METHODES D IMMUNOCHIMIE :

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1 METHODES D IMMUNOCHIMIE : 1 Les méthdes d immunchimie snt des réactins utilisées afin de permettre la détectin et la quantificatin de mlécules en très faible quantité appelées analytes. La détectin se fait en général dans les milieux bilgiques. Ces méthdes snt basées sur la spécificité de la réactin antigène- anticrps (Ag- Ac). Le dmaine d applicatin est vaste : Diagnstic de maladies infectieuses (détecter des bactéries, des virus, des champignns, des parasites) Il se fait de 2 manières : - par diagnstic indirect (recherche des Ac spécifiques générés dans le sérum) - par diagnstic direct (recherche directement l agent infectieux ds les liquides bilgiques u dans des bipsies cad sur un tissu) Diagnstic de pathlgies tuchant le système immunitaire : déficit immunitaire, maladies aut- immunes (plyarthrite rhumatïde), pathlgies qui créent une hypersensibilité (allergies) Dsage quantitatif de bimlécules (en milieu hspitalier, c est tut le secteur de la bichimie) : dsage d hrmnes, de médicaments, de vitamines, de prtéines pathlgiques déclenchées dans des prcessus inflammatires RAPPELS : ü Antigène : Tute substance naturelle u synthétique qui est recnnue par les cellules du système immunitaire. ü Epitpe u déterminant antigénique : Ce snt des znes d intérêt particulier sur une partie limitée de l Ag qui va être recnnue par une partie de l Ac (paratpe). Il a une structure tridimensinnelle qui est cmplémentaire au site de liaisn avec l Ac. La plupart des Ag pssèdent plusieurs épitpes, le tut sera alrs respnsable d une répnse plyclnale. Les épitpes snt généralement cnfrmatinels (car structure 3D) mais il existe aussi des épitpes séquentiels (séquences successive sur la structure primaire). ü Haptène : Ce snt des mlécules de faible pids mléculaire (<5000 Da) qui peuvent induire la synthèse d Ac spécifiques lrsqu ils snt cuplés à une prtéine prteuse (albumine, adjuvant de Freud ). Cet haptène est incapable de générer lui- même une prductin d Ac. Un haptène ne pssède dnc qu un seul épitpe. ü Réactin Ag Ac : In vitr, elle peut se prduire quand n ajute un Ac hmlgue à sn Ag. On btient alrs le cmplexe Ag - Ac qui est spécifique. Cette réactin est spécifique et réversible. La spécificité est due à la recnnaissance stérique de l Ag (épitpe) et de l Ac (paratpe). La réversibilité est pssible car la cmbinaisn entre ces 2 mlécules se fait par des liaisns de faible énergie. Ka Ag + Ac hmlgue Ag- Ac Ka : cnstante d assciatin Kd Kd : cnstante de dissciatin

2 2 ü Structure des anticrps : Ils fnt partie de la famille des immunglbulines. Ils snt cmpsés de 2 chaines légères, appelées L («light»), et de 2 chaines lurdes, appelées H («heavy») ; reliées par des pnts disulfure. Aux extrémités, il y a des znes variables (V) qui snt les sites de fixatin aux Ag, cad la ù se fernt les réactins. Le reste est cmpsé de znes cnstantes (C). Il existe 5 classes d immunglbulines : IGG, IGM, IGA, IGD, IGE Celles qui intéressent le plus ce curs snt les IGG, cad les Ac classiques, prtecteurs, retruvés dans le sérum. ü Paratpe : C est la partie de l Ac qui est mise en cntact avec l épitpe. Sa structure spatiale cnstitue une niche qui va permettre à l Ag de venir se psitinner : c est dnc le lieu de la réactin spécifique. On n utilise pas tujurs les Ac entiers, n a parfis recurs à des fragments d Ac générés par des enzymes prtélytiques. Les fragments snt prduits par des enzymes qui permettent une cupure mdérée, ménagée de la mlécule. On distingue 2 types de fragments : Ceux btenus par la papaïne : elle cupe la mlécule au dessus du pnt disulfure. On btient 3 fragments : - 2 fragments FAB identiques, prteurs du site de liaisn pr l Ag - 1 fragment FC (fragment cristallisable) qui cmprte les fnctins effectrices cmme la fixatin au cmplément, aux récepteurs FC Ceux btenus par la pepsine : il y a plusieurs sites de prtélyse en dessus des pnts disulfure et l n génère un seul fragment utile : Le fragment F(ab ) 2. Le fragment FC est dégradé.

