METHODOLOGIE. Southern, Northern,, Western, PCR,Séquence.

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1 METHODOLOGIE Southern, Northern,, Western, PCR,Séquence.

2 Les grandes étapes * Transciptase Reverse : 1970 (Temin et Baltimore) * Enzymes de Restriction : 1970 (Smith et Nathan) * Vecteurs recombinants : 1972 Ligase (P. Berg) * Southern : 1975 * Séquences S : 1975 (Sanger - Maxam et Gilbert) * P.C.R : 1985 K. Mullis

3 2) Nomenclature : a) Espèce b) Genre c) Souche Eschérichia coli Ry13 ENZYMES DE RESTRICTION 1) Système de défense d de la bactérie * EcoRI (chiffre romain = 1er enzyme découvert) d * EcoRV (5ème enzyme découvert d pour cette espèce) Providencia stuarti * PstI 3) ENZYME DE RESTRICTION : enzymes de type II 4) Les séquences s reconnues sont palindromiques

4 1er Ex : Eco RI 5 G AATT C 3 3 CTTAA G G 3 - CTTAA AATTC 3 3 G 5 Séquence cohésive 5 «SORTANT» OU «PROTRUSIF» 2ème Ex : PstI 5 3 C TGCA G G ACGT C 5 - CTGCA 3 - G G 3 ACGTC 5 Séquence cohésive 3 «SORTANT» OU «PROTRUSIF»

5 3ème Ex : SmaI CCC GGG 5 CCC 3 5 GGG 3 GGG CCC 3 GGG 5 3 CCC 5 Séquence à «BOUTS FRANCS»

6 NB : ENZYMES A SITES COMPLEMENTAIRES Ex : 1-Sau3AI (Tétranucl tranucléotides) GATC CTAG CTAG GATC- G GATC C C CTAG G 2- Bam H1 (Hexanucléotides) NB : - ISOSCHIZOMERES - Enzymes sensibles à la méthylationm - G - CCTAG GATCC- G Ex : MspI et HpaII Insensible à la méthylation m C C G G G G C C Sensible à la méthylationm

7 «LE SOUTHERN BLOT» DNA * Traitement de l ADN * L électrophor lectrophorèse * Le transfert * Traitement de la membrane * Autoradiographie

8 1ère ETAPE - EXTRACTION - PURIFICATION LYSE PROTEINASE K PHENOL-CHLOROFORME PRECIPITATION ETHANOL PURETE? - FRAGMENTATION ENZYMES DE RESTRICTION 2ème ETAPE ELECTROPHORESE (Agarose) REVELATION (BET)

9

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11 3ème ETAPE TRAITEMENT DU GEL TRANSFERT * Alcalin * Salin 4ème ETAPE MARQUAGE DE LA SONDE * «NICK-TRANSLATION» * «RANDOM-PRIMING» PURIFICATION

12 Kb Etalonnage du gel ( papier semi-log log) cm Distance de migration

13 LE TRANSFERT POIDS PAPIER ABSORBANT MEMBRANE GEL APILLARITE SUPPORT TAMPON (NaCl)) ou (NaOH) PAPIER WATHMAN PLAQUE DE VERRE

14 LES SONDES

15 Le marquage des sondes

16 «Nick Translation» ADN

17 «Random priming» ADN

18 ARN Run-off transcription

19 Marquage par du γatp

20 L hybridation

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22 5ème ETAPE PREHYBRIDATION HYBRIDATION ( ( 16h) Macromolécules cules + DNA hétérologue h + sonde LAVAGE Stringence AUTORADIOGRAPHIE - AVANTAGES - INCONVENIENTS - APPLICATIONS

23 dépot Kb ,5 cm Distance de migration (cm) 16 cm Etalonnage du gel ( papier semi-log log)

24 «NORTHERN BLOT» RNA «WESTERN BLOT» PROTEINES

25 LE NORTHERN-BLOT LE RNA. (glyoxal, formaldéhyde, hydroxyméthyl de Hg)

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27 Le protocole Le contrôle BET 28 S 18 S

28 Northern blot du β β β carotène 15,15 dioxygenase (VitA) Poulet Souris contrôle (Actine)

29 LE NORTHERN BLOT : questions Qualité? Quantité? ANALYSE DE L EXPRESSION DES GENES * ARN : taille raisonnable : pas de restriction * ARN totaux ou polya + (mrna) * Séparation S en fonction de la taille * Destruction de structures II - glyoxal ou formaldéhyde - Hydroxyméthyle de mercure (toxique)! Rnases.

