- Contrôle des connaissances : - Examen de fin d'année : QR courtes (problème transversal), 30 minutes, note sur 14; - Note ED sur 6

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1 10/02/2015 BUJON Solène L2 CR : CHABERT Julie BMCP Pr Autillo-Touati 12 pages Le cycle cellulaire Plan A. Le cycle cellulaire I. Le rôle du cycle cellulaire II. Contrôle du cycle cellulaire III. Rappel sur le cycle cellulaire B. Les points majeurs de contrôle du cycle cellulaire I. Le point de restriction R en G1 II. Mise en évidence expérimentale III. Méthode d'étude du cycle cellulaire C. Système de contrôle du cycle cellulaire I. Partenaires moléculaire II. Les cyclines III. Les CDK IV. Mode de fonctionnement des complexes CDK/cycline V. Régulation de l'activité des complexes Deuxième semestre : - 20 h de cours magistraux - 6 h de TP/ED : présence obligatoire - 3 ECTS 5 Système Européen de Transfert et Cumul des crédits) - Contrôle des connaissances : - Examen de fin d'année : QR courtes (problème transversal), 30 minutes, note sur 14; - Note ED sur 6 - ENT : plan et schémas du cours Problèmes résolus (annales, épreuves de 45 minutes) 1/12

2 A. Le cycle cellulaire I. Les rôles du cycle cellulaire - - Chez les Eucaryotes, il régule la croissance des cellules et leur nombre. Pour les organismes unicellulaires (levures), il régule les échanges et l'adaptation à l environnement. En revanche, pour les organismes pluricellulaires, il régule l équilibre entre les différentes populations cellulaires, ce qui permet de maintenir l'intégrité de l'organisme vivant, et cet équilibre est permis pas des facteurs intra et extra cellulaires. Le cycle cellulaire est donc fortement et finement régulé, et ceci est important pour la morphogenèse, le renouvellement des tissus (lié au vieillissement), la croissance physiologique et la réparation cellulaire (en cas de lésions). II. Contrôle du cycle cellulaire Le cycle cellulaire est finement régulé par l environnement cellulaire, grâce à des signaux prolifératifs (positifs) ou des signaux anti-prolifératifs (négatifs). Le système de contrôle, à différents niveaux, joue un rôle dans l avancée du cycle et dans l arrêt de celui-ci en cas d anomalie, notamment génétique, afin de ne pas la transmettre à la descendance (apoptose). Cela évite une prolifération anarchique des cellules, comme dans le cancer, qui correspond à une dysfonction du cycle au niveau de la croissance, de la différenciation et de la prolifération mais aussi de l'apoptose et de la sénescence. La cellule cancéreuse prolifère indéfiniment et est incapable de rentrer en apoptose ou en sénescence : elle acquiert en quelque sorte l'immortalité. - Leland HartWell est récompensé pour avoir la découverte d'une catégorie de gènes qui commandent le cycle cellulaire. L'un de ces gènes joue un rôle central dans le démarrage de chaque nouveau cycle, d'où son nom «start». Hartwell introduit également la notion de «points de contrôle» (checkpoints), conduisant à une approche novatrice du cycle cellulaire. - Paul Nurse a montré par des méthodes de gnétique et de biologie moléculaire l'un des facteurs clés de la régulation du cycle cellulaire, les kinases dépendantes des cyclines (CDK). Il a montré que la fonction des CDK s'est conservée tout au long de l'évolution. Les CDK activent le cycle cellulaire via des réactions de phosphorylation avec d'autres protéines. - Tim Hunt est récompensé pour la découverte des cyclines, les protéines qui régulent l'action des CDK. Il a mis en évidence leur dégradation au moment de la division cellulaire, mécanisme qui s'est avéré essentiel pour la régulation du cycle cellulaire. 2/12

3 III. Rappel sur la notion de cycle cellulaire En phase G1 : - La quantité d ADN est fixe. - La transcription et la traduction sont importantes. - Elle est obligatoire et de durée variable selon le type cellulaire (dont elle est caractéristique). - Elle peut conduire en phase G0. En Phase S : - La réplication de l ADN s effectue, sa quantité est doublée. - Il y a transcription et traduction des protéines nécessaires à la mitose. En phase G2 : - La quantité d ADN reste fixe. - Il existe une certaine transcription et traduction. En phase M : - Il s'agit de la phase de la division cellulaire. - La traduction des protéines est faible. En phase G0 : - C est un arrêt temporaire (cellule hépatique) ou définitif (neurone) du cycle. La cellule perd sa capacité à avancer dans le cycle, à se diviser. NB : Les cellules peuvent sortir de G0 et repasser en G1 grâce aux facteurs de croissance. Une phase G1 raccourcie permet des divisions plus rapides : c'est le cas des cellules cancéreuses. 3/12

