 4. Cytosol. 5. Réseau protéique sous-membranaire. 6. Jonction entre deux cellules adjacentes. 7. Milieu extracellulaire. 8 et 9. Faces interne et externe de la membrane plasmique. Les occludines et les claudines sont des protéines localisées au niveau des jonctions serrées. On cherche à comprendre quelle est l organisation et le rôle des claudines dans les jonctions cellulaires. La séquence primaire des claudines 1 et 2 de la Souris a été utilisée pour tracer un profil d hydrophobicité. Pour l obtenir, on sait que, du fait de leurs chaînes latérales, les acides aminés peuvent avoir des propriétés plus hydrophiles ou au contraire plus hydrophobes. On attribue, d'après une échelle conventionnelle (échelle de Kyte et Doolittle), un indice d'hydrophobicité à chaque acide aminé. On détermine alors l'hydrophobicité moyenne de segments (ou «fenêtres») de 11 acides successifs (longueur considérée comme significative), ce qui fournit alors les profils représentés ci-dessous. Un indice élevé correspond à un segment hydrophobe. prepas-svt / prepas-bio. septembre

2 Document 2 Séquence d acides aminés des claudines 1 et 2 (souris) et profils d hydrophobicité correspondants. En A : comparaison de séquence en acides aminés des claudines 1 et 2 ; en B : profil d hydrophobicité de la claudine 1 ; en C : profil d hydrophobicité de la claudine 2. Ne pas tenir compte du «Domaine***» à ce niveau. Cette indication sera exploitée par la suite. D une façon générale, deux modalités de transport à travers un épithélium existent : - une voie transcellulaire qui peut être active ou passive et basée sur l activité de pompes transmembranaires, de transporteurs ; - une voie paracellulaire qui est uniquement passive (schéma ci-après). prepas-svt / prepas-bio. septembre

3 Il s agit ici de déterminer si la voie paracellulaire présente une sélectivité. Des études de perméabilité de tissus épithéliaux dotés de jonctions serrées ont été menées en injectant une petite molécule de traçage extracellulaire, le lanthane.?? Document 3 MET de cellules d un épithélium dans lequel le lanthane, dense aux électrons, a été ajouté soit sur le côté apical (en A) soit sur le côté basolatéral (en B). (d après Biologie moléculaire de la cellule, Alberts, 4 e édition, Médecine- Sciences, Flammarion 2004) Il existe 20 membres de la famille des claudines, d organisation similaire aux claudines 1 et 2. On a cherché à savoir si les claudines ont une influence sur la sélectivité ionique paracellulaire en surexprimant la claudine 4 dans des cellules humaines. Pour cela, les chercheurs ont introduit un plasmide contenant le gène de la claudine 4 dans les cellules humaines. On montre que l aspect des jonctions serrées au microscope électronique après cryofracture est d autant plus complexe et dense que le gène de la claudine 4 est surexprimé. L effet de l expression du gène de la claudine sur la conductance paracellulaire (révélant la perméabilité des ions Na + ) et sur le flux de solutés non chargés (le mannitol) a été testé. Dans ces expérimentations le gène de la claudine est sous le contrôle d un promoteur répressible (= expression inhibée en présence d un répresseur, ici la doxycycline). prepas-svt / prepas-bio. septembre

4 Document 4 Effet du taux d expression du gène de la claudine 4 sur la conductance paracellulaire (en A) et sur le flux de mannitol (en B). En A : en haut, analyse par Western blot du taux d expression du gène de la claudine 4 dans les cellules selon la quantité de répresseur doxycycline ; en bas : mesure de la conductance. En B : deux clones ont été testés, symboles en triangle (premier clone) ou en cercle (second clone), en présence de répresseur (doxycycline à 10 ng / ml) : symboles vides, en l absence de répresseur : symboles pleins. Effet des mutations sur le fonctionnement des claudines L effet de différentes mutations sur la perméabilité de la claudine 4 et de la claudine 15 a été étudié. Le document suivant présente la séquence d acides aminés du domaine noté*** (document 1). Des expériences de mutagenèse dirigée ont permis la production d une mutation sur la position 65 de la claudine 4 et trois mutations m1 (position 46), m2 (position 55), m3 (position 64) ont été réalisées sur le même domaine de la claudine 15. Document 5 Séquence du domaine*** des claudines 4 et 15 et position des acides aminés mutés. Signification des résidus d acides aminés : R = arginine E= glutamate D = aspartate K = lysine. Leur formule est précisée ci-après (attention, la partie constante des acides aminés, indiquée en grisé, n est pas chargée quand l acide aminé est engagé dans une liaison peptidique au sein d un polypeptide). prepas-svt / prepas-bio. septembre