30 LE NORTHERN BLOT(suite) * Suite : traitement = SOUTHERN Informations : (avec une sonde) * Absence ou présence dans tissu analysé (tissu spécificit cificité) * A quels moments du développementd * Expression en fonction des conditions * Taille * Intermédiaires de maturation (anomalies) * Semi quantifiables * 1 ou plusieurs RNA d un d même gèneg - épissage différentiel - sites poly A différents - promoteurs différents

31 LE WESTERN-BLOT PROTEINES - Electrophorèse - Immuno-blot

32 QuickTime et un décompresseur Cinepak sont requis pour visionner cette image.

33 QuickTime et un décompresseur Sorenson Video sont requis pour visionner cette image.

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35 Informations * Absence ou présence dans tissu analysé (tissu spécificit cificité) * A quel moment du développementd * Expression en fonction des conditions * Taille (normale, tronquée..) * Semi quantifiable

36 LA «POLYMERASE CHAIN REACTION» LA P.C.R.

37 THE POLYMERASE CHAIN REACTION P.C.R (K.MULLIS 1985) INTRODUCTION : «Le Clonage Chimique» PRINCIPE CONDITIONS APPLICATIONS AVANTAGES ET INCONVENIENTS

38 er CYCLE Amplification Amplification 2 2 2ème CYCLE 20 CYCLES Amplification 2 20 (=10 6 )

39 QuickTime et un décompresseur Sorenson Video sont requis pour visionner cette image.

40 CINETIQUE D AMPLIFICATION Nbre de molécules «plateau» X=Xo Xo (1 + R) n X = nbre de molécules finales Xo = nbre de molécules intiales R = rendement de la réactionr n = nbre de cycle 30 Nbre de cycles

41

42 AVANTAGES - Simple - Sensible - Spécifique - Automatisable - Rapide INCONVENIENTS C O N T A M I N A T I O N S

43 LE SEQUENCAGE La réaction r de séquence s par terminateurs de chaîne. Méthode de Sanger

44 désoxyribonucléosideoside triphosphate 5 base 5 base P P P O CH 2 P P P O CH 2 3 OH H H Permet l extension du brin à l extrémité 3 C%: 100 : 1 didésoxyribonucl soxyribonucléosideoside triphosphate Empêche l extension l du brin à l extrémité 3

45 QuickTime et un décompresseur Animation sont requis pour visionner cette image.

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51 FIN de Méthodologie M I

52 Cas des homologies partielles

53 LES PARAMETRES CRITIQUES CHOIX DES AMORCES Contenu en GC Structure intramoléculaire Complémentarit mentarité entre amorces Quantité Taille TAMPON Type Cetus Type Biolabs Autres CONCENTRATIONS de Mg ++ : f (tampon)

54 LES PARAMETRES CRITIQUES (SUITE) LES TEMPERATURES : Dénaturation : Dépurination,, enzyme Hybridation : Tm des amorces Elongation : Spécificit cificité dntp ph Concentrations Taq POLYMERASE : Origine et quantités LES ADJUVANTS : DMSO Glycérol QUALITE DE LA MATRICE CONCLUSION : Mise au point préalable pour chaque séquence s à amplifier

55 SONDES INDIRECTES : * Sondes anonymes : - pas de séquence s répétéer - marqueur(s) génétique(s) g polymorphe(s) - intergénique nique (pas de séq.cod) ) : CARTOGRAPHIE * Sondes très s polymorphes - minisatellites : (11-17) 17) n - microsatellites : (CA) n - nanosatellites (A) n

56 Définition Sondes Directes Indirectes SONDES DIRECTES : Vecteurs double brins recombinés * cdna : Exons * DNA génomique g : Exons - Introns ou les 2 * Ribosondes : * Oligosondes de synthèse se : - criblage des banques - mutations ponctuelles (A.S.O.) - amorces d élongation * DNA exogènes : (bact,, virus, parasites)

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