3 3 ü Anticrps plyclnaux : Ce snt des Ac cnstitués d un mélange d Ac prduits par des lymphcytes B différents. Ils peuvent résulter : de l injectin à l animal d une prtéine nn purifiée u plutôt de l injectin à l animal d une prtéine purifiée : par exemple si un Ag pssède X épitpes, n va récupérer les Ac différents qui crrespndent à ces X épitpes. Le sérum prduit va dnc recnnaitre le même Ag mais avec des affinités différentes seln l épitpe qui a été impliqué. Avantage : Ce snt des Ac qui ne snt pas très cher, avec un mde de prductin simple. Incnvénient : Leur spécificité n est pas très étrite. ü Anticrps mnclnaux : Ce snt des Ac cnstitués d une ppulatin mléculaire hmgène avec une mnspécificité pur un épitpe dnné. Ils snt prduits de manière beaucup plus néreuse par des cellules en culture. Leur lieu de synthèse spécifique est l hybridme, qui est une cellule qui résulte de la fusin d une cellule du myélme (prlifératin illimitée) avec un lymphcyte B qui prvient d une suris immunisée vis- à- vis de la prtéine pure injectée. L Ac résultant est nn précipitant, mais sa spécificité est bien plus imprtante que les Ac plyclnaux. A. Les méthdes d agglutinatin : Cette méthde permet de visualiser directement (méthde macrscpique) le cmplexe Ag- Ac. Ceci est pssible parce que l Ag est placé à la surface de grsse particules (= éléments figurés) et les Ac peuvent dnc prvquer leur agglutinatin. On utilise 2 types de particules : Des particules naturelles (directement la bactérie, le parasite, u l hématie (hémaglutinatin)) Des particules synthétiques (billes de latex recuvertes d Ag) Il existe des méthdes sit directes sit indirectes. Elle est particulièrement utilisée pur le sérdiagnstic des infectins micrbiennes et le typage des grupes sanguins (hémaglutinatin).

4 B. Les méthdes de précipitatin : 4 Dans ces méthdes, Ag et Ac se présentent sus frme sluble. Les Ag divent être prteurs de plusieurs sites antigéniques et les Ac, de plusieurs sites paratpes. Les fragments FAB (pssédant un seul site paratpe) ne peuvent pas être utilisés pur cette méthde. Ces méthdes de précipitatin snt utilisées de 2 manières : en milieu liquide et en milieu gélifié. 1. En milieu liquide : * Test de l anneau : C est le test qualitatif le plus simple. Prtcle : On a besin d un tube capillaire de faible diamètre. Intrductin de l Ac Ajut de l Ag sluble On vit apparaitre à l interface un anneau de précipitatin si la réactin est spécifique. * Méthde d HEIDELBERGER KENDALL : Elle met à prfit le principe du test de l anneau pur une méthde quantitative. Prtcle : On met dans des tubes des Ac de cncentratin cnstante. Intrductin d une quantité crissante d Ag dans ces tubes Ajustement du vlume avec slutin tampn pur avir dans chaque tube le même vlume final. On vit une précipitatin mais le précipité ne se fait pas dans chaque tube, ni de façn prprtinnelle avec la quantité d Ag ajutée.

5 5 On quantifie le précipité et n le reprte sur une curbe. On btient une curbe en clche dnt n distingue 3 znes : Une zne d excès d Ac : première partie de la curbe (quantité faible d Ag) avec peu de précipité. Une zne d équivalence : partie médiane de la curbe (quantité myenne d Ag) avec une quantité de précipité maximal. Une zne d excès d Ag : dernière partie de la curbe (quantité imprtante d Ag) avec peu de précipité. Parfis, n btient une curbe type cheval avec 2 znes ù il n y a pas de précipité du tut (znes d excès d Ac et d Ag). Ceci est btenu quand n a des Ac plysidiques par exemple. Curbe type «cheval»