5 Des expériences d immunolocalisation montrent que les mutations sur les claudines 4 et 15 n ont pas affecté la localisation cellulaire des protéines mutantes par rapport aux protéines normales. De plus, des inhibiteurs de transporteurs transcellulaires n ont aucun effet sur cette perméabilité. L effet de ces mutations sur la sélectivité ionique de la perméabilité paracellulaire a été étudié. Les résultats sont notés dans les données ci-dessous. Effet des mutations sur la perméabilité ionique paracellulaire : - la mutation K65D de la claudine 4 supprime la sélectivité de la perméabilité au Na + ; - la surexpression de la claudine 15 provoque une augmentation de la perméabilité au Na +, contrairement aux résultats obtenus pour la claudine 4 ; - les substitutions correspondant aux mutations m1, m2 et m3 entrainent une sélectivité de charge inversée avec une préférence pour le Cl - au lieu du Na +. La combinaison des 3 mutations présente le même effet démultiplié Pistes d exploitation L objectif de cette partie de l épreuve n est pas de réaliser une étude autonome et complète d un ensemble documentaire, comme c est le cas pour l épreuve écrite : - les documents sont le prétexte à un dialogue initié par l interrogateur, visant à valider chez le candidat des compétences sous-évaluées lors de l épreuve écrite ; le candidat doit être capable de rentrer dans une logique de réflexion, d interpréter et de discuter des résultats, d assembler les différents éléments pour proposer une vision d ensemble, à la lueur des connaissances du programme. - le dialogue permet de rechercher les raisons d être des documents proposés et de leurs démarches, mais aussi les limites des démarches ou résultats proposés. La première question posée par l examinateur pour initier le dialogue peut être variable, mais elle peut par exemple porter sur la vision d ensemble des documents (ce qui impose que le candidat ait pris connaissance du sujet au préalable!). => Il est donc clairement attendu que le candidat montre qu il a lu les documents lors de sa préparation (7 à 8 min. nous semblent nécessaires) et compris les grandes lignes du sujet abordé et ce que l on cherche à comprendre. Les techniques et protocoles expérimentaux abordés par le sujet sont pour beaucoup connus des candidats. Il est donc naturel que ces derniers soient brièvement interrogés dessus puisque ce sont des éléments clés d analyse des résultats. Si certaines techniques ne sont pas explicitement au programme, elles sont explicitées dans les documents. => Il est donc conseillé au candidat de se concentrer lors de leur préparation sur ces protocoles (les identifier, se remémorer les techniques associées, vérifier qu on a compris chacune des étapes et ses attendus ) plutôt que sur les résultats qui, si le protocole est compris, pourront être intégralement analysés lors de l entretien. prepas-svt / prepas-bio. septembre