4 B. Les points majeurs de contrôle du cycle cellulaire D'après cette figure, il peut exister un point d'arrêt au milieu de la phase G1, la séparant en deux parties à peu près identiques. Il s'agit du point R, et on parle de phase G1 pré- ou post-r. Il existe également des points de contrôle avant les phases S (G1/S) et M (G2/M). I. Le point de restriction R en G1 Pourquoi ce point R est-il important? Pour sortir de G0 ou avancer dans G1, les cellules filles doivent passer ce point, grâce à des facteurs de croissance (facteurs de l'environnement, extrinsèques). Ces signaux de prolifération qui interviennent par des voies de signalisation sont indispensables pour l'avancée du cycle à ce point R. La cellule a besoin d un signal positif de prolifération ; une fois ce point R dépassé la cellule n a plus besoin de facteurs de croissance pour évoluer, elle devient autonome. CR : Il est à noter que des facteurs de croissance peuvent être tout de même présents par la suite, mais ils ne sont plus indispensables pour l'avancée du cycle. Une cellule cancéreuse n a pas besoin de signal positif de prolifération, elle s en affranchit, elle peut produire ses propres signaux de croissance et se les adresser. Il faut bien faire la distinction entre le système de contrôle pour contrôler l avancée dans le cycle et la machinerie cellulaire (réplication, division cellulaire, ségrégation des chromosomes...). Le système de contrôle comporte un dispositif biochimique qui agit de façon cyclique formé d un ensemble de protéines interactives, et contrôlé par des freins qui peuvent arrêter le cycle au niveau des points de contrôle. Ces complexes sont les complexes cycline/cdk. 4/12

5 Le contrôle du cycle cellulaire est effectué par : les cyclines et les CDK: de la phase G1 ; de la transition G1/S et S ; de la phase M. mais également par l Anaphase-Promoting Complex (APC) qui est une ubiquitine-ligase intervenant au cours de la mitose. Le contrôle de qualité est représenté par deux formes différentes : Tout d'abord il existe des points de contrôle des dommages de l'adn, présents avant l'entrée en phase S (en G1), puis au cours de S et enfin après la réplication de l ADN (donc en G2). Par ailleurs, un point de contrôle du fuseau intervient au cours de la métaphase. La cellule possède des outils permettant de détecter les anomalies de l ADN et interrompre le cycle : la protéine p53, des kinases, que sont l'atm et l'atr (Ataxia Telangiectasia Mutated ou Related) et Chk1 et 2 (Checkpoint protein Kinase) et enfin le troisième outil est la protéine MAD (Mitose Arrest Deficient). La surveillance des dommages de l ADN se fait pendant tout le cycle cellulaire alors que la réplication de l ADN se fait au cours de la phase S. II. Mise en évidence expérimentale L'étude des œufs de crapaud Xénope a permis de comprendre le déroulement du cycle cellulaire et les points de contrôle. En effet, dans les premières phases on peut rapidement observer des divisions : les cellules ont un apport en énergie important (nutriments). Ces divisions ont ensuite été montrées chez l Homme. La mise en évidence du contrôle du cycle cellulaire consiste ici en des expériences de fusion entre deux cellules à des stades différents de leur cycle. Dans la première condition, on a fusionné une cellule en phase S (réplication de l'adn) avec une cellule en phase G1, ce qui forme un hétérocaryon. On observe alors que le noyau G1 entre en phase S : la cellule en S produit donc des facteurs induisant l'avancée en phase S. Dans la deuxième condition, l'hétérocaryon est formé de la fusion d'une cellule en S avec une cellule en G2 (ADN déjà répliqué). Dans ce cas, le noyau en G2 ne change pas de phase et le noyau en S poursuit son programme. Le facteur agissant en S n'a pas d'action sur les cellules en G2. Dans la troisième condition, on a fusionné une cellule en G1 avec une cellule en G2. Le noyau G2 est resté en G2 et le noyau en G1 a poursuivi son programme. 5/12