6 Le dsage dit se situer dans un cntexte cntrôlé : * Facteurs influençant l immunprécipitatin : 6 facteurs physic chimiques (ph, température, frce inique) agissent au niveau des liaisns de faible énergie. On peut utiliser le plyéthylène glycl (PEG) qui est un agent précipitant (plymère nn inique = nn chargé). Il accélère la précipitatin car elle n est pas instantanée vire lente. L incnvénient de la réactin Ag- Ac est que ce n est pas une réactin instantanée d ù l intérêt du PEG pur un diagnstic plus rapide. * Les méthdes de quantificatin : Le principe des mesures : Il dit prendre en cmpte ce phénmène de zne. Pur une même quantité de précipité détectée, n peut mesurer une quantité d Ag X 1 u X 2. Ce principe veut que l n se place ds la zne ascendante de la curbe cad lrsque la quantité de précipité augmente avec la quantité d Ag. On dit alrs préparer plusieurs dilutins d Ag. La turbidimétrie / néphélmétrie : La quantificatin est basée sur le principe seln lequel la lumière, passant par un milieu cntenant des particules dispersées d'un indice différent de celui du milieu, diminue en intensité du fait d'un phénmène de dispersin. La turbidimétrie mesure seulement de la lumière transmise, dans le même axe. La néphélmétrie mesure la lumière diffusée dans une directin dnnée : n se place pur la détectin à un angle de 7 à 10 degrés par rapprt à la lumière diffusée.

7 7 Les deux méthdes snt utilisées en permanence, à haut rendement. La néphélmétrie est plutôt la méthde de référence pur le dsage des prtéines sériques, alrs que la turbidimétrie est un analyseur qui fnctinne 24h/24 pur des dsages auxquels n dit répndre à tut mment. La limite de la méthde par turbidimétrie est qu elle est limitée par l excès de lipides dans les liquides bilgiques (alimentatin parentérale, certaines pathlgies qui trublent les liquides bilgiques ) Milieu gélifié : * Méthde d immundiffusin radiale (IDR) : méthde de Mancini Prtcle : On a une bîte de Pétri ds laquelle n cule de la gélse qui cntient l Ac, qui est dnc hmgène. On creuse des puits dans lesquels n place des Ag en cncentratin cnnue qui crrespndent à la gamme étaln puis des Ag de cncentratin incnnue (bjet du dsage). Par diffusin passive, l Ag diffuse jusqu à la zne d équivalence. On va alrs mesurer le diamètre des disques de précipitatin pur les dnnées quantitatives. Sur la curbe, n reprte le carré du diamètre du disque de précipitatin : n btient une relatin linéaire entre le carré du diamètre des disques de précipitatin et la cncentratin d Ag. Enfin, pur dser la cncentratin d un Ag, n mesure sn diamètre de précipitatin et n reprte sn carré sur le graphique. Grâce à la curbe étaln, n peut en déduire sa cncentratin.

8 8 * Electrphrèse en fusée u technique de LAURELL: C est une technique plus cmplexe qui fait appel à une méthde de séparatin. Intérêt : la précipitatin est plus rapide Prtcle : On dispse d une plaque de gélse qui cntient l Ac réparti unifrmément. On creuse des puits dans lesquels n va mettre les Ag étalns u à dser. On applique le champ électrique. Les prtéines vnt migrer vers le ple + car le ph = 8,6. On se place dans des cnditins spécifiques ù l Ag ne migre pas cntrairement aux Ac : n btient alrs des arcs de précipitatin. C est la hauteur de l arc qui est prprtinnelle à la cncentratin en Ag. Ces méthdes permettent une visualisatin directe sans révélatin du cmplexe Ag- Ac.

9 3. Immundsages utilisant un marqueur : 9 Principe : L Ag est fixé sur un supprt. On ajute un Ac primaire qui se fixe à l Ag. Ce cmplexe Ag- Ac nécessite pur être détecté la présence d un 2 ème Ac u Ac secndaire cnjugué à un marqueur (marqueur lié par une liaisn de cvalence) : c est ce cmplexe ternaire qui va être détecté. Nature du marqueur : Il y a différents types de marqueurs : Les radiéléments snt utilisés depuis de nmbreuses années. Il s agit de radi- immun- essais (RIA). Cependant, détecter les éléments radiactifs reste cmplexe (tritium, ide 125) On cntinue à les utiliser car leur sensibilité est extrême, ce snt des prduits très fiables. Les marqueurs de type enzymes : ce snt les enzyme- immun- essai (EIA). Ils utilisent la phsphatase alcaline, l HRP, la glucse 6 phsphate déshydrgénase, la β galactsidase Il va fallir détecter ces enzymes seln 2 principes : par réactin avec un substrat : n détecte le prduit de la réactin par une enzyme cuplée directement avec un flurphre 1) L'anticrps primaire se fixe à l'antigène. 2) L'anticrps secndaire (cnjugué à un marqueur) se fixe à l'anticrps primaire. Détectin : 3 types de détecteurs snt utilisés : Spectrphtmètre si il s agit d une réactin clrée. Flurimètre si le signal émis est flurescent. Luminmètre si la réactin dégage un réactif flurescent (HRP), par exemple le luminl. Amplificatin : Si le signal direct est trp faible, n utilise une méthde afin de l amélirer: c est la méthde streptavidine- bitine, qui est détectée par la perxydase.