6 Document 1 et 2 Ce document permet de discuter de différentes techniques associées à la microscopie électronique par transmission (cryofracture, coupe ultrafine ), de techniques permettant de préciser les propriétés de certaines molécules (établissement d un profil d hydrophobicité qui lorsqu il est confronté à des analyses de séquences, permet notamment d identifier des protéines transmembranaires ), de parler des entérocytes (cellules différenciées, spécialisées, polarisées ), ou encore de tissu : ici, épithélium Le profil d hydrophobicité montre que, bien que les séquences des 2 protéines soient assez différentes (seulement 72 acides aminés en commun sur 211), le comportement de la chaîne d acides aminés est à peu près le même : on retrouve 4 régions protéiques à indice d hydrophobicité élevé. on peut donc émettre l hypothèse d une protéine à 4 hélices α transmembranaires (schéma possible, sans qu on puisse orienter la membrane. On peut noter que lorsque les acides aminés sont différents dans la séquence des deux claudines, ils sont souvent de même comportement (résidu hydrophile ou hydrophobe). Document 3 Protocole suivi : le lanthane est une petite molécule extra-cellulaire dense aux électrons. Lorsqu il est ajouté du côté apical, on remarque que le lanthane diffuse bien entre les microvillosités mais ne pénètre pas dans les cellules. Il ne diffuse pas non plus entre les deux cellules épithéliales et semble bloqué par le point de contact entre les deux cellules (légende = jonction serrée). Les jonctions serrées semblent bloquer le transport paracellulaire du lanthane du côté apical au côté basal. De la même manière, le lanthane ajouté sur la face basale peut diffuser librement dans le milieu extracellulaire mais ne parvient pas à accéder au côté apical car il ne franchit pas les jonctions serrées. Les jonctions serrées constituent donc une barrière étanche, même aux petites molécules. Document 4 A. L électrophorèse (technique du Western blot, être capable d en expliquer le principe et les conditions de lecture des résultats obtenus ) permet de visualiser la quantité de claudine 4 exprimée dans les cellules en fonction de la quantité de répresseur (doxycycline) : - à 10 ou 1 ng/ml de doxycycline, la claudine n est pas exprimée ; - à un taux de 0,1 ng/ml, il y a un peu de claudine présente ; - sous 0,01 ng/ml, on a chaque fois une forte quantité de claudine. En parallèle, le passage des ions par voie paracellulaire est mesuré : il est reflété par la conductance (passage des ions). plus il y a de claudine présente, moins les ions peuvent passer entre les cellules. La conductance est divisée par 4 lors de l expression croissante de claudine. Présente en forte quantité (à partir de 0,01 ng/ml de doxycycline), la conductance stagne à 7 ms/cm 2. les claudines constituent un réseau étanche (observé en cryofracture, document 1) qui atténue fortement le passage des ions entre les cellules épithéliales. B. Le passage du mannitol est testé en absence de claudine (à 10 ng/ml de doxycycline ) ou en présence d une forte quantité de claudine (sans doxycycline). Quelles que soient les conditions expérimentales, le mannitol franchit l épithélium avec la même vitesse. soit le mannitol passe par voie transcellulaire (c est un soluté non chargé mais c est un sucre, donc hydrophile : il ne traverse pas les membranes et doit utiliser un transporteur) soit il peut franchir les jonctions serrées. les claudines forment une zonula occludens qui empêche le passage des ions mais peut-être pas des petites molécules non chargées. Document 5 et expérience d immunolocalisation Claudine 4 : un acide aminé à résidu chargé + est remplacé par un acide aminé à résidu chargé -. Claudine 15 : 3 acides aminés à résidus chargés - sont remplacées par des acides aminés à résidus chargés +. Ces mutations n ont pas perturbé l agencement des zonula occudens. La voie transcellulaire n est pas affectée non plus. Claudine 4 : en forte quantité, elle limite le passage des ions Na + du fait de sa charge + en position 65. prepas-svt / prepas-bio. septembre

7 Si on ôte cette charge, la sélectivité n existe plus. Donc le domaine*** est extracellulaire et contrôle la voie paracellulaire. Claudine 15 : sa charge - dans le domaine*** augmente au contraire le flux de Na + (par complémentarité de charges). En échangeant la charge - par une charge +, les ions qui traversent sont alors des anions. On a bien interaction de ces acides aminés avec les ions qui passent. le domaine*** extracellulaire des claudines contrôle le passage des ions par voie paracellulaire. Les acides aminés présents servent de filtre de sélectivité (comme pour les canaux ioniques). L objectif de cette étude était donc de discuter de l importance de certaines molécules dans l acquisition des caractéristiques d un tissu, ici un épithélium, couche limite de l organisme, participant notamment à des fonctions de protection et d échanges avec l environnement proche. prepas-svt / prepas-bio. septembre