6 La conclusion de cette expérience est qu'il existe un facteur inducteur de la phase S qui est produit pendant celle-ci. Les cellules sont capables de contrôler l'enchaînement des réplications : il ne peut pas y avoir deux réplications ; la cellule doit être en G1 pour avancer en phase S. Ce facteur inducteur est le facteur SPF ; il permet de déclencher l entrée en phase S d'une cellule en G1 et disparaît en fin de phase S. Il n est pas présent en phase G2. Il n'existe pas d'inhibiteur en phase G2. SPF est en réalité une kinase qui, pour être active, doit être complexée à une cycline, produite de façon temporaire. Mais le SPF ne peut induire la réplication que dans des cellule compétente Les cellules en phase S sont capables d'induire in vitro la réplication à l'aide d'une kinase : CDC2. De plus, il existe un contrôle de l'achèvement de la réplication (check-point) : la mitose ne sera activée que lorsque l'adn sera entièrement répliqué. En résumé, il n' y a qu'une réplication par cycle cellulaire. La réplication est obligatoire pour l'entrée en mitose. Le SPF ne peut induire la réplication que dans les cellules compétentes (G1). Les cellules doivent passer par la mitose pour devenir compétentes. 6/12

7 On identifie un autre facteur : le facteur promoteur de la phase M MPF. La fusion d'une cellule en M et d'une autre en G1 accélère l'avancée du cycle du noyau G1. On observe une condensation des chromosomes et l'entrée en mitose des cellules, qu'elles soient en phase G1, S ou G2. MPF a été purifié à partir d'ovocytes de Xénope. Il est présent dans les cellules en phase M. Il s'agit là aussi d' un complexe CDK/cycline. Ce facteur est inactif en interphase et actif en mitose. Par approche biochimique, on a pu détecter l activité de ces facteurs (MPF et cycline) et l'on peut voir que leur activité se chevauche : les cyclines sont produites de façon cyclique, selon leur phase d'appartenance, et sont totalement dégradées après utilisation. Les cyclines A et B sont très présentes en mitose et diminuent dans l'interphase. La cycline du facteur promoteur S est bien différente de celle du facteur promoteur M. Les CDK ne sont pas produites de façon séquentielle comme leurs cyclines. Il faut bien retenir que ce qui est actif, c'est le complexe cycline/cdk. III. Méthode d'étude du cycle cellulaire Le BrdU (bromodéoxyuridine, analogue de l'uridine) est un marqueur des cellules en division. Celles-ci incorporent le BrdU fluorescent après injection : on peut ainsi visualiser ces cellules en mitose par fluorescence. Ceci permet notamment de déterminer le pourcentage de cellules en division. On utilise pour cela des souris wild-kind et des souris KO pour un gène induisant l'apoptose, sur lesquelles on fait un marquage au BrdU. La cytométrie de flux permet de "trier les cellules en fonction de leur contenu en ADN", c'est-à-dire déterminer le pourcentage de cellules dans les différentes phases du cycle cellulaire. On peut donc pa exemple évaluer les capacités de prolifération d'un tissu tumoral. Dans l'exemple on a : 5 à 10 % des cellules en phase S 10 à 20% en phase G2 70% en G1 Dans un tissu cancéreux, les pourcentages sont modifiés : il y a plus de cellules en M et en S, et moins en G1. 7/12

8 C. Système de contrôle du cycle cellulaire I. Les partenaires moléculaires Les partenaires moléculaires du contrôle du cycle cellulaire sont : Les cyclines Les Cdk : kinases dépendantes des cyclines Ces deux partenaires fonctionnent en complexe et sont régulés par d'autres protéines : CAK (Cdk-activatng kinase) et KAP (kinase interacting phosphatase) Wee 1 (kinase) et Cdc25 (phosphatase) II. Les cyclines Les cyclines sont produites de façon cyclique à différents moments du cycle. Elles sont synthétisées puis sont complexées aux CDK correspondantes pour ensuite être dégradées. Cette famille de molécule est souvent mutée dans les cancers. Les inhibiteurs du cycle cellulaire agissent sur les cyclines. Il existe des cyclines de la phase G1, de la transition G1/S, de la phase S et de la phase M. On distingue les cyclines mitotiques A ou B et les cyclines Start de la transition G1/S. Cependant toutes les cyclines possèdent un domaine «cycline box» conservé dans l'évolution. Les cyclines start ont en plus une séquence PEST qui permet une dégradation plus rapide. La régulation des cyclines se fait au niveau de leur synthèse, de leur dégradation et de leur localisation (nucléaire ou cytoplasmique). Par exemple : la cycline B est localisée dans le cytoplasme en hase G2 et passe dans le noyau juste avant la mitose pour devenir active. La cycline A quant à elle augmente progressivement en fin d'interphase et subit une dégradation brutale à la fin de la mitose. La synthèse de cycline B régule le cycle cellulaire. En effet, si l'on traite expérimentalement des cellules avec une ARNase (enzyme de dégradation des ARN), les ARNm des cyclines sont dégradés : il n'y a pas de production de cyclines mitotiques (notamment la cycline B) et les cellules sont arrêtées en interphase. Si l'on ajoute l'arn de la cycline B dans ces cellules, il y a reprise du cycle. De plus, si l'on traite des cellules normales avec des oligonucléotides ou par des ARN antisens sélectifs des ARNm des cyclines B, il y a arrêt du cycle en interphase. 8/12