10 Méthde immunenzymatique de type streptavidine- bitine- perxydase : 1) L'anticrps primaire (bleu) se fixe à l'antigène (nir). 2) L anticrps secndaire (vert) se fixe à l'anticrps primaire (mais il n est pas directement marqueur) et prte une mlécule de bitine (flèche ruge). 3) La bitine fixe un cmplexe streptavidine- perxydase (crix jaune) car l affinité de la streptavidine est très frte pur la bitine. 4) Lavidine est alrs détectée et permet une amplificatin du signal. 10 à C est une réactin très fiable car elle n est pas réversible. A partir de ce principe, n fait des dsages sit en phase hétérgène, sit en phase hmgène. Dsage en phase hétérgène : Il nécessite une étape de séparatin du cmplexe Ag- Ac avant la détectin et répnd à 2 principes de base : le dsage ELISA (Enzyme Linked Immunsrbent Assay) : sit avec un excès d Ac : C est la Méthde sandwich. On dispse d un supprt slide avec à sa surface des mlécules d Ac fixés en excès de manière irréversible. Elle nécessite 2 Ac : - Un Ac liant, fixé sur le supprt. - Un Ac marqué, qui sert de révélateur. Lrsqu n met en cntact l Ac fixé en excès avec l Ag à dser, au but de 1 à 3 heures, n bserve une fixatin. On élimine par lavage ce qui n a pas été fixé. Puis n ajute l Ac marqué. On élimine de nuveau les mlécules nn fixées (marqueur libre). On quantifie ensuite le signal : il y a prprtinnalité entre la cncentratin d Ag et le signal de la fractin liée. Ce principe n est pas applicable lrsqu n veut dser des haptènes car cela nécessite d avir 2 épitpes différents.

11 sit avec Ac limitant : Méthde par cmpétitin : L Ac fixé est limitant. On ajute l Ag à dser et l Ag marqué. L Ag marqué déplace par cmpétitin l Ag à dser. Après lavage n vit que plus la cncentratin d Ag augmente, plus le signal diminue. On a dnc une relatin expnentielle entre la cncentratin d Ag et le signal de la fractin liée. 11 Cette méthde est applicable à tus les Ag quelque sit leur taille. Elle nécessite un travail sur des plaques multi puits (96 puits). Si la méthde n est pas assez sensible (signal émis trp faible), n cuple à une réactin streptavidine. Les spts clrés indiquent que la réactin est spécifique Exemple : La bandelette réactive : L idée de la méthde Elisa se retruve dans d autres méthdes cmme le test de grssesse par exemple. Ce test met en évidence de la gnadtrphine chrinique humaine hcg dans les urines. Il nécessite : L anticrps de capture immbilisé de façn cvalente à la surface de la bandelette. L anticrps traceur marqué avec un clrant et imprégné sur la surface de la bandelette, mais mbile. La bandelette, matériau adsrbant. Un échantilln d urine dépsé à la surface, le liquide se déplace à travers la bandelette par capillarité. Les réactins de l essai nt lieu dans un flux.

12 12 Exemple : Méthde ELISPOT : Principe : capturer des mlécules sécrétées par des cellules (généralement des cytkines), sur un supprt slide sensibilisé qui permet la culture des cellules. Il s agit d une membrane de nitrcellulse sur laquelle snt fixés des Ac. Cela permet la réalisatin in situ d une culture de cellules. Il faut attendre un certain temps (24h) pur que les cellules viennent sécréter les cytkines. On effectue ensuite un lavage pur éliminer les cellules. Si les cytkines snt spécifiques des Ac, elles se fixent. La révélatin se fait par un Ac secndaire cuplé à un système qui permet la précipitatin. Apparaissent alrs des spts de précipitatin. Cette méthde est beaucup utilisée dans les pathlgies aut- immunes, dans le dévelppement de vaccins, et dans les maladies infectieuses. Les méthdes de dsage en phase hétérgène snt cmpliquées à cause de l autmatisatin pur les lavages.

13 Dsage en phase hmgène : 13 Exemple : La Méthde EMIT (Enzyme multiplied immunassay technique) : Principe : Il n y a pas de séparatin entre Ag et Ac. La fixatin de l enzyme sur sn ligand va mdifier sn activité en l activant u en l inhibant. Dans cet exemple : Lrsque l enzyme est liée à l Ag, elle est inactive. Il s agit d une méthde par cmpétitin : n ajute la mlécule à dser. On va alrs déplacer les mlécules qui prtent l enzyme. A chaque fis qu elles sernt libres, ces mlécules sernt activées. Il n y a pas besin de séparer Ag et Ac, il suffit de rajuter ds le milieu réactinnel un substrat spécifique de l enzyme. Le prduit de la réactin est mesuré par spectrphtmétrie (mesure de l absrbance). 4. Méthde d analyse des prtéines sériques : Réalisatin pratique : Séparatin des prtéines sériques u urinaires par électrphrèse sur gel (agarse, acrylamide) et de plus en plus par électrphrèse capillaire. Les prtéines sériques (albumine et glbulines) dnnent 5 u 6 fractins Albumine α1,α2,β1,(β2),γ glbulines En analyse curante, n s intéresse aux variatins des taux qui dnnent des infrmatins sur les rganes qui les synthétisent.

14 Σ hépatique: albumine, α1,α2,β1,(β2) Σ par lymphcytes B activés:γ 14 Ceci est un prfil électrphrétique. Un taux de variatin va demander des analyses supplémentaires pur btenir le type de pathlgie. On btient dans tus les cas un pic d albumine majeur, sit à drite sit à gauche seln la migratin. Par exemple, pur les γ glbulines : si n bserve une mdificatin, n va effectuer une étape d immuntypage qui fait appel à des Ac. Electrphrèse capillaire : Un capillaire, 2 électrdes, une surce de curant haut tensin, un détecteur et un appareil de récupératin et de traitement des dnnées. 2 slutins tampns. La migratin des analytes se met en place grâce à un champ électrique appliqué entre les 2 slutins tampns furni par le générateur haute tensin. Tus les ins, psitifs u négatifs snt attirés à travers le capillaire dans le même sens par le flux électrsmtique. Les analytes snt séparés pendant leur migratin du fait de leurs mbilités électrphrétiques différentes, et snt détectés à prximité de la srtie du capillaire. Le signal du détecteur est envyé à un appareil qui reçit et traite ces dnnées pur les faire apparaître sus la frme électrphrégramme (les cmpsés chimiques séparés apparaissent cmme des pics avec des temps de rétentin différents). Prtéines au ph physilgique chargées négativement. Le transprt des espèces à séparer, de mbilité µapp : - résulte de leur mbilité prpre µep (flux électrphrétique), fnctin de la charge et de la taille de l'espèce, - et de la mbilité du tampn µe, (flux électrsmtique), fnctin du ph et de l'électrlyte.

15 Intérêt : C est une micrtechnique (très peu d échantilln bilgique), autmatisée en milieu hspitalier, rapide, de haute réslutin, avec une très grande sensibilité de la détectin. La séparatin est rapide et fine : n btient un prfil électrphrétique. 15 L immunsustractin : Technique analytique permettant le typage d un pic mnclnal en électrphrèse capillaire. Prtcle: On ajute au sérum des anticrps fixés à des billes : anti- IgG, anti- IgM, anti- IgA,(chaînes lurdes), anti- κ, anti- λ (chaînes légères). Les cmplexes Ag- Ac précipitent et n réalise l électrphrèse capillaire sur le surnageant. On visualise alrs une disparitin de la fractin crrespndant à l anti- sérum utilisé (cad là ù la réactin était psitive). On bserve un pic anrmal des γ glbulines au niveau des IGM et des λ Cnclusin : Ce patient présente une γpathie IgM λ mnclnale. Parfis ce genre de technique n est pas suffisante pr le diagnstic. Il y a alrs une autre méthde dispnible : c est l immunfixatin. L immunfixatin : Prtcle : Séparatin des prtéines par électrphrèse dans un gel Principe : faire migrer le sérum à tester plusieurs fis (il faut autant de pistes que d Ac à utiliser dans la deuxième étape) Ac ajutés sur chaque piste de migratin Lavage pur éliminer les mlécules nn recnnues par les Ac Clratin des cmplexes Ag/Ac Applicatin : diagnstic de mnclnalité des immunglbulines

16 Exemple : 16 Incubatin avec des antisérums (anti- IgG, anti- IgM, anti- IgA, anti- κ, anti- λ) : il y a précipitatin des cmplexes Ag- Ac. Révélatin des cmplexes par un clrant. Là ù il y a une précipitatin abndante, n bserve une bande plus marquée : IgM et λ. Intérêt : méthde rapide (mins de 2h), qui ne nécessite pas un matériel particulier, avec une lecture facile. POINT Charline & PONCET Nellie