9 Pour sortir de la mitose la cycline B doit être dégradée. On le démontre dans une expérience où les cellules sont exposées à la cycloheximide, inhibiteur de la synthèse protéique : en ajoutant de l'arnm de la cycline B, on observe une reprise du cycle cellulaire, la mitose, un pic de cycline B et une augmentation de l'activité du facteur MPF (CDK/cycline). Si l'on met un ARNm de cycline B mutée non hydrolysable, on voit que la cycline s'accumule et la cellule est bloquée en mitose. La dégradation de la cycline mitotique B est donc bien indispensable à la sortie de mitose. III. Les CDK Les CDK, pour être actives, doivent être complexées à leur cycline correspondante. Elle vont pouvoir alors exercer leur fonction de phosphorylation sur d'autres substrats. Régulation de l'entrée en mitose : Cdk1 La CDK1 (CDC2) va phosphoryler les lamines, protéines intermédiaires nucléaires qui sont propres à toutes les cellules possédant un noyau et qui permettent l'assemblage de l'enveloppe nucléaire. Leur phosphorylation permet le désassemblage. Le complexe CDK/cycline va également phosphoryler les protéines Rab 1 et Rab 4 qui sont impliquées dans la fusion vésiculaire des saccules du Golgi. En inhibant ces protéines il va y avoir des bourgeonnements du Golgi qui s'accumulent sous forme de vésicules ; cela donne l'aspect complètement fractionné de l'appareil de Golgi durant la mitose. Le complexe CDK/cycline va également jouer un rôle dans la dynamique des microtubules en modifiant leur longueur (très longs et dispersés en interphase, courts et dynamiques avec la cycline A/CDC2 en prophase, très courts et très dynamiques avec la cycline B/CDC2 en métaphase) afin d'organiser le fuseau mitotique indispensable à la division. Le complexe CDK/cycline va aussi phosphoryler certains facteurs d'amorce de la réplication et donc de l'entrée en phase S. Ségrégation des cellules filles : cytodiérèse Plus tardivement, les complexes CDK/cycline mitotiques phosphorylent les chaînes légères des myosines, induisant la formation et le resserrement d'un anneau contractile d'actine pour séparer le cytosol des cellules filles. Franchissement du point R Plus précocement, le complexe permet le franchissement du point R en phosphorylant une protéine frein du cycle cellulaire :PRB. Il s'agit d'une protéine à l'origine de rétinoblastomes chez l'enfant. Quand PRB est active, elle séquestre un facteur de régulation de la transcription (E2F) qui induit l'entrée en phase S. Le complexe CDK/cycline de la phase G1 précoce entraîne une phosphorylation de PRB, qui libère E2F et celui-ci va agir sur des transgènes nécessaires à l'entrée en phase S. Le franchissement du point R est donc bloqué par PRB. La détection de PRB est possible par Western blot avec un anticorps qui détecte la forme phosphorylée de PRB. On observe une augmentation de PRB phosphorylé dans les rétinoblastomes. 9/12

10 IV. Mode de fonctionnement des complexes CDK/cycline Le complexe CDK/cycline agit en phosphorylant des protéines cibles (substrats) par transfert d'un groupement phosphate de l'atp sur une thréonine ou une sérine du substrat. Toutes les CDK sont caractérisées par deux poches de fixation : l'une pour la protéine cible, l'autre pour l'atp. C'est la liaison à la cycline qui rend ces deux poches accessibles à l'atp et au substrat. Ex : cdk1/ cycline B Sur Cdk1 il existe 3 sites de phosphorylation importants à l'activation : thréonine 160, thréonine 14 et tyrosine 15. La liaison à la cycline B permet la phosphorylation de ces 3 sites.mais le complexe n'est pas encore actif. Pour l'activer il faut que des phosphatases déphosphorylent deux sites (thréonine 14 et tyrosine 15). Le complexe est donc actif seulement quand il est monophosphorylé (sur la thréonine 160) et la déphosphorylation de ce site permet la dissociation de la cycline, qui est alors rapidement dégradée. Il est important de retenir que ce qui active le complexe CDK1/cycline B est commun à tous les complexe CDK/Cycline et correspond à une déphosphorylation par CDC25 qui représente une famille ed phosphatases (qui interviennent à différents moments du cycle). Pendant les phases G1 et S il se constitue un pool de cyclines liées à CDK1, phosphorylée sur trois acides aminés (donc inactive) par deux kinases : la protéine Wee 1 (sur deux sites) et CAK (sur la thréonine 160). CAK est également un complexe CDK/cycline. Cdc 25 vient ensuite déphosphoryler les acides aminés précédemment phosphorylés par Wee1, ce qui active le complexe cycline B/CDK1. Cd25 active la progression du cycle cellulaire et est donc surexprimée dans certains cancers (lymphome, cancer du sein, poumon). 10/12

11 Rôle de cdc25 et Wee1 : CAK est une kinase activatrice du facteur MPF, et Wee1 est considérée comme une kinase inhibitrice de MPF. Cdc25 entraîne au contraire une déphosphorylation activatrice. Expérimentalement on peut obtenir des levures mutées où cdc25 est inhibée, les levures ne se divisent plus et la conséquence est une augmentation importante de leur taille. Quand on mute Wee1 la levure se divise de plus en plus, il en résulte donc une diminution de sa taille. Étapes de la régulation des CDK Liaison de la cycline (régulée par sa synthèse et dégradation) Phosphorylation activatrice de CAK pour la liaison au substrat Phosphorylation inhibitrice par Wee1 Déphosphorylation activatrice par les phosphatases CDC25 pour activer le complexe Déphosphorylation inhibitrice par la phosphatase KAP pour désactiver le complexe Inhibition par des protéines inhibitrices A chacune de ces étapes la qualité de l'adn est contrôlée et le déroulement du cycle est stoppé en cas d'anomalie. V. Régulation de l'activité des complexes Il existe des protéines inhibitrices des CDK appartenant à deux grandes familles Famille CIP/KIP Famille INK4 Les différents inhibiteurs sont sous la dépendance de p53 pour p21, mais aussi, pour p16 et p27, du TGF β (facter de croissance) qui active la production d'un inhibiteur du cycle. NB : Les facteurs de croissance n'ont donc pas toujours des actions positives, comme on l'a longtemps cru. Le TGF β est ici négatif, c'est donc une protéine "à double visage"... La famille INK4 (inhibitor of kinase 4) Elle agit sur les CDK4 qui interviennent en phase G1 exclusivement. Donc les facteurs de la famille INK4 sont inhibiteurs de la phase G1. ex : Les plus communs sont p16 et p15 qui empêchent la formation du complexe cycline D1/CDK 4 en se fixant à CDK4. Ce sont des inhibiteurs spécifiques de la phase G1. A partir du locus de p16, p19 ARF peut être produite : elle joue un rôle dans le processus de sénescence en agissant sur PRB. La famille CIP/KIP p21 et p27 agissent tout au long du cycle.elles inhibent mais ne dissocient pas le complexe cdk/cycline au contraire de p16 et p15. P21 et p 27 peuvent se lier à n'importe quel complexe. P21 peut également se lier au pcna ce qui déstabilise la réplication et arrête le cycle. En effet le pcna est un stabilisateur de l'adn polymérase dans la réplication. Il existe donc différents niveaux de régulation du cycle cellulaire. 11/12

12 Dédicace à Mathilde par ce que tu es juste au top! Je te dévoue à toi et ta douche toute ma gratitude et mon adoration!!!!! cœur cœur papillon à tout le monde et spéciale pensée toute particulière pour tous ces fous du BrCa! <3 CR : Vive le retour de la BMCP. Youpitralalapouêtpouêt. 